Name: Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez le séquençage corrigé des erreurs pour détecter les mutations rares avec une sensibilité de 1 sur 10 000 en utilisant la chimie Illumina et les identifiants moléculaires uniques.

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Nous remercions les participants à l’étude de Oncology Group AAML1531 de l’enfance et de la Nurses' Health Study pour leurs contributions sous forme d’échantillons de patients. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health (UM1 CA186107, CA49449 RO1 et RO1 CA149445), Discovery Institute de Washington University l’enfance et hôpital (MC-II-2015-461) pour enfants de Saint-Louis et Eli Seth Matthews leucémie Fondation.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
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<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
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<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous démontrons une suite de protocoles de séquençage de l’erreur-corrigé pouvant être facilement mises en œuvre afin d’étudier les mutations avec VAFs faibles dans différentes maladies. Le facteur le plus important est l’incorporation de UMIs avec chaque molécule avant séquençage car ils permettent la correction d’erreurs des lectures brutes. Les méthodes décrites ici permettent aux chercheurs d’incorporer UMIs personnalisés aux panneaux de gène commercialement disponibles et individu-conçues oligos de gène-spécifique.
Protocole standard de NGS s’oppose à la détection des mutations avec VAF inférieure à 2 % en raison du taux d’erreur de séquençage, et cela limite l’application de NGS dans les études où la détection de variants rares est cruciale. En contournant le taux d’erreur standard de NGS, ECS permet la détection sensible de ces variantes brutes. Par exemple, détection de mutations pathogènes lorsque ces mutations surviennent tout d’abord (donc avoir VAF faible) est impérative d’informer l’intervention précoce de la maladie14,15. Dans la recherche sur la leucémie, la détection du résiduel minimal maladie (après le traitement des cellules leucémiques résiduelles) informe la stratification du risque et pourrait être utilisée pour informer des options de traitement de manière que les évaluations de cytométrie en flux binaire ne peut pas. En outre, ECS s’applique pour détecter des acides nucléiques tumorales circulantes et d’évaluer le potentiel métastatique chez les patients de tumeur solide en évaluant la présence/absence, ainsi la charge variant de certaines mutations qui sont caractéristiques du primaire 16de tumeur.
Comme le montre le tableau 1, le pouvoir d’utiliser le modèle d’erreur de position spécifique axée sur la distribution binomiale pour appeler les variantes dépend en grande partie le nombre de bibliothèques séquencés ainsi que la profondeur du séquençage utilisée pour construire le modèle de l’erreur. La robustesse du modèle erreur augmente avec le nombre plus élevé d’échantillons et plus en profondeur le séquençage. Il est recommandé d’utiliser au moins 10 échantillons séquencés avec une moyenne de correction erreur lecture couverture de 3000 x par exemple pour créer un profil d’erreur pour chaque échantillon. L’approche axée sur la position est similaire à MAGERI, mais au lieu d’utiliser un taux d’erreur global pour tous les six types différents de substitution (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, nous modélisons chaque substitution indépendamment à chaque position. Par exemple, un taux d’erreur de C > T à une position donnée génomique est différent d’un autre poste. Notre démarche tienne également compte un effet de lot de séquençage, comme le taux de substitution base observé en un seul passage de séquençage pourrait être différent d’une autre course. C’est pourquoi il est important de modéliser chaque poste pour tous les types de substitution, surtout quand les échantillons de séquençage différents cycles d’essai sont mis en commun pour construire le modèle.
Une considération importante lors de la conception d’une expérience de l’ECS est le seuil de détection souhaitée. La beauté des études NGS est qu’ils peuvent être facilement redimensionnées en ce qui concerne les gènes et les objectifs d’intérêt, seuil de détection (dépend de la profondeur de séquençage) et nombre de personnes interrogées. Par exemple, si les chercheurs s’intéressent à trouver des mutations rares dans deux amplicons avec un seuil de détection de 0,0001, ils peuvent mettre au maximum 75 échantillons en une séquence unique exécuté à l’aide de chimie MiSeq V2 qui génère jusqu'à 15 millions de lectures (2 amplicons * 10 000 molécules * 10 lit pour corriger des erreurs * 75 échantillons = 15 millions séquençage lectures). Les chercheurs peuvent varier le nombre de molécules d’entrer dans la séquence ou le nombre d’échantillons groupés en une séquence unique pour régler le seuil de détection. Dans nos études, nous avons cherché à trouver avec un seuil de détection des mutations de 0,0001 VAF (01:10, 000) en utilisant le panneau de gène Illumina. Nous utilisons systématiquement 250 ng de démarrage ADN pour s’assurer que les molécules suffisantes sont saisis afin d’atteindre le seuil de détection susmentionnés. Les chercheurs peuvent choisir de commencer par la plus faible quantité d’ADN (50 ng est recommandé) si la limite de détection souhaitée est > 0,001 VAF.
Comme les UMIs sont ajoutés sur les index d’i5, paramètres de séquencement doivent être modifiées en conséquence. Par exemple, nous avons utilisé 16 N UMIs et les réglages de séquençage étaient fin paires 2 x 144 lectures, 8 cycles d’Index 1 et 16 d’indice 2 au lieu de l’habituels 8 cycles d’Index 2. L’augmentation de l’indice 2 cycle est compensée par une diminution du nombre total de cycles alloués pour le lit. Si chercheurs choisissent d’utiliser 12N UMIs10,17, les paramètres doivent être changés en 12 cycles de Index 2.
Cette méthode de séquençage de l’UMI-basé est optimisée pour corriger les erreurs de séquençage. Il reste sous-optimal en traitant de jackpotting PCR, qui est un problème pour toute méthode basée sur l’amplification. Nous avons effectué des séances d’après séquençage et validation post-bio-informatique à l’aide de ddPCR, et nous peine détecter des faux positifs en raison de jackpotting PCR. Néanmoins, il est recommandé que les chercheurs mener les expériences à l’aide de haute-fidélité polymérase pour s’assurer que les erreurs de l’amplification basse.

Comme nous l’avons âge, l’exposition aux agents mutagènes et stochastiques erreurs pendant le résultat de la division cellulaire dans l’accumulation des aberrations somatiques dans le génome et cela sous-tend la pathogenèse fondamentale de la transformation maligne, maladies neuro-développementale, pédiatriques troubles et vieillissement normal1,2. Des mutations somatiques avec un potentiel de maladie au volant sont importants biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour la détection précoce et le risque de gestion3,4,5. Afin de mieux comprendre la clonogenesis physiologique, qui informera clinique et recherche de décisions, la quantification précise et la caractérisation de ces mutations est d’une importance primordiale. Séquençage de prochaine génération (NGS) sert actuellement à l’étude des mutations clonales dans des échantillons d’ADN hétérogènes ; NGS est toutefois limitée à l’identification de mutations au > 0,02 fraction allèle variant (VAF) — en raison du taux d’erreur inhérent de 0,5 à 2,0 % du séquençage plates-formes6,7,8. En conséquence, suivi diagnostique et points importantes variantes somatiques au VAF inférieur sont impossibles à l’aide de NGS standard.
Récemment, diverses méthodes ont été développées afin de contourner le taux d’erreur de NGS8,9,10,11. Ces méthodes utilisent le marquage moléculaire, qui permet la correction d’erreurs après le séquençage. Chaque molécule ou fragment génomique dans la bibliothèque de séquençage est étiquetée avec un aléatoire Unique moléculaire identificateur (UMI) qui est spécifique à cette molécule. Les UMIs sont construits par permutations d’une chaîne de nucléotides randomisés (N 8 – 16). Un deuxième code-barres échantillon spécifique est également intégré dans le flux de travail qui permet le multiplexage des échantillons multiples dans le séquençage de NGS même courir. L’amplification par PCR est effectuée sur la bibliothèque moléculairement étiquetée, et la bibliothèque est envoyée par la suite pour le séquençage. Au cours de la préparation de la bibliothèque, il est prévu qu’Erreurs seront introduits au hasard au fragment génomique au cours de l’amplification par PCR et séquençage8. Pour supprimer les erreurs de séquençage aléatoire, lectures de séquençage brutes sont regroupés selon l’UMI. Artefacts du séquençage ne devraient pas être présents dans toutes les lectures avec l’UMI même à la même position génomique en raison de la nature stochastique de l’introduction, alors qu’une vraie variante sera fidèlement amplifiée et séquencée dans toutes les lectures qui partagent le même UMI. Les artefacts sont bioinformatically supprimé. Nous décrivons ici trois méthodes de correction erreur séquençage (ECS) optimisé dans le laboratoire d’ADN identifier les variantes de nucléotide (SNVs) et petites insertion-délétions (Indels) et pour l’ARN faciliter la quantification de l’expression génique ci-dessous le Seuil d’erreur NGS.
La première méthode décrit une manière de chercher rare événement somatique en utilisant des amorces spécifiques de gène conçus par les chercheurs. Avant la préparation de la bibliothèque, chercheurs devraient concevoir des amorces pour cibler les fragments d’intérêt. Nous avons utilisé le Primer3 web-app (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplicons de 200 – 250 bp sont idéales pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR) que ceux-ci seront, une fois que UMIs ont été incorporés, générer chevauchement lectures bout jumelé avec 150 lectures jumelé-fin de bp. Les conditions de conception d’amorce optimale à utiliser sont : taille minimale de l’amorce : 19 ; Taille optimale de l’apprêt = 25 ; Taille maximale de l’apprêt = 30 ; Tm minimale = 64 ° C ; Tm optimale = 70 ° C ; Tm maximale = 74 ° C ; Différence maximale de Tm = 5 ° C ; Teneur minimale en GC = 45 ; Teneur maximale en GC = 80 ; Numéro pour renvoyer = 20 ; Fin stabilité maximale 3' = 100.
Dans la méthode 2, nous décrivons une méthode combinant le protocole ECS-ADN avec Illumina chimie pour enquête aux SNVs clonales et petit Indels aussi rare que 0,0001 VAF en utilisant des panneaux de gène commercialement disponibles qui incluent des centaines des amplicons. Nous avons utilisé le panneau de séquençage myéloïde de TruSight (Illumina) pour notre expérience et conçu un panel élargi afin d’inclure d’autres gènes d’intérêt pour les maladies pédiatriques myéloïdes. Ces panneaux ont offert pas les identificateurs moléculaires uniques (UMIs) qui faciliteraient la correction d’erreurs, nous avons ajouté notre propre stratégie d’adaptateur à ces panneaux. ECS devrait fonctionner aussi bien avec n’importe lequel des autres panneaux conçus pour enrichir des gènes associés à des maladies différentes. Après isolement d’ADN et quantification ultérieure des tissus ou échantillon d’intérêt, il est recommandé d’avoir au moins 500 ng de stock ADN par spécimen. Nous faisons régulièrement une bibliothèque unique de séquençage à l’aide de 250 ng d’ADN afin de capturer dans le fragment génomique unique autant que possible pour en aval lit la déduplication et calcul de VAF. Une bibliothèque de séquençage de répliquer en option peut être faite avec les 250 restants ng d’ADN. Nous faisons toujours deux bibliothèques répétées par spécimen, et nous ne considérons que ces événements détectés indépendamment dans les deux réplicats comme vrais positifs. Nous avons également mis en œuvre un modèle génomique erreur binomial de poste spécifique pour accroître la précision de la variante de l’appel4,13.
Enfin, nous décrivons une méthode de couplage ECS au séquençage de RNA pour la quantification de transcription en utilisant des panneaux de QIAseq ciblés RNA sur étagère (Qiagen). Les UMIs requis pour la déduplication et correction d’erreur ont été incorporés dans les kits de chercheurs peuvent faire suite aux recommandations du fabricant de bibliothèques. Bioinformatically, les chercheurs peuvent suivre le pipeline décrit pour l’ECS-ADN, qui est expliquée en détail dans la section protocole.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>Séquences adaptatrices UMI i5</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation</td><td>Module New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Huile de génération de gouttelettes pour EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Système de PCR numérique en gouttelettes</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Plaques à 96 puits</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartouches pour générateur de gouttelettes QX200/QX100</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Joints pour générateur de gouttelettes QX200/QX100</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Panel de séquençage myéloïde</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr> Bowtie 2 <tr><td>Panneau d’ARN ciblé QIAseq personnalisé par</td><td></td><td></td> l’Université Johns Hopkins Qiagen-Rneasy <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Plus Mini Kit (50)Qiagen 74134 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée adn et le séquençage de l’arn

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Techniques de séquençage de prochaine génération conventionnelle (NGS) ont permis d’immense caractérisation génomique pour plus d’une décennie. Plus précisément, NGS a été utilisé pour analyser le spectre de mutations clonales dans une tumeur maligne. Bien que beaucoup plus efficace que les méthodes traditionnelles de Sanger, NGS luttes avec l’identification des mutations clonales et subclonal rares en raison de son taux élevé d’erreurs de ~0.5–2.0 %. Ainsi, NGS standard a une limite de détection pour les mutations qui sont > 0,02 fraction allèle variant (VAF). Tandis que la signification clinique des mutations de ce rares chez les patients sans maladie connue ne sait pas, les patients traités pour une leucémie ont considérablement amélioré résultats lorsque la maladie résiduelle est < 0,0001 par cytométrie en flux. Afin d’atténuer ce contexte artéfact de NGS, plusieurs méthodes ont été développées. Nous décrivons ici une méthode pour l’erreur-corrigé ADN et ARN séquençage (ECS), qui implique le marquage des molécules individuelles avec un indice aléatoire de 16 bp pour correction d’erreur et un 8 index spécifique au patient de bp pour le multiplexage. Notre méthode peut détecter et suivre les mutations clonales allèle variant fractions (VAFs) deux ordres de grandeur inférieures à la limite de détection de la NGS et aussi rares que 0,0001 VAF.

Avec Targeted Error-Corrected, séquençage d’ADN, nous avons effectué une preuve d’expérience principe diluant mutant patient ADN dans l’ADN génomique commerciale. Le patient a subi une mutation dans GATA1 (chrX:48650264, C &gt; G) avec VAF original de 0,19. Nous avons démontré à la Figure 1 que ECS quantitative à un niveau de 1/10 000 pour la variante de nucléotide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Figure 1 : série de dilutions de SNV GATA1 démontrant que l’ECS est quantitative au niveau de 1/10 000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Nous montrons également que l’ADN de ECS détecte avec fiabilité rares mutations clonales dans les gènes de façon récurrente dans la leucémie myéloïde aiguë (AML) adulte en bonne santé personnes âgées4. Nous avons obtenu des échantillons de la couche leuco-plaquettaire de 20 personnes en bonne santé dans l’étude sur la santé de l’infirmière s’est incliné à peu près environ 10 ans d’intervalle. Nous avons appliqué le protocole du groupe ECS-ADN sur ces échantillons. Pour cette expérience, nous avons adapté les Illumina TruSight myéloïde séquençage panneau qui se compose des 568 amplicons (plus d’informations sur liste de gène sur https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) et séquencé 80 bibliothèques à partir de 20 personnes (2 collections à des moments différents, 2 répétitions par personne par heure point) en utilisant la plate-forme Illumina NextSeq, qui a généré une moyenne de 47,7 millions de lectures jumelé en bout et une moyenne de 3,4 millions erreur-corrigé séquences consensus par bibliothèque4. La couverture moyenne des nucléotides par bibliothèque était d’environ 6 000 x (3,4 millions divisées par 568). Pour chaque échantillon, nous avons construit un profil erreur position spécifique en utilisant les librairies séquencées qui ne sont pas du même échantillon. Nous avons trouvé 109 mutations somatiques clonales qui n’existaient pas dans les deux séries de point dans le temps au moins une collection. Ces mutations ont VAF allant de 0,0003 – 0.1451. Nous sélectionné 21 mutations avec représentations connues de cosmique et validé toutes les 21 mutations dans un ou deux temps point d’émergence à l’aide de ddPCR (n = 34, Figure 2, adapté du jeune al 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Figure 2 : Mutations identifiées par ECS ont été vérifiées par l’intermédiaire de ddPCR avec VAFs très concordantes. (n = 34, modifiée du jeune al 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
En ce qui concerne le niveau d’expression erreur corrigée à l’aide du protocole d’ECS-ARN, nous avons adapté un panel de gène à l’aide de la chimie de QIAseq qui se compose de 416 gènes connus pour être associés aux divers cancers (adaptés de QIAseq humain Cancer Transcriptome panneau) et nous amplifié l’exon plus couramment exprimé d’un gène donné (liste de gène dans 1 de matériel supplémentaire). Nous avons séquencé les bibliothèques avec plate-forme Illumina MiSeq au format jumelé-fin qui donne une moyenne de 8,3 millions de lectures par la bibliothèque, et nous avons réussi à capturer des séquences consensus erreur corrigée 0,417 millions en moyenne. Nous avons démontré que le niveau d’expression de transcription de faible abondance (&lt; comte de transcription de 1 000 à 50 ng d’ARN total) est hautement reproductible entre les répétitions (données point n = 300, Figure 3). Validation de ddPCR (six gènes sélectionnés de degré variable de l’expression) a démontré que le niveau d’expression de gènes avait été correctement capturé par le protocole ECS sans la nécessité d’une normalisation.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Figure 3 : haut, corrélation de transcription compte par ECS-ARN entre les répétitions d’un même échantillon (n = 300). Bas, transcription chefs identifiés par ECS ont été vérifiés par la ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Le séquençage de prochaine génération (NGS) est un outil puissant pour la caractérisation génomique qui est limité par le taux élevé d’erreurs de la plateforme (~0.5–2.0%). Nous décrivons nos méthodes de séquençage de l’erreur-corrigé qui nous permettent d’éviter le taux d’erreur NGS et détecter les mutations aux fractions d’allèle variant aussi rares que 0,0001.

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Cette méthode peut aider à répondre à certaines questions clés dans divers domaines de recherche, tels que la détection de clones précancéreux, l’évaluation pronostique des patients atteints de leucémie après un traitement et l’identification de mutations potentiellement pathogènes chez les donneurs de moelle osseuse. Je ferai la démonstration de cette procédure avec moi par Spencer, il est technicien dans le laboratoire. Cette vidéo décrit comment combiner le protocole de séquençage corrigé d’erreurs avec la chimie Illumina et les panels de gènes disponibles dans le commerce pour détecter les variants clonaux mononucléotidiques et les petits indels avec une sensibilité d’un sur 10 000.Pour intégrer les identifiants moléculaires uniques requis, les adaptateurs 16N i5 et i7 personnalisés utilisent la PCR. Tout d’abord, préparez le Q5 Master Mix, qui utilise une polymérase plus fidèle que l’alternative disponible dans le commerce. Ensuite, pour chaque réaction, combinez 37,5 microlitres de Q5 Master Mix, six microlitres de cinq adaptateurs micromolaires 16N i5, qui sont les identificateurs moléculaires uniques, et six microlitres d’adaptateurs i7.Si l’objectif est le multiplexage, utilisez différents adaptateurs i7 dans des échantillons distincts. Maintenant, exécutez la PCR en utilisant les paramètres suivants : trente secondes à 98 degrés Celsius, suivies de quatre à six cycles de dix secondes à 98 degrés Celsius, trente secondes à 66 degrés Celsius et trente secondes à 72 degrés Celsius. Terminez la réaction par une extension de deux minutes à 72 degrés Celsius et maintenez à quatre degrés Celsius.Ensuite, les deux cycles de PCR que vous devez effectuer sur eux dépendent très probablement de la taille du panel de gènes que vous utilisez, d’après notre expérience, une PCR à quatre cycles est suffisante si le panel de gènes comporte environ 1500 voies différentes d’oligos spécifiques aux gènes, tandis qu’un panel avec environ cinq à 600 paires d’oligos nécessite environ six cycles de PCR. Ensuite, nettoyez les réactions de PCR à l’aide de billes magnétiques, ajoutez 56,25 microlitres de solution de billes magnétiques dans chaque produit PCR de 75 microlitres, puis transférez chaque réaction dans un tube séparé de 1,5 millilitre à faible liaison, mélangé par pipetage de haut en bas au moins dix fois, et attendez cinq minutes. Ensuite, transférez les mélanges dans un support magnétique et laissez les surnageants s’éclaircir pendant deux minutes.Ensuite, retirez et jetez les surnageants. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 70 %, attendez trente secondes, puis retirez l’éthanol. Répétez cette étape de lavage à l’éthanol une fois, puis laissez les billes sécher à l’air libre pendant cinq minutes.Enfin, éluez les bibliothèques modifiées des billes dans vingt microlitres d’eau doublement distillée. Ensuite, placez les tubes sur une grille magnétique pour séparer les billes magnétiques de l’éluant. Tout d’abord, effectuez des dilutions en série de dix fois des banques ECS par rapport à l’étape précédente, jusqu’à une partie pour 1 000 dans les bandelettes PCR.Ensuite, préparez un Master Mix dans un tube de 1,5 millilitre. Pour chaque réaction, combinez 10 microlitres de ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitre d’amorce P5, 0,2 microlitre d’amorce P7 et 4,6 microlitres d’eau double distillée. Ensuite, placez 15 microlitres d’EvaGreen Master Mix dans un nouvel ensemble de tubes, et enfin ajoutez cinq microlitres de un à 1 000 produit nettoyé ECS au Master Mix.Ensuite, fabriquez des gouttelettes PCR à l’aide du générateur de gouttelettes. Tout d’abord, chargez la cassette, pipetez 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes dans le puits de la cassette, l’huile étiquetée, et pipetez 20 microlitres du mélange réactionnel ddPCR dans l’échantillon bien étiqueté. Ensuite, couvrez la cassette avec un joint en caoutchouc et chargez-la dans le générateur de gouttelettes, et toute la génération de gouttelettes continuera.Maintenant, à l’aide d’une pipette multicanaux, chargez lentement, pendant cinq secondes, 45 microlitres de gouttelettes prélevées dans chaque puits de cassette, sur une nouvelle plaque PCR. Ensuite, scellez la plaque PCR avec une feuille d’aluminium. Maintenant, amplifiez le signal dans les gouttelettes en utilisant les conditions suivantes : cinq minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 40 cycles de trente secondes à 95 degrés Celsius, et d’une minute à 63 degrés Celsius, puis, refroidissez la réaction à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avant de l’élever à 90 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis en se maintenant à quatre degrés Celsius.Ensuite, préparez la machine de lecture de gouttelettes de modèle ddPCR. Sélectionnez les paramètres de quantification absolue et l’utilisation du QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Ensuite, exécutez les réactions dans le lecteur de gouttelettes.Une fois l’analyse ddPCR terminée, appliquez les mêmes seuils de division à chaque échantillon. Ensuite, normalisez chaque bibliothèque au nombre de molécules souhaité. Commencez par effectuer des réactions de 50 microlitres, composées de 25 microlitres de Q5 Master Mix, deux microlitres d’une amorce micromolaire P5, deux microlitres d’une amorce micromolaire P7 et 21 microlitres de bibliothèque d’ADN normalisé.Ensuite, exécutez la PCR en utilisant les paramètres suivants :30 secondes à 98 degrés Celsius, suivies de 16 cycles de 10 secondes à 98 degrés Celsius, trente secondes à 66 degrés Celsius et trente secondes à 72 degrés Celsius, puis deux minutes à 72 degrés Celsius et maintenez à quatre degrés Celsius. Ensuite, quantifiez la concentration d’ADN dans les banques et regroupez les banques en quantités molaires égales pour le séquençage, ciblez environ quatre nanomolaires. Maintenant, séquencez la bibliothèque ECS regroupée à l’aide de la plate-forme de séquençage Illumina, avec les paramètres de séquençage suivants : deux fois 144 lectures d’extrémité appariées, huit cycles d’index un et 16 cycles d’index deux.L’ADN d’un patient porteur d’une mutation dans GATA1 a été dilué dans de l’ADN génomique commercial à la VAF d’origine de 0,19. En utilisant le protocole décrit, l’ECS s’est avéré quantitatif à un niveau de un à 10 000 pour la variante mononucléotidique. Ensuite, des échantillons de couche leucocytaire de vingt individus en bonne santé ont été analysés à l’aide d’un panel de séquençage commercial composé de 568 amplicons.En résumé, 109 mutations somatiques clonales étaient présentes dans les deux réplicats d’au moins un point temporel de collecte avec des fractions d’allèles variants allant de 0,0003 à 0,1451.21 des mutations avec des représentations cosmiques connues ont été sélectionnées et chacune a été validée par PCR numérique par gouttelettes. Pour démontrer le niveau d’expression corrigé des erreurs du protocole, un panel de gènes personnalisé composé de 415 gènes connus pour être associés à divers cancers a été utilisé pour produire une bibliothèque construite à partir de l’exon le plus couramment exprimé de chaque gène. Le niveau d’expression du transcrit de faible abondance était hautement reproductible entre les répétitions.La PCR numérique en gouttelettes a ensuite été utilisée pour valider six gènes sélectionnés dont l’expression variait. Une comparaison montre que le niveau d’expression des gènes a été correctement capturé par le protocole ECS, sans qu’il soit nécessaire de normaliser. Une fois que vous avez maîtrisé la technique, cette technique peut être réalisée confortablement en un jour et demi.La majeure partie du temps sera consacrée à l’incubation, et la manipulation manuelle occupe environ 30 à 40 % du temps total requis, en fonction du nombre d’échantillons que les chercheurs traitent en même temps. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de disposer d’une bibliothèque de séquençage répliquée pour le même échantillon. Cela vous donnera plus de confiance dans le fait qu’une mutation de basse fréquence est vraiment positive si la mutation elle-même est indépendamment centrale dans les deux réplications.À la suite de cette procédure, d’autres questions telles que l’ARN ECS pourraient être effectuées afin de répondre à des questions telles que la détection d’un transcrit de faible abondance ou d’un transcrit de fusion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs principalement dans le domaine des hémopathies malignes, et nous utilisons cette technique pour explorer des clones pré-leucémiques chez des individus en bonne santé ainsi que pour détecter une maladie résiduelle minime chez les patients atteints de leucémie en rémission.

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