Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des vésicules extracellulaires à partir du milieu de Schistosoma japonicum adulte cultivé in vitro. Cette méthode permet d’isoler efficacement l’EV dans un milieu de culture in vitro à partir de Schistosoma japonicum adulte. Le principal avantage de cette technique est de pouvoir isoler efficacement la vésicule extracellulaire à partir d’un milieu de culture in vitro à court terme, ce qui peut minimiser le stress pouvant entraîner une sécrétion non physiologique de VE.

La démonstration sera faite par Juntao Liu, un technicien de mon laboratoire. Collectez les parasites dans un bécher de 500 millilitres et lavez-les soigneusement mais doucement trois fois avec 200 millilitres de PBS chaud. Gardez les lavages brefs et utilisez la sédimentation par gravité pour séparer les parasites.

Ensuite, sur des plats de 90 millimètres, dressez environ 200 paires de vers par plat. Dans le plat, lavez les parasites deux fois de plus en utilisant la sédimentation par gravité. Pour ces lavages, utilisez un support RPMI chaud complété par pen-strep.

Remplacez le deuxième lavage par 40 millilitres de milieu sans antibiotiques. Ensuite, cultivez les parasites à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après deux heures, transférez le milieu des plaques dans des tubes à centrifuger, puis accumulez les œufs et les débris de vers à 2 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, récupérez et transférez le surnageant dans un tube frais. Ensuite, filtrez le surnageant à travers un filtre de seringue de 0,22 micron et collectez la solution filtrée dans un sac de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons. Ensuite, dialysez la solution à l’aide d’une solution à 8 % PEG8000 à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Cette étape est importante pour augmenter le rendement des vésicules extracellulaires. Le lendemain, transférez la solution dialysée dans un nouveau tube et ajoutez 0,5 volume de réactif d’isolement d’exosome total. Mélangez la solution jusqu’à ce qu’elle soit homogène et incubez à environ cinq degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain matin, centrifugez le mélange à 15 000 g pendant une heure à environ cinq degrés Celsius. Ensuite, aspirez et jetez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille de VE dans deux millilitres de PBS. La pastille ne sera probablement pas visible.

Pour l’analyse par transfert Western, déterminez d’abord la concentration en protéines de l’échantillon, comme avec le test BCA. Ensuite, préparez 10 à 20 microgrammes de VE dans 22,5 microlitres de tampon RIPA. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de tampon de chargement 4X et chauffez le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après le traitement thermique, séparez les protéines des vésicules extracellulaires sur un gel SDS-PAGE à 12 %. Après avoir fait fonctionner le gel, les protéines sont transférées dans une membrane PVDF. Sondez la membrane avec des anticorps anti-CD63 à une dilution de un à 1 000.

Ensuite, traitez la membrane avec des IgG-HRP anti-lapin à une dilution de un à 5 000. Maintenant, utilisez un réactif de détection ECL pour développer la membrane, puis effectuez une analyse sur un système d’imagerie par chimiluminescence. Commencez par transférer cinq microgrammes d’échantillon dans un tube à ultracentrifuger en polypropylène et ajustez le volume à 12 millilitres avec le milieu RPMI-1640.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 110 000 g pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le surnageant. Ensuite, préparez une suspension de vésicule extracellulaire 2X en ajoutant un millilitre de diluant C à la pastille.

Remettez la pastille en suspension avec un pipetage doux. Maintenant, préparez une solution fraîche de colorant 2X. Ajoutez deux microlitres de colorant éthanolique PKH67 à un millilitre de diluant C dans un tube à microfuge, et mélangez bien.

Ensuite, colorez l’échantillon en mélangeant les deux solutions et en incubant le mélange à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, arrêtez la coloration en ajoutant quatre millilitres de FBS et attendez une minute de plus. Ensuite, ajoutez le milieu RPMI-1640 pour ajuster le volume à 12 millilitres, et tournez la suspension pour isoler les vésicules tachées.

Retirez et jetez le surnageant. Ensuite, remettez en suspension les VE marqués PKH67 en granulés dans 12 millilitres de milieu RPMI-1640. Ensuite, répétez la centrifugation, mais cette fois récupérez les vésicules dans un millilitre de PBS.

Pour l’essai d’absorption, préparer des cultures de cellules de mammifères pendant la nuit dans des plaques à six puits. Le lendemain matin, ajoutez cinq microgrammes de vésicules marquées à PKH67 dans chaque puits et poursuivez la culture pendant deux à quatre heures. Après l’incubation, retirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS deux fois.

Ensuite, fixez les cellules pendant 15 minutes, lavez-les deux fois avec du PBS et colorez-les avec du DAPI avant l’imagerie. Des schistosomes au stade hépatique ont été prélevés sur des lapins 28 jours après l’infection. Des vésicules extracellulaires ont ensuite été prélevées sur les vers schistosomes et analysées.

La taille de leurs particules, déterminée par l’analyse des nanoparticules de Malvern, variait entre 100 et 400 nanomètres, la majeure partie de la population mesurant près de 220 nanomètres. La microscopie électronique à transmission a révélé que les vésicules extracellulaires étaient rondes et avaient un diamètre compris entre 100 et 200 nanomètres. L’analyse par western blot a indiqué que les vésicules extracellulaires isolées étaient reconnues à l’aide d’anticorps CD63, qui est un marqueur typique des vésicules extracellulaires.

La microscopie à fluorescence des vésicules extracellulaires marquées par PKH67 et internalisées par les cellules du clone NCTC 1469 a montré que les vésicules extracellulaires étaient principalement distribuées dans le cytoplasme des cellules réceptrices. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’EV dans un milieu de culture in vitro à partir de Schistosoma japonicum adulte.