Name: Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez l'isolation des vésicules extracellulaires de Schistosoma japonicum adultes en culture in vitro. Cette méthode minimise le stress parasitaire pour une sécrétion physiologique optimale.

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Cette étude a été, en partie ou en totalité, soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31472187 et 31672550) et The Agricultural Science et Technology Innovation Program de l’Académie chinoise des Sciences agricoles.

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité d’éthique local de l’Institut de recherche vétérinaire de Shanghai, Académie chinoise des Sciences agricoles (numéro de permis : SHVRIAU-14-0101).
1. la Culture in Vitro des Schistosomes
Remarque : Schistosomes représentent un danger biologique. Travailleurs devraient porter des gants en latex à tous les temps quelle manipulation vers, des suspensions faites ou autres associés biomatériaux. Lapins de Nouvelle-Zélande abritaient des cercaires ~ 2 000 via abdominale exposition. Schistosomes au stade hépatique ont été recueillis de lapins infectés par S. japonicum cercaires à 28 jours après l’infection par la perfusion du foie et les veines mésentériques. Les procédures de collecte de ver ont été référencés dans des publications antérieures, rapports d’études chez la souris18.
<ol><li>Recueillir les parasites dans un bécher de 500 mL. Laver soigneusement et doucement 3 x 200 ml de réchauffé (37 ° C) PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Séparer les paires de ver ~ 200 pour chaque boîte de Pétri 90 mm. Puis laver les parasites soigneusement et doucement 2 x avec 50 mL de réchauffé RPMI 1640 milieu de culture contenant 100 U de pénicilline et de 100 mg/mL de streptomycine (37 ° C).</li>
	<li>Maintenir les parasites dans 40 mL de milieu de culture RPMI 1640 préchauffé sans antibiotiques à 37 ° C, moins de 5 % de CO2 à une densité de ver ~ 5 paires/ml pendant 2 h à 90 mm Petri dish. Notes : Le milieu RPMI 1640 ne doit pas contenir sérum, sinon des vésicules extracellulaires exogène seront mis en place.</li>
</ol>2. pré-traité Condition Media
<ol><li>Récupérer le milieu de culture et puis centrifuger le milieu à 4 ° C à 2 000 × g pendant 30 min retirer les œufs et les débris tegmentale à vis sans fin.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube et puis filtrer la solution à l’aide d’une seringue-filtre de 0,22 µm.</li>
	<li>Recueillir la solution filtrée dans un sac dialysée (seuil de poids moléculaire : 3.5kD) et puis dialyser la solution en utilisant la solution 8 % PEG8000 à 4 ° C durant la nuit. Notes : Cette étape est importante pour enrichir SjEVs pour augmenter le rendement d’isolement SjEVs.</li>
</ol>3. isolement de SjEVs
<ol><li>Transférer la solution dialysée dans un nouveau tube et puis ajouter 0,5 volumes du réactif exosome total isolement.</li>
	<li>Mélanger la solution bien de Vortex ou de pipetage de haut en bas afin de garantir l’homogénéité de la solution.</li>
	<li>Incuber le mélange à 2 ° C à 8 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Centrifuger le mélange à 15 000 × g pendant 1 h à 2 ° C à 8 ° C.</li>
	<li>Aspirer et éliminer le surnageant. Notes : SVE figurent dans le culot en bas du tube (non visible dans la plupart des cas).</li>
	<li>Resuspendre le culot d’EVs dans 2 mL de PBS et ensuite stocker la solution EVs à-80 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.</li>
</ol>4. caractérisation des EVs Western Blot
<ol><li>Déterminer la concentration de protéines de l’échantillon de SjEVs, par exemple, par dosage de la BCA.</li>
	<li>Préparer 10 à 20 µg d’EVs à 22,5 µL de tampon de RIPA. Puis ajouter 7,5 µL de 4 x chargement de tampon et la chaleur pendant 5 min à 95 ° C.</li>
	<li>Séparer des protéines SjEVs par 12 % sur gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Transférer les protéines de membrane de PVDF et puis sonde avec anticorps anti-CD63 (1:1, 000 dilution), suivis en sondant avec anti-lapin IgG-HRP (1:5, 000 de dilution).</li>
	<li>Utiliser le réactif de détection ECL pour le développement de la membrane et détecter les signaux par une système d’imagerie de la chimiluminescence.</li>
</ol>5. caractérisation des EVs par microscopie électronique à Transmission
<ol><li>Ajouter 2 µL de SjEVs isolé à 200 mesh enduit formvar grilles et puis laissez-les sécher à température ambiante.</li>
	<li>Tache avec 2 % d’acide phosphotungstique pendant 1 min et puis laissez-les sécher à température ambiante.</li>
	<li>Charger les grilles sur le porte-échantillon du microscope électronique à transmission et exposé à un faisceau d’électrons 80 kV pour la capture d’image.</li>
</ol>6. SjEVs Label avec PKH67 et analyse de l’absorption de cellules
Notes : Toutes les étapes subséquentes ont été effectuées à température ambiante (20-25 ° C), sauf indication contraire.
<ol><li>Transférer 5 µg SjEVs solution dans un tube en polypropylène à fond conique et régler le volume à 12 mL par adjonction de ce milieu RPMI 1640.</li>
	<li>Centrifuger le SjEVs à 110 000 × g pendant 90 min à 4 ° C pour SjEVs à pellets.</li>
	<li>Après centrifugation, soigneusement aspirer le surnageant. Remarque : Le colorant dans l’éthanol de PKH67 ne doit pas être ajouté directement au culot chadhouli, comme cela se traduirait par une coloration hétérogène et la viabilité cellulaire réduite.</li>
	<li>Préparer une solution de Suspension EV 2 x en ajoutant 1 mL de diluant C au culot chadhouli ; pour assurer la dispersion totale, resuspendre avec douceur de pipetage.</li>
	<li>Juste avant la coloration en diluant C, préparer une douce 2 x Solution de colorant en ajoutant 2 µL de la solution éthanolique de colorant de PKH67 à 1 mL de diluant C dans un tube à centrifuger en polypropylène et en mélangeant bien pour disperser.</li>
	<li>Rapidement ajouter le 1 mL x 2 EV Suspension (étape 6.4) à 1 mL de 2 x Solution de colorant (étape 6.5) et immédiatement mélanger l’échantillon de pipetage.</li>
	<li>Incuber le mélange à température ambiante pendant 4 min.</li>
	<li>Arrêter la coloration en ajoutant 4 mL de FBS et puis incuber pendant 1 min.</li>
	<li>Ajouter RPMI1640 moyen pour régler le volume à 12 mL et puis centrifuger à 110 000 × g à 4 ° C pendant 90 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant et ajouter RPMI1640 moyen pour remettre en suspension les PKH67 étiqueté chadhouli granulés.</li>
	<li>Centrifuger à 110 000 × g à 4 ° C pendant 90 min laver une fois puis ajouter PBS pour remettre en suspension les granules de SjEVs.</li>
</ol>7. analyse de l’absorption de cellules SjEVs
<ol><li>Cellules de mammifères de graines comme le NCTC cloner 1469 cellules ou cellules HEK293T en plaques 6 puits (2 × 105 cellules / puits) et culture les cellules pendant la nuit.</li>
	<li>Ajouter 5 µg SjEVs PKH67 marqué et ensuite la culture des cellules à 37 ° C pendant 2 à 4 h.</li>
	<li>Après incubation, enlever le milieu et laver les cellules avec du PBS.</li>
	<li>Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 15 minutes et laver deux fois plus avec du PBS.</li>
	<li>Tacher les noyaux des cellules au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).</li>
	<li>Observer les cellules à l’aide de la microscopie de fluorescence.</li>
</ol>

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<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
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<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
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<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des études récentes sur les EVs ont démontré que schistosome Qu'evs jouent un rôle important dans host-pathogen interactions3,9,12,16. Afin de répondre leurs fonctions de régulation, il est essentiel d’isoler le SVE de schistosomes. Nous décrivons ici une autre méthode d’isolement chadhouli. Cette méthode génère une taille de large gamme de SjEVs, de 100 nm à 400 nm, en adulte S. japonicum<...

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont une population de petites vésicules membranaires encapsulé avec diverses protéines, lipides et acides nucléiques. Des études récentes ont démontré que EVs jouent un rôle crucial dans la communication de cellule-cellule et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus physiologiques, y compris le développement cellulaire, régulation immunitaire, angiogenèse et cell migration2, 3,4,5. Accumulation de preuves indique que EVs, diffuser les exosomes et leur cargaison de miRNA représentent des biomarqueurs potentiels de certaines maladies6.
Plusieurs des protozoaires tels que Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziet Leishmania spp., auraient dû être divulgués pour pouvoir sécréter EVs ; helminthes ont en outre été découverts à sécréter des EVs en vie accueille7. EVs parasitaires ont démontré d’être impliqués dans le maintien de l’infection, pathogénicité8et9de la régulation immunitaire. Récentes études sur les schistosomes deux Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 et S. japonicum12 ont indiqué que les schistosomes adultes sécrètent exosome-comme des vésicules qui peuvent être impliqués dans la réglementation fonctionnelle des processus biologiques spécifiques.
A ce jour, plusieurs méthodes ont été utilisées pour isoler des vésicules extracellulaires, telles que l’ultracentrifugation, ultrafiltration13, l’utilisation de réactifs à base de polymère, chromatographie d’exclusion et l’isolement d’immuno-affinité. Ces différentes méthodes possèdent leurs propres avantages et limitations14. En règle générale, ultracentrifugation est considérée comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de la vésicule. Toutefois, cette méthode souffre de la limitation de potentiel EV agrégation14.
Dans schistosomes, deux méthodes ont été signalés pour l’isolement de l’EV : il s’agit d’ultracentrifugation11,12,10 et l’utilisation commerciale EV isolation kit16 pour plusieurs stades (œufs,16, schistosomula11, schistosomes adultes10,12,,17). Étant donné que microvésicules sont d’une large gamme de taille de quelques nanomètres de cent à mille nanomètres, nous avons développé une méthode alternative qui associe l’utilisation d’un kit d’isolation commercial EV pour isoler le SVE de centrifugeuse de paillasse et ultrafiltration adultes de Schistosoma japonicum. Le SVE isolé en général possède un diamètre de 100 à 400 nm et ont été avec succès internalisé par les cellules réceptrices.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif d’isolement total des exosomes (à partir de milieux de culture cellulaire)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>Pour isoler les vésicules extracellulaires de S. japonicum</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Pour l’étiquetage Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>Pour la culture de parasites</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,22&mu ; m filtre pour seringue</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Tube de dialyse</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&trade ; Immobilon & commerce ; Substrat HRP chimiluminescent occidental (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 anticorps</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Acide phosphotungstique</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC clone 1469 cellules</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg ; CCL-9.1 et commerce ;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Système d’imagerie par chimioluminescance</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à transmission</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q eau Milli-Q</td><td></td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Incubateur d’ultracentrifugeuses</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules membranaires libérés par une variété de cellules dans le microenvironnement extracellulaire. Véhicules électriques représentent une population de vésicules hétérogènes, dont calibre compris entre 40 et 1 000 nm. Données accumulées ont indiqué que EVs jouent un rôle réglementaire important dans les interactions hôte-pathogène. Une compréhension profonde du schistosome SVE doit donner un aperçu les mécanismes qui sous-tendent les interactions de schistosomes-hôte, permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies de lutte contre la schistosomiase. Ici, nous visons à étudier davantage les fonctions EVs dans schistosomes en présentant un protocole pour l’isolement et la caractérisation des véhicules électriques du adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs ont été isolées in vitro milieu de culture par centrifugation, combinée avec un kit d’isolation exosome commerciale. L' isolé S. japonicum EVs (SjEVs) généralement posséder un diamètre de 100 à 400 nm et sont caractérisées par la microscopie électronique à transmission et transfert Western. L’utilisation de PKH67 dye-labeled SjEVs a démontré que les SjEVs sont internalisés par les cellules réceptrices. Dans l’ensemble, notre protocole fournit une méthode alternative pour isoler l’EVs de schistosomes adultes ; la SjEVs isolée peut être adapté à l’analyse fonctionnelle.

Afin de quantifier le rendement de SjEVs isolé en utilisant le protocole décrit, nous avons utilisé dosage protéique BCA pour accéder le taux protéique de la SjEVs isolée de schistosomes adultes de 28 jours. Comme indiqué dans le tableau 1, la concentration de protéine chadhouli variait entre 208 µg et 250 µg / 100 mL de milieu (tableau 1). La taille des particules, tel que déterminé par analyse de nanoparticules de Malvern, a indiqué que le SjEVs isolés ...

Nous présentons ici un protocole visant à décrire l’isolement vésicules extracellulaires (EVs) en milieu de cultivés in vitro des adultes Schistosoma japonicum.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des vésicules extracellulaires à partir du milieu de Schistosoma japonicum adulte cultivé in vitro. Cette méthode permet d’isoler efficacement l’EV dans un milieu de culture in vitro à partir de Schistosoma japonicum adulte. Le principal avantage de cette technique est de pouvoir isoler efficacement la vésicule extracellulaire à partir d’un milieu de culture in vitro à court terme, ce qui peut minimiser le stress pouvant entraîner une sécrétion non physiologique de VE.La démonstration sera faite par Juntao Liu, un technicien de mon laboratoire. Collectez les parasites dans un bécher de 500 millilitres et lavez-les soigneusement mais doucement trois fois avec 200 millilitres de PBS chaud. Gardez les lavages brefs et utilisez la sédimentation par gravité pour séparer les parasites.Ensuite, sur des plats de 90 millimètres, dressez environ 200 paires de vers par plat. Dans le plat, lavez les parasites deux fois de plus en utilisant la sédimentation par gravité. Pour ces lavages, utilisez un support RPMI chaud complété par pen-strep.Remplacez le deuxième lavage par 40 millilitres de milieu sans antibiotiques. Ensuite, cultivez les parasites à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après deux heures, transférez le milieu des plaques dans des tubes à centrifuger, puis accumulez les œufs et les débris de vers à 2 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, récupérez et transférez le surnageant dans un tube frais. Ensuite, filtrez le surnageant à travers un filtre de seringue de 0,22 micron et collectez la solution filtrée dans un sac de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons. Ensuite, dialysez la solution à l’aide d’une solution à 8 % PEG8000 à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Cette étape est importante pour augmenter le rendement des vésicules extracellulaires. Le lendemain, transférez la solution dialysée dans un nouveau tube et ajoutez 0,5 volume de réactif d’isolement d’exosome total. Mélangez la solution jusqu’à ce qu’elle soit homogène et incubez à environ cinq degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain matin, centrifugez le mélange à 15 000 g pendant une heure à environ cinq degrés Celsius. Ensuite, aspirez et jetez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille de VE dans deux millilitres de PBS. La pastille ne sera probablement pas visible.Pour l’analyse par transfert Western, déterminez d’abord la concentration en protéines de l’échantillon, comme avec le test BCA. Ensuite, préparez 10 à 20 microgrammes de VE dans 22,5 microlitres de tampon RIPA. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de tampon de chargement 4X et chauffez le mélange à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Après le traitement thermique, séparez les protéines des vésicules extracellulaires sur un gel SDS-PAGE à 12 %. Après avoir fait fonctionner le gel, les protéines sont transférées dans une membrane PVDF. Sondez la membrane avec des anticorps anti-CD63 à une dilution de un à 1 000.Ensuite, traitez la membrane avec des IgG-HRP anti-lapin à une dilution de un à 5 000. Maintenant, utilisez un réactif de détection ECL pour développer la membrane, puis effectuez une analyse sur un système d’imagerie par chimiluminescence. Commencez par transférer cinq microgrammes d’échantillon dans un tube à ultracentrifuger en polypropylène et ajustez le volume à 12 millilitres avec le milieu RPMI-1640.Ensuite, centrifugez l’échantillon à 110 000 g pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le surnageant. Ensuite, préparez une suspension de vésicule extracellulaire 2X en ajoutant un millilitre de diluant C à la pastille.Remettez la pastille en suspension avec un pipetage doux. Maintenant, préparez une solution fraîche de colorant 2X. Ajoutez deux microlitres de colorant éthanolique PKH67 à un millilitre de diluant C dans un tube à microfuge, et mélangez bien.Ensuite, colorez l’échantillon en mélangeant les deux solutions et en incubant le mélange à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, arrêtez la coloration en ajoutant quatre millilitres de FBS et attendez une minute de plus. Ensuite, ajoutez le milieu RPMI-1640 pour ajuster le volume à 12 millilitres, et tournez la suspension pour isoler les vésicules tachées.Retirez et jetez le surnageant. Ensuite, remettez en suspension les VE marqués PKH67 en granulés dans 12 millilitres de milieu RPMI-1640. Ensuite, répétez la centrifugation, mais cette fois récupérez les vésicules dans un millilitre de PBS.Pour l’essai d’absorption, préparer des cultures de cellules de mammifères pendant la nuit dans des plaques à six puits. Le lendemain matin, ajoutez cinq microgrammes de vésicules marquées à PKH67 dans chaque puits et poursuivez la culture pendant deux à quatre heures. Après l’incubation, retirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS deux fois.Ensuite, fixez les cellules pendant 15 minutes, lavez-les deux fois avec du PBS et colorez-les avec du DAPI avant l’imagerie. Des schistosomes au stade hépatique ont été prélevés sur des lapins 28 jours après l’infection. Des vésicules extracellulaires ont ensuite été prélevées sur les vers schistosomes et analysées.La taille de leurs particules, déterminée par l’analyse des nanoparticules de Malvern, variait entre 100 et 400 nanomètres, la majeure partie de la population mesurant près de 220 nanomètres. La microscopie électronique à transmission a révélé que les vésicules extracellulaires étaient rondes et avaient un diamètre compris entre 100 et 200 nanomètres. L’analyse par western blot a indiqué que les vésicules extracellulaires isolées étaient reconnues à l’aide d’anticorps CD63, qui est un marqueur typique des vésicules extracellulaires.La microscopie à fluorescence des vésicules extracellulaires marquées par PKH67 et internalisées par les cellules du clone NCTC 1469 a montré que les vésicules extracellulaires étaient principalement distribuées dans le cytoplasme des cellules réceptrices. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’EV dans un milieu de culture in vitro à partir de Schistosoma japonicum adulte.

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JoVE Journal

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Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

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