Name: Desthiobiotin-streptavidine-affinité médiée par la Purification des protéines interagissant avec l’ARN dans les cellules de mésothéliome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Découvrez la purification de protéines liant l'ARN dans les cellules de mésothéliome par affinité desthiobiotine-streptavidine. Cette méthode permet d'identifier les protéines cytosoliques se liant à des séquences d'ARN spécifiques.

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Ce travail a été soutenu par l’octroi de Swiss National Science Foundation Sinergia CRSII3 147697, la Stiftung für Angewandte Krebsforschung et Zürich Krebsliga.

1. préparation de la Fraction des protéines cytosoliques et nucléaires
<ol><li>Plaque 4 x 106 ACC-méso-4 cellules dans un flacon de culture cellulaire T150 cultivées en milieu RPMI - 1640 milieu additionné de 10 % FBS, 1 x pénicilline/streptomycine (x 100) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM). Quand les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % (~5-5.5 x 106 cellules), procéder à l’extraction de la protéine de fraction nucléaire et cytosolique. NOTE : Lignée cellulaire ACC-méso-4 a été obtenue du RIKEN BioResource Centre11.</li>
	<li>Aspirer le moyen, laver les cellules en ajoutant 15 mL de PBS 1 x, inclinez la plaque doucement plusieurs fois et aspirer la solution de PBS 1 x. Ajouter 3 mL de 0,25 % trypsine-EDTA et incuber le flacon de culture à 37 ° C pendant 3 min. NOTE : Regardez les cellules au microscope pour le détachement ; Si encore attaché robinet le ballon contre la paume de la main 3 fois.</li>
	<li>Ajouter 7 mL du milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FBS, 1 x pénicilline/streptomycine (x 100) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM), recueillir les cellules dans un tube de 15 mL et tournez en bas à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez le milieu Resuspendre le culot cellulaire avec 1,5 mL de la solution 1 PBS x, puis transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Tournez en bas à x 500 g et 4 ° C pendant 5 min. jeter le surnageant. Remarque : A partir de cette étape, exécutez toutes les étapes de centrifugation à 4 ° C et conserver tous les réactifs sur la glace.</li>
	<li>Resuspendre le culot cellulaire avec glacé 1,5 mL de la solution 1 PBS x et centrifuger les cellules à 500 x g et 4 ° C pendant 3 min. éliminer le surnageant. Remarque : Les montants requis de CER I, CER II et réactifs de TNS sont 10, 0,55 et 5 volumes de culot estimé emballé volume, respectivement ; le protocole suivant suppose un volume de 20 µL. Nous vous recommandons de préparer uniquement la quantité nécessaire de réactif CER j’ai.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de réactif d’extraction cytoplasmique glacee (CER j’ai) additionné de 2 µL de 1 x inhibiteur de protéinase, par exemple, diluer 1 comprimé d’inhibiteur de la protéase (exempt d’EDTA) dans 500 µL d’eau pour obtenir 100 actions de x. Cette quantité de réactif CER j’ai suffit à lyser 20 µL d’un culot cellulaire volume emballé.<ol>
<li>Pour estimer le volume de granulés conditionnés cellulaire, comparer le tube contenant le culot cellulaire avec un tube de 1,5 mL rempli de 10, 20, 50 ou 100 µL de PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendre le culot cellulaire vigoureusement Vortexer le tube pendant 15 s et incuber le tube sur la glace pour 10 min. Ajouter 11 µL de réactif d’extraction cytoplasmique glacee II (CER II) sur le tube, vigoureusement Vortexer pendant 5 s et incuber pendant 1 min sur la glace.</li>
	<li>Vortex vigoureusement pendant 5 s et centrifuger le tube à 16 000 x g et 4 ° C pendant 5 min. transférer le liquide surnageant dans le tube propre préalablement réfrigéré sur la glace. Le surnageant est la fraction cytoplasmique qui est encore utilisé dans l’expérience de RNA-menu déroulant.</li>
	<li>Resuspendre le culot restant dans 100 µL de réactif d’extraction nucléaire glacee (TNS) additionné de 1 µL d’inhibiteur de protéinase (x 100) et vigoureusement Vortexer pendant 15 s. Nous vous recommandons de préparer uniquement la quantité nécessaire de réactif NER additionné d’inhibiteurs de la protéase.</li>
	<li>Incuber l’échantillon sur la glace pendant 40 min avec agitation occasionnelle pendant 15 s (toutes les 10 min).</li>
	<li>Centrifuger le tube à 16 000 x g pendant 10 min. transfert le surnageant (c’est la fraction des protéines nucléaires) dans un tube propre préalablement réfrigéré.</li>
	<li>Procéder immédiatement en mesurant la concentration de protéines à l’aide de la méthode bicinchoninic (BCA) (voir la Table des matières). Pour contrôler la pureté de la protéine de chaque fraction, effectuer l’immunotransfert (Figure 1) contre le α-tubuline (détection positive uniquement dans le cytosol) et Poly ADP-ribose polymérase - PARP (détection positive seulement dans la fraction nucléaire). Pour visualisation de protéines, reportez-vous à la section 4.</li>
	<li>Afin de maintenir l’activité de la protéine et leur état natif, préparer 25 µL des aliquotes d’extraits cytosoliques et nucléaires. Clin d’oeil-gel ces portions en les plaçant dans l’azote liquide pendant 5 s et stocker directement à-80 ° C.</li>
</ol>2. marquage de l’ARN avec Desthiobiotin
<ol><li>Sondes d’ARN synthétisé commercialement et HPLC purifiée. Remettre en suspension avec une eau exempte de nucléase à 10 µM. Remarque : La sonde séquences sont répertoriés dans le tableau 1.</li>
	<li>Utilisez 50 pmol d’ARN par réaction de RNA-menu déroulant. Décongeler et garder tous les réactifs sur glace sauf pour PEG 30 %, utilisé à l’extrémité 3' étiquette de RNA oligo.</li>
	<li>Transférer 5 µL de 10 sondes d’ARN µM, étiqueté comme CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) et non relié-RNA (IRE), dans 0,5 mL mince-mur microcentrifugeuse les tubes et les incuber dans une machine PCR à 85 ° C pendant 5 min. Placer les tubes immédiatement sur la glace. Remarque : Cette étape est importante, car elle favorise la relaxation et l’accessibilité de la sonde d’ARN pour l’étiquetage.</li>
	<li>Pour une seule réaction 30 µL, ajouter dans le tube contenant du RNA Lange 10µl suivant : 3 µL d’eau libre nucléase, 3 µL de 10 x RNA Ligase tampon de réaction, 1 µL d’inhibiteur de RNase (40 U/µL), 1 µL Desthiobiotinylated Cytidine diphosphate (1 mM) et 2 µL de ligase d’ARN T4 (20 U/µL). Remarque : Pour préparer master mix A 3 échantillons en excès (3.2), mélanger 9,6 µL de nucléase eau libre, 9,6 µL de 10 x RNA Ligase tampon de réaction, 3,2 µL d’inhibiteur de RNase (40 U/µL), 3,2 µL Desthiobiotinylated Cytidine diphosphate (1 mM) et 6,4 µL de ligase d’ARN T4 (20 U/µL).</li>
	<li>Ajouter avec précaution 15 µL de PEG 30 % à la réaction. Utilisez une autre astuce pour mélanger la réaction. Incubez la réaction du jour au lendemain à 16 ° C.</li>
	<li>Le lendemain, préparer ce qui suit : 5 M de NaCl (frais/exempte de nucléase), chloroforme : alcool isoamylique 24:1 ratio (p. ex., par réaction - 96 µL chloroforme et 4 µL d’alcool isoamylique), glacé 100 % éthanol et glacée éthanol à 70 %.</li>
	<li>Ajouter 70 µL d’eau exempte de nucléase aux tubes de réaction RNA-étiquetage. Ajouter 100 µL de chloroforme : isoamylique alcool et vortex brièvement. Spin down à 13 000 x g pour 3 min. Retirer avec précaution seulement la phase supérieure et le transfert dans un nouveau tube sans nucléase 1,5 mL ; Évitez de toucher la phase inférieure.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de 5 M NaCl, 1 µL de glycogène et 300 µL d’éthanol glacé de 100 %. Placer le tube à-20 ° C pendant 2 h. NOTE : À cette étape, l’expérience peut se poursuivre le lendemain.</li>
	<li>Centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 15 min. soigneusement éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot. Ajouter 300 µL d’éthanol à 70 % glacée et centrifuger à nouveau à 13 000 x g et 4 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant complètement et sécher le culot (15 min). Resuspendre le culot dans 20 µL d’eau exempte de nucléase. Remarque : Passez avec RNA-menu déroulant sur le même jour.</li>
	<li>Incuber l’ARN à 90 ° C pendant 2 min et le placer sur la glace. Placez l’ARN marqué sur la glace lors de l’étape suivante du prélavage des streptavidine des billes magnétiques. NOTE : Un temps d’incubation plus longs peut endommager la sonde d’ARN.</li>
</ol>3. ARN-protéine Pulldown
<ol><li>
Prélavage streptavidine – magnétiques et incubation avec desthiobiotin-ARN
	<ol>
<li>Utilisez 50 µL de streptavidine billes magnétiques par 50 pmol RNA. Toutefois, cela doit être optimisée en fonction de l’expérience.</li>
		<li>Vortex le tube avec billes streptavidine-magnétiques pour 15 s et rapidement retirer 200 µL (mélange maître ; assez pour des réactions de 3 + 1) dans un coffre fort-serrure tube propre de 1,5 mL à l’aide coupe les pointes de pipette. Placer le tube sur un support magnétique, afin que les perles s’accumulent sur le côté du tube et attendent 1 min. Retirer le liquide de la remise en suspension.</li>
		<li>Laver les perles, retirer le tube du support magnétique, ajouter 400 µL de 0,1 M NaOH 0,05 M NaCl solution et doucement pipette monter et descendre plusieurs fois. Placer le tube sur le support magnétique. Attendre 1 min et recueillir le surnageant. Répéter cette étape.</li>
		<li>Laver les billes avec 200 µL de 100 mM NaCl. Retirez le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de 20 mM Tris (pH 7.5), remettre les billes en suspension en pipettant également, placer le tube sur le support magnétique, attendre 1 min et retirer le surnageant. Répétez l’étape.</li>
		<li>Enlever le tube du support magnétique, ajouter 200 µL de 1 x tampon de Capture de l’ARN et resuspendre streptavidine billes magnétiques au vortex brièvement. Enlever 50 µL de billes magnétiques de streptavidine et ajouter dans chaque tube d’ARN étiquetés à l’aide d’un coupe de pipette. Incuber les tubes pendant 30 min à température ambiante sur un rouleau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liaison de la protéine à l’ARN
	<ol>
<li>Placer les tubes dans un support magnétique, attendre 1 min et retirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de 20 mM Tris (pH 7.5) aux talons et remettre en suspension par pipetage. Placer les tubes dans un support magnétique, attendre 1 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de 1 x tampon de liaison protéine-ARN aux talons et remettre en suspension par pipetage.</li>
		<li>Pendant ce temps, préparer le mélange suivant : 10 µL de 10 x tampon de liaison protéine-ARN, 30 µL de glycérol à 50 %, 50 µg de protéines cytoplasmiques et exempte de nucléase jusqu'à 100 µL d’eau. NOTE : Préparer le mélange maître B 3 échantillons en excès (3.3) comme suit : 33 µL de 10 x tampon de liaison protéine-ARN, 99 µL de 50 % de glycérol, 165 µg de protéines cytoplasmiques et eau exempte de nucléase jusqu'à 330 µL. maintenir le tube de mélange maître B en glace.</li>
		<li>Placer les tubes dans le support magnétique, attendre 1 min et recueillir le surnageant. Ajouter 100 µL du mélange maître B, remettre en suspension par pipetage doucement verticalement et éviter de créer des bulles. Incuber les tubes de réaction pendant 60 min à 4 ° C sur un rouleau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavage et élution
	<ol>
<li>Placer les tubes dans un support magnétique, recueillir le surnageant (qui ne circule dans - FT) et transférer dans un nouveau tube. Remarque : Gardez ce FT sur la glace pour une analyse ultérieure.</li>
		<li>Distribuer 100 µL de 1 x tampon de lavage sur les perles, resuspendre doucement, remettre dans le support magnétique, attendre 1 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape 2 fois.</li>
		<li>Ajouter 40 µL de tampon d’élution à billes magnétiques, mixer par pipetage de haut en bas et incuber à 37 ° C dans un agitateur de tube (950 tr/min) pendant 30 min.</li>
		<li>Placer les tubes dans un support magnétique, attendre 1 min et recueillir des échantillons éluées (c'est-à-dire l’éluat - E). Posez sur la glace et pour l’analyse en aval. NOTE : À cette étape, chaque sonde ARN testé se compose d’un intermédiaire (pi) et échantillon de l’éluat (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse de tache occidentale et sur polyacrylamide
NOTE : Voir le tableau 2 pour les recettes pour les tampons utilisés dans cette section. Effectuer un Western blot selon la méthode de Laemmli12.
<ol><li>Handcast 12 % gel SDS-PAGE (10-puits, entretoise de 1,5 mm, 66 µL). Préparer un mélange de gel en cours d’exécution : 4 mL de solution mère de 30 % d’acrylamide-bisacrylamide, 2,4 mL de Tris inférieur buffer, 3,2 mL de dH2O, 9,6 µL de TEMED, 96 µL de solution de persulfate d’ammonium 10 % (APS). Préparer le mélange de gel d’empilement : 3,25 mL de dH2O, 0,5 mL de 30 % d’acrylamide - solution-mère de bisacrylamide, 1,3 mL de tampon Tris supérieure, 10 µL de TEMED, 20 µL de 10 % APS.</li>
	<li>Ajouter 16,6 µL de tampon de x Laemmli 6 (par exemple, 14 mL de Tris/HCl/SDS pH 6,8 (tampon Tris supérieure), 2 g de SDS, 1,86 g de TNT, 6 mL de glycérol et 0,012 % bromophénol bleu ; conservé à-20 ° C) dans l’échantillon FT et 6,6 µL de tampon de x Laemmli 6 dans l’échantillon E. Incuber les échantillons pendant 5 min à 95 ° C.</li>
	<li>Charger les échantillons (20 µL de FT et son ensemble éluer ~ 40 µL) et de les exécuter pendant 30 min à 60 V, continuant avec 20 V du jour au lendemain.</li>
	<li>En utilisant un système d’electroblotting demi-sec, transfert de protéines sur une membrane en PVDF pour 80 min à 15 V. Remarque : La membrane PVDF doit être activée avant d’effectuer le transfert de protéines. Incuber la membrane dans le méthanol 100 % pendant 1 min, suivie d’une incubation de 2 min dans l’eau ultrapure.</li>
	<li>Après le transfert des protéines, incuber le gel SDS-PAGE avec la solution de bleu de Coomassie pendant 3 h, suivie de trois étapes de lavage avec de l’eau ultrapure, chaque 30 min.</li>
	<li>À la fin du transfert de protéines, sécher la membrane PVDF pour 1 h. réactiver la membrane comme indiqué dans l’étape 4.5. Bloquer la membrane 1 h avec 5 % de BSA à 1 x TTBS.</li>
	<li>Incuber la membrane avec le premier anticorps : HuR ou mésothéline, tous deux dilué 1/1000 à 5 % de BSA à 1 x TTBS pendant 4 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver la membrane trois fois pendant 7 min dans 1 x TTBS et incuber à la peroxydase de lapin antisouris raifort (HRP)-conjugués anticorps secondaire dilué 1/10 000 à 5 % de BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>Visualiser les protéines à l’aide de chimiluminescence améliorée et un imageur numérique.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

3' UTR appartiennent à la non codantes du génome3, et tous les ARN non codants peut interagir avec des protéines afin d’exercer leur fonction7. Quand le génome des mammifères s’est avéré être une transcription de l’acte et produit une grande partie du long non codantes ARN16, nouvelles preuves ont démontré que ces ARN non-codants-long fonctionne dans la régulation de l’expression des gènes qui interagissent avec remodelage de la chromatine complexes<...

L’expression des gènes et le niveau final du produit du gène peuvent être étroitement contrôlées en affectant la stabilité de l’ARNm et l’ARNm traduction taux1. Ces mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont exercent à travers les interactions des protéines de RNA et/ou de liaison à l’ARN non codants (pratiques commerciales restrictives) avec l’ARNm ciblés. C’est généralement la région non traduite en 3' de l’ARNm (3' UTR - appartenant à la partie non codantes du génome2) qui contient des cis-éléments de régulation (CRE), qui sont reconnus par trans-agissant de facteurs tels que miRNA ou de pratiques commerciales restrictives 3. les mieux étudiés cis-élément au sein de la région 3' UTR, est le motif de l’élément riches adénine (ARE), qui est reconnu par les protéines de liaison AU spécifiques (AUBP) et, à son tour, induit un ARNm dégradation/désadénylation (sont-mediated decay) ou sur la stabilisation de l’ARNm4.
La taille de la région 3' UTR de calretinin (CALB2) d’ARNm est 573 bp long et contient un pentamère AUUUA putatif, tel que prédit par AREsite2, un outil de bioinformatic5. Compatibles avec la présence d’un motif sont présumé, le dosage de vecteur-journaliste de pmirGLO ont démontré un rôle dans la stabilisation de cet élément au sein de l’ARNm de CALB26. Enfin, l' in vitro RNA-menu déroulant servait à identifier le AUBP qui stabilise calretinin ARNm à travers le motif sont.
Étant donné que toutes les ARN non codants interagissent avec les protéines7, l' in vitro RNA-menu déroulant est un bon moyen et des tests de première de choix pour identifier les RNA-Interactiens afin d’aider à décrypter les mécanismes moléculaires. Dans cette méthode de RNA-menu déroulant, des sondes d’ARN synthétisés dans le commerce, qui ont été marquées avec une forme modifiée de biotine (desthiobiotin) à l’extrémité 3' du brin d’ARN, ont été utilisés. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas qui interagir spécifiquement avec l’ARN d’intérêt lié aux protéines. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. Ces protéines liées à RNA sont éluées de billes magnétiques, courir à travers un gel SDS-PAGE de 12 %, transféré sur une membrane et sondés avec anticorps différents.
Dans la procédure de purification d’affinité standard streptavidine-biotine, dénaturation rude conditions sont requises pour perturber la liaison streptavidine-biotine forte irréversible pour éluer les protéines liées8, qui pourrait conduire à la dissociation de complexes protéiques. Contrairement à la biotine, desthiobiotin réversible se lie à la Streptavidine et est déplacé de façon compétitive avec une solution tampon de biotine, permettant l’élution douce des protéines et d’éviter l’isolement des naturellement biotinylé molécules9, ce qui suggère que la technique est idéale pour isoler les complexes de protéine native sous conditions natives.
In vitro les conditions de la liaison et rigueur, qui sont déterminés par la concentration en sel, agents réducteurs et pourcentage de détergent, devraient être proches de celles présentes dans le contexte cellulaire afin d’identifier les véritables in vivo des interactions. Les conditions de liaison mis en place dans les présentes ont été démontrées précédemment en fonction de l’identification de la HuR comme une protéine de liaison AU10. Cette approche pourrait gagner du temps, étant donné que l’optimisation des conditions de liaison approprié peut être long et difficile. En outre, cette méthode pourrait être utilisée comme un protocole de départ pour toute expérience de RNA-menu déroulant et optimiser progressivement en changeant la concentration des sels et des détergents, en modifiant le pourcentage de glycérol et en ajoutant autres sels. En outre, nous avons démontré que même une courte 25 nucléotides RNA-sonde contenant un pentamère sont-motif pourrait servir à démontrer l’interaction avec un AUBP spécifique.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Kit d’extraction nucléaire et cytoplasmique</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés inhibiteurs de protéase Pierce, sans EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr> Kit de <tr><td>tirage magnétique ARN-protéine Pierce&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Comprend des billes magnétiques et le kit doit donc être stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pierce ARN 3' Kit de Desthiobiotinylation End&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>Le kit fait partie du « Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit » et doit être stocké à -20 &deg ; C contrairement au kit rétractable (4 &deg ; C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp ; support magnétique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) anticorps monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>-</td> <td>L’anticorps est inclus dans le Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&nbsp ; - 1:1000 en 5 % BSA 1x TTBS - anticorps secondaire anti-souris de lapin 1:10,000 en 5 % BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &alpha ; - tubuline (MOUSE) anticorps monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 en 5 % BSA 1x TTBS - anticorps secondaire anti-souris de lapin 1:10 000 en BSA à 5 % 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) Anticorps polyclonal</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9542</td><td>1:1000 en 5 % BSA 1x TTBS - anticorps secondaire anti-lapin de chèvre 1:10 000 en BSA à 5 % 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mésothéline (SOURIS) Anticorps monoclonal&nbsp ;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin secondaire de chèvre</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris secondaire de lapin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 moyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Sérum de bovin filtré</td><td>Pan Biotech&nbsp ;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline - streptomycine (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA (1x)</td><td>Gibco par Life technologies&nbsp ;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 cellules</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Plaques de verre</td>Plaques d’espacement <td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN avec entretoise intégrée de 1,5 mm</td><td>Peigne Mini-PROTEAN Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr>, <tr><td>10 puits, 1,5 mm, 66 & micro ; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Solution de décontamination</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - solution mère aqueuse à 30 % d’acrylamide et de bisacrylamide à un rapport de 37,5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20 % SDS&nbsp ;</td>Membrane de transfert en PVDF <td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Doit être activé en incubant dans du méthanol pur pendant 1 min, suivi d’un lavage à l’eau pendant 2 min.</td></tr><tr><td>Cellule de transfert semi-sèche Trans-Blot SD&nbsp ;</td><td>Substrat Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp ; Imageur numérique</td><td>Vilber-synthèse</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>d’oligo-ARN</td><td>Mycrosynth AG,</td><td></td> <td>Suisse-l’échelle de synthèse - 0,04 & micro ; mol - HPLC purifié</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50 % d’aliquotes stériles à conserver à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Percer les billes magnétiques de streptavidine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Veuillez noter que ces billes magnétiques ont un diamètre moyen de 1 & micro ; m (plage de 0,5 à 1,5 & micro ; m). De plus, Dynabeads-M280 Streptavidin, qui sont des perles de taille homogène 2,8 & micro ; m, sont également utilisés dans l’extraction de l’ARN, mais sachez que cela peut affecter le processus de purification.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate-(14-18)-hydrate d’aluminium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>l’acide orthophosphorique&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidine-affinité médiée par la purification des protéines interagissant avec l’arn dans les cellules de mésothéliome

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Le in vitro RNA-menu déroulant est encore largement utilisé dans les premières étapes des protocoles visant à identifier des protéines de liaison à l’ARN qui reconnaissent les structures d’ARN spécifiques et les motifs. Dans ce protocole de RNA-pulldown, sondes d’ARN synthétisés dans le commerce sont étiquetés avec une forme modifiée de la biotine, desthiobiotin, à l’extrémité 3' du brin d’ARN, qui lie réversiblement streptavidine et ainsi permet d’élution des protéines sous plus physiologique conditions. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas de protéines qui interagissent spécifiquement avec l’ARN d’intérêt. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. La méthode décrite ici peut être appliquée pour détecter l’interaction entre les protéines de liaison ARN connues et une sonde RNA longue de 25 nucléotides (nt) contenant une séquence d’intérêt. Ceci est utile pour compléter la caractérisation fonctionnelle de stabiliser ou déstabiliser les éléments présents dans les molécules d’ARN obtenus avec un dosage de vecteur de journaliste.

Dans cette expérience, un fragment long de 25-nt du calretinin 3' UTR hébergeant sont motif (CALB2) 3' UTR (ARE) 25-nt a été utilisé pour tester si elle se lie spécifiquement à la protéine R homme-antigène (HuR), un stabilisateur d’ARNm connus. Pour tester la spécificité de l’élément sont, un ARN 25-nt sonde CALB2 3' UTR (mtARE) contenant une mutation sont-motif, qui a été montrée précédemment de supprimer l’effet de stabilisation du motif sont, a été utilisé6. L’A...

Desthiobiotin marquage d’un oligo synthétique de RNA 25 nucléotides, qui contient un motif élément riches adénine (ARE), permet la fixation spécifique de la protéine cytosolique sont.

Desthiobiotin-streptavidine-affinité médiée par la Purification des protéines interagissant avec l’ARN dans les cellules de mésothéliome

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

L’objectif global de cette procédure est de capturer des protéines cytosoliques qui se lient à une séquence spécifique située dans une molécule d’ARN dans les cellules de mésothéliome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de l’ARN, par exemple si une protéine de liaison à l’ARN prédite peut se lier à une séquence riche en adénosine ou en uridine dans un transcrit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle complète la caractérisation fonctionnelle des éléments stabilisants ou déstabilisants évalués par dosage rapporteur.La démonstration de cette technique sera faite par le Dr Jelena Kresoja-Rakic, postdoc de mon laboratoire. Pour commencer le protocole, procurez-vous des cellules ACC-MESO-4 préalablement préparées avec une confluence de 80 à 90 %. Aspirez le milieu, lavez les cellules avec 15 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X, ou PBS, et aspirez le PBS.Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez le ballon de culture à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ajoutez sept millilitres de milieu RPMI-1640 supplémenté, collectez les cellules dans un tube de 15 millilitres et faites-les tourner à 200 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1,5 millilitre de 1X PBS.Ensuite, transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Faites tourner à nouveau les cellules à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’essorage, jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1,5 millilitre de PBS 1X glacé et faites tourner les cellules à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Jetez le surnageant et estimez le volume emballé des pastilles cellulaires en comparant le tube contenant la pastille cellulaire avec un tube de 1,5 millilitre avec 10, 20, 50 et 100 microlitres de 1X PBS. Ajoutez 200 microlitres de réactif d’extraction cytoplasmique glacé, ou CER I, complété par deux microlitres d’inhibiteur de protéinase 1X. Faites tourbillonner vigoureusement la pastille pendant 15 secondes et incubez le tube sur de la glace pendant 10 minutes.Ajoutez 11 microlitres de réactif d’extraction cytoplasmique II glacé, ou CER II, faites un vortex vigoureux pendant cinq secondes et incubez le tube pendant une minute sur de la glace. Agitez vigoureusement l’échantillon pendant cinq secondes et centrifugez le tube à 16 000 fois g pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans le tube propre et pré-refroidi sur de la glace.Remettez en suspension la pastille restante dans 100 microlitres de réactif d’extraction nucléaire glacé, ou NER, complété par un microlitre d’inhibiteur de protéinase, et agitez vigoureusement pendant 15 secondes. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 40 minutes et agiter au vortex toutes les 10 minutes pendant 15 secondes. Centrifugez le tube à 16 000 fois g pendant 10 minutes.Transférez le surnageant, qui est la fraction protéique nucléaire, dans un tube propre et pré-refroidi. Mesurez immédiatement la concentration en protéines à l’aide de la méthode bicinchoninique. Ensuite, préparez 25 microlitres d’aliquotes d’extraits cytosoliques et nucléaires.Congelez ces aliquotes en les plaçant dans de l’azote liquide pendant cinq secondes et stockez-les directement à moins 80 degrés Celsius. Transférez cinq microlitres de sondes d’ARN de 10 micromolaires dans des tubes à microcentrifuger à paroi mince de 0,5 millilitre et incuberez-les dans une machine PCR à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez immédiatement les tubes sur de la glace.Pour une seule réaction de 30 microlitres, ajoutez 10 microlitres de mélange préalablement préparé dans le tube contenant de l’ARN. Ajoutez soigneusement 15 microlitres de PEG 30 % à la réaction et utilisez une pointe fraîche pour mélanger la réaction. Incuber la réaction pendant la nuit à 16 degrés Celsius.Le lendemain, préparez les réactifs. Ajoutez 70 microlitres d’eau sans nucléase dans les tubes de réaction de marquage de l’ARN. Ajoutez 100 microlitres d’alcool chloroforme-isoamylique, et faites tourner brièvement l’échantillon à 13 000 fois g pendant trois minutes.Retirez soigneusement uniquement la phase supérieure. Évitez de toucher la phase inférieure. Transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sans nucléase.Ajoutez 10 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires, un microlitre de glycogène et 300 microlitres d’éthanol glacé à 100 %. Placez le tube à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, centrifuger à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Ajoutez 300 microlitres d’éthanol glacé à 70 % et centrifugez à nouveau à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez complètement le surnageant et faites sécher la pastille à l’air libre pendant 15 minutes.Remettre le granulé en suspension dans 20 microlitres d’eau sans nucléase. Incuber l’ARN à 90 degrés Celsius pendant deux minutes et placez-le sur de la glace. Placez l’ARN marqué sur de la glace lors de l’étape suivante de prélavage des billes magnétiques de streptavidine.Prélaver 50 microlitres de billes magnétiques de streptavidine pour 50 picomoles d’ARN. Faites vortex le tube avec des billes magnétiques de streptavidine pendant 15 secondes. Après un vortex rapide, prélevez 200 microlitres dans un tube Safe-Lock propre de 1,5 millilitre à l’aide d’embouts de pipette coupés.Ensuite, placez le tube sur un support magnétique de sorte que les billes s’accumulent sur le côté du tube et attendez une minute. Retirez le liquide de remise en suspension. Pour laver les billes, retirez le tube du support magnétique, ajoutez 400 microlitres d’hydroxyde de sodium à 0,1 molaire, une solution de chlorure de sodium à 0,05 molaire et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois.Replacez le tube sur le support magnétique et attendez une minute. Ensuite, récupérez le surnageant. Lavez les billes avec 200 microlitres de chlorure de sodium de 100 millimolaires et retirez le surnageant.Ajoutez 200 microlitres de tris de 20 millimolaires, remettez les billes en suspension par pipetage et placez le tube sur le support magnétique. Au bout d’une minute, retirez le surnageant. Ensuite, retirez le tube du support magnétique, ajoutez 200 microlitres de tampon de capture d’ARN 1X et remettez en suspension les billes magnétiques de streptavidine en tourbillonnant brièvement.Retirez 50 microlitres de billes magnétiques de streptavidine et ajoutez-les à chaque tube d’ARN marqué à l’aide d’une pointe de pipette coupée. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante sur un rouleau. Une fois que le tube est resté sur le support magnétique pendant une minute, retirez le surnageant.Ajoutez 50 microlitres de tris de 20 millimolaires aux billes et remettez-les en suspension. Ensuite, placez les tubes dans le support magnétique. Au bout d’une minute, retirez le surnageant.Ajoutez 100 microlitres de tampon de liaison à l’ARN protéique 1X aux billes et remettez-les en suspension. Ensuite, replacez les tubes dans le support magnétique. Une fois que les tubes sont restés dans le support pendant une minute, récupérez le surnageant.Ajoutez 100 microlitres de mélange maître B, remettez en suspension en pipetant doucement de haut en bas, et évitez de créer des bulles. Incuber des tubes réactionnels pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius sur un rouleau. Passez aux étapes de lavage et d’élution.Placez les tubes dans un support magnétique, collectez le flux et transférez-le dans un nouveau tube. Pipetez 100 microlitres de tampon de lavage 1X sur les billes, remettez-les doucement en suspension, remettez-les dans le support, attendez une minute et jetez le surnageant. Répétez cette étape deux fois.Ajoutez 40 microlitres de tampon d’élution aux billes magnétiques, mélangez en pipetant de haut en bas et incubez sur un agitateur à tube. Placez les tubes dans un support magnétique, attendez une minute et prélevez l’échantillon d’éluat. Placer sur de la glace et utiliser pour l’analyse en aval.Pour démontrer la pureté des fractions nucléaire/cytosolique, les protéines ont été analysées par Western blot, ce qui a montré que l’alpha-tubuline n’était détectée que dans la fraction cytosolique et que la protéine PARP n’était détectée que dans la fraction nucléaire. L’éluat de la sonde UTR ARE à trois points CALB2 a démontré la liaison de R humain et était absent dans l’éluat de la sonde mutante et de la sonde d’ARN non apparentée, qui se lie à la protéine sensible au fer. Pour démontrer davantage la spécificité entre l’UTR à trois primes CALB et le R humain, la membrane a été sondée avec un anticorps anti-mésothéline, et les trois échantillons d’éluat n’ont montré aucune présence de mésothéline, indiquant que le motif ARE stabilisateur au sein de l’UTR à trois premiers CALB2 peut spécifiquement se lier à la protéine R humaine.La coloration Coomassie du gel montre que des quantités égales de protéines ont été utilisées pour incuber avec les trois sondes d’ARN différentes. À la suite de cette procédure, une méthode supplémentaire centrée sur les protéines, comme l’immunoprécipitation d’une protéine donnée, peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la séquence qui s’y lie. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN pour explorer les partenaires d’interaction possibles d’un ARN spécifique.

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Dosage par extraction d’ARN-protéine pour isoler des protéines de liaison à l’ARN par extraction par affinité

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Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

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Purification des protéines de surface cellulaire biotinylées de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellules intestinales épithéliales

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Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

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Desthiobiotin-streptavidine-affinité médiée par la Purification des protéines interagissant avec l’ARN dans les cellules de mésothéliome

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