Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Cette méthode peut aider à répondre à certaines questions clés dans divers domaines de recherche, tels que la détection de clones précancéreux, l’évaluation pronostique des patients atteints de leucémie après un traitement et l’identification de mutations potentiellement pathogènes chez les donneurs de moelle osseuse. Je ferai la démonstration de cette procédure avec moi par Spencer, il est technicien dans le laboratoire. Cette vidéo décrit comment combiner le protocole de séquençage corrigé d’erreurs avec la chimie Illumina et les panels de gènes disponibles dans le commerce pour détecter les variants clonaux mononucléotidiques et les petits indels avec une sensibilité d’un sur 10 000.

Pour intégrer les identifiants moléculaires uniques requis, les adaptateurs 16N i5 et i7 personnalisés utilisent la PCR. Tout d’abord, préparez le Q5 Master Mix, qui utilise une polymérase plus fidèle que l’alternative disponible dans le commerce. Ensuite, pour chaque réaction, combinez 37,5 microlitres de Q5 Master Mix, six microlitres de cinq adaptateurs micromolaires 16N i5, qui sont les identificateurs moléculaires uniques, et six microlitres d’adaptateurs i7.

Si l’objectif est le multiplexage, utilisez différents adaptateurs i7 dans des échantillons distincts. Maintenant, exécutez la PCR en utilisant les paramètres suivants : trente secondes à 98 degrés Celsius, suivies de quatre à six cycles de dix secondes à 98 degrés Celsius, trente secondes à 66 degrés Celsius et trente secondes à 72 degrés Celsius. Terminez la réaction par une extension de deux minutes à 72 degrés Celsius et maintenez à quatre degrés Celsius.

Ensuite, les deux cycles de PCR que vous devez effectuer sur eux dépendent très probablement de la taille du panel de gènes que vous utilisez, d’après notre expérience, une PCR à quatre cycles est suffisante si le panel de gènes comporte environ 1500 voies différentes d’oligos spécifiques aux gènes, tandis qu’un panel avec environ cinq à 600 paires d’oligos nécessite environ six cycles de PCR. Ensuite, nettoyez les réactions de PCR à l’aide de billes magnétiques, ajoutez 56,25 microlitres de solution de billes magnétiques dans chaque produit PCR de 75 microlitres, puis transférez chaque réaction dans un tube séparé de 1,5 millilitre à faible liaison, mélangé par pipetage de haut en bas au moins dix fois, et attendez cinq minutes. Ensuite, transférez les mélanges dans un support magnétique et laissez les surnageants s’éclaircir pendant deux minutes.

Ensuite, retirez et jetez les surnageants. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 70 %, attendez trente secondes, puis retirez l’éthanol. Répétez cette étape de lavage à l’éthanol une fois, puis laissez les billes sécher à l’air libre pendant cinq minutes.

Enfin, éluez les bibliothèques modifiées des billes dans vingt microlitres d’eau doublement distillée. Ensuite, placez les tubes sur une grille magnétique pour séparer les billes magnétiques de l’éluant. Tout d’abord, effectuez des dilutions en série de dix fois des banques ECS par rapport à l’étape précédente, jusqu’à une partie pour 1 000 dans les bandelettes PCR.

Ensuite, préparez un Master Mix dans un tube de 1,5 millilitre. Pour chaque réaction, combinez 10 microlitres de ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitre d’amorce P5, 0,2 microlitre d’amorce P7 et 4,6 microlitres d’eau double distillée. Ensuite, placez 15 microlitres d’EvaGreen Master Mix dans un nouvel ensemble de tubes, et enfin ajoutez cinq microlitres de un à 1 000 produit nettoyé ECS au Master Mix.

Ensuite, fabriquez des gouttelettes PCR à l’aide du générateur de gouttelettes. Tout d’abord, chargez la cassette, pipetez 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes dans le puits de la cassette, l’huile étiquetée, et pipetez 20 microlitres du mélange réactionnel ddPCR dans l’échantillon bien étiqueté. Ensuite, couvrez la cassette avec un joint en caoutchouc et chargez-la dans le générateur de gouttelettes, et toute la génération de gouttelettes continuera.

Maintenant, à l’aide d’une pipette multicanaux, chargez lentement, pendant cinq secondes, 45 microlitres de gouttelettes prélevées dans chaque puits de cassette, sur une nouvelle plaque PCR. Ensuite, scellez la plaque PCR avec une feuille d’aluminium. Maintenant, amplifiez le signal dans les gouttelettes en utilisant les conditions suivantes : cinq minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 40 cycles de trente secondes à 95 degrés Celsius, et d’une minute à 63 degrés Celsius, puis, refroidissez la réaction à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avant de l’élever à 90 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis en se maintenant à quatre degrés Celsius.

Ensuite, préparez la machine de lecture de gouttelettes de modèle ddPCR. Sélectionnez les paramètres de quantification absolue et l’utilisation du QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Ensuite, exécutez les réactions dans le lecteur de gouttelettes.

Une fois l’analyse ddPCR terminée, appliquez les mêmes seuils de division à chaque échantillon. Ensuite, normalisez chaque bibliothèque au nombre de molécules souhaité. Commencez par effectuer des réactions de 50 microlitres, composées de 25 microlitres de Q5 Master Mix, deux microlitres d’une amorce micromolaire P5, deux microlitres d’une amorce micromolaire P7 et 21 microlitres de bibliothèque d’ADN normalisé.

Ensuite, exécutez la PCR en utilisant les paramètres suivants :30 secondes à 98 degrés Celsius, suivies de 16 cycles de 10 secondes à 98 degrés Celsius, trente secondes à 66 degrés Celsius et trente secondes à 72 degrés Celsius, puis deux minutes à 72 degrés Celsius et maintenez à quatre degrés Celsius. Ensuite, quantifiez la concentration d’ADN dans les banques et regroupez les banques en quantités molaires égales pour le séquençage, ciblez environ quatre nanomolaires. Maintenant, séquencez la bibliothèque ECS regroupée à l’aide de la plate-forme de séquençage Illumina, avec les paramètres de séquençage suivants : deux fois 144 lectures d’extrémité appariées, huit cycles d’index un et 16 cycles d’index deux.

L’ADN d’un patient porteur d’une mutation dans GATA1 a été dilué dans de l’ADN génomique commercial à la VAF d’origine de 0,19. En utilisant le protocole décrit, l’ECS s’est avéré quantitatif à un niveau de un à 10 000 pour la variante mononucléotidique. Ensuite, des échantillons de couche leucocytaire de vingt individus en bonne santé ont été analysés à l’aide d’un panel de séquençage commercial composé de 568 amplicons.

En résumé, 109 mutations somatiques clonales étaient présentes dans les deux réplicats d’au moins un point temporel de collecte avec des fractions d’allèles variants allant de 0,0003 à 0,1451.21 des mutations avec des représentations cosmiques connues ont été sélectionnées et chacune a été validée par PCR numérique par gouttelettes. Pour démontrer le niveau d’expression corrigé des erreurs du protocole, un panel de gènes personnalisé composé de 415 gènes connus pour être associés à divers cancers a été utilisé pour produire une bibliothèque construite à partir de l’exon le plus couramment exprimé de chaque gène. Le niveau d’expression du transcrit de faible abondance était hautement reproductible entre les répétitions.

La PCR numérique en gouttelettes a ensuite été utilisée pour valider six gènes sélectionnés dont l’expression variait. Une comparaison montre que le niveau d’expression des gènes a été correctement capturé par le protocole ECS, sans qu’il soit nécessaire de normaliser. Une fois que vous avez maîtrisé la technique, cette technique peut être réalisée confortablement en un jour et demi.

La majeure partie du temps sera consacrée à l’incubation, et la manipulation manuelle occupe environ 30 à 40 % du temps total requis, en fonction du nombre d’échantillons que les chercheurs traitent en même temps. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de disposer d’une bibliothèque de séquençage répliquée pour le même échantillon. Cela vous donnera plus de confiance dans le fait qu’une mutation de basse fréquence est vraiment positive si la mutation elle-même est indépendamment centrale dans les deux réplications.

À la suite de cette procédure, d’autres questions telles que l’ARN ECS pourraient être effectuées afin de répondre à des questions telles que la détection d’un transcrit de faible abondance ou d’un transcrit de fusion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs principalement dans le domaine des hémopathies malignes, et nous utilisons cette technique pour explorer des clones pré-leucémiques chez des individus en bonne santé ainsi que pour détecter une maladie résiduelle minime chez les patients atteints de leucémie en rémission.