Name: Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'édition génomique chez C. elegans utilisant des ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9 et des matrices de réparation homologue. Cette technique permet de générer des mutations ponctuelles pour étudier la variance génétique dans les maladies neurodégénératives.

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Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales a suivi la ligne directrice de la National Institutes of Health et l’Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) à l’Université du Michigan. Utiliser des solutions sans RNase et Pipeter conseils tout au long du protocole. Nettoyer la zone de travail, pipettes, tubes et centrifugeuse avec solution de décontamination de RNase en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).
1. sgRNA sélection de la cible
<ol><li>À l’aide d’un navigateur web, ouvrez la page Web : http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>Entrée ~ 60 paires de bases (PB) de séquence flanquant la modification désirée d’intérêt (c.-à-d. 30 bp 5' et 3' de l’édition souhaitée).</li>
		<li>Dans le menu déroulant, sélectionnez le génome de Caenorhabditis elegans .</li>
		<li>Sélectionnez le Motif Adjacent de Protospacer (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) dans le menu déroulant.</li>
		<li>Cliquez sur soumettre. Dans la page de résultats, choisissez la séquence cible de rang supérieur le plus proche de l’édition d’intérêt. S’il n’y a aucun site cible approprié au sein de la séquence d’entrée bp 60 flanquement, développez la séquence requête jusqu'à 100 bp (edit de part et d’autre de la désiréec'est-à-dire 50 bp).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Provenant d’une source disponible, par exemple synthego, obtenir un 20-mer cible sgRNA avec les caractéristiques suivantes : 3 nmol ; aucune modification.</li>
	<li>Dès réception, centrifuger sgRNA lyophilisé contenant un tube à > 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Ajouter 60 µL de TE exempte de nucléase dans le tube et doucement une nouvelle suspension de pipetage et descendre de 15 à 20 fois à l’aide d’une pipette de P200. La concentration finale est 50 µM.</li>
</ol>2. conception de modèle de réparation homologie dirigée
<ol><li>Concevoir un ssODN HDR modèle contenant : 1) la mutation d’intérêt, 2) un site unique dans le cadre l’endonucléase de restriction, 3) une mutation silencieuse d’un ou deux de la Gs au sein de la séquence NGG PAM et 4) 50 bp 5' et 3' homologie armes flanquant la première et la dernière mutation. (Figure 1) 9 , 10.<ol>
<li>Si la mutation de la séquence NGG PAM n’est pas possible, introduire 5-6 silence mutations au sein de la séquence cible de reconnaissance de sgRNA pour empêcher le clivage induite par le sgRNA du modèle HDR ssODN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Provenant d’une source disponible, par exemple idtdna, obtenir un « oligonucléotide ADN Ultramer » avec les paramètres suivants : échelle : 4 nmol ; Formulation : None ; Purification : Standard dessalage.</li>
	<li>Dès réception, centrifuger ssODN lyophilisé contenant un tube à > 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Doucement une nouvelle suspension ssODN à une concentration finale de 100 µM dans ddH exempte de nucléase2O en pipettant également, haut et bas de 15 à 20 fois à l’aide d’une pipette de P200.</li>
</ol>3. conception des amorces génotypage
<ol><li>Concevoir une amorce réglée flanquant la modification du génome pour déclencher un ~ 400-700 bp PCR amplicon11.</li>
	<li>Optimiser les conditions de cyclisme de PCR pour produire un amplicon unique et spécifique à11.</li>
</ol>4. préparer le mélange de l’Injection
<ol><li>Centrifuger 1 Table réactifs à vitesse maximale pendant 2 min à 4 ° C.</li>
	<li>Dans l’ordre indiqué, ajouter 1 Table réactifs dans un tube PCR exempte de nucléase.</li>
	<li>Bien mélanger par doucement pipetage haut en bas 10 fois avec une pipette P20.</li>
	<li>Incuber le mélange d’injection pendant 10 min à température ambiante.</li>
</ol>5. protocole d’injection
<ol><li>Charger la micropipette d’injection avec environ la moitié du mélange injection12. Sauver le restant de mélange d’injection dans le cas où l’aiguille d’injection obstrue ou se brise.</li>
	<li>Casser la pointe une micropipette afin qu’environ 20-30 lb/po2 produise une progressive de la solution fluide12. NOTE : Conseils de diamètre plus grands négativement affectent la santé animale et diminuent le rendement des descendances F1 .</li>
	<li>Injecter 10 à 15 jeunes adultes vers de terre dans les deux bras gonadiques si possible12. Si ce n’est pas le cas, l’injection dans un bras gonadique est suffisante.</li>
	<li>Qu’injecté animaux (P,0) puissent récupérer pendant 1-2 h à température ambiante sur une plaque de médias (NGM) croissance nématode graines OP50 35 mm. Par la suite, injecté P0 animaux aux plaques de NGM individuels graines OP50 35 mm à l’aide d’un ver fil de platine choisir12.</li>
</ol>6. écran P0 plaques et unique mCherry(+) F1s
<ol><li>Deux jours après injection, identifier les plaques de0 P contenant des descendants de1 F exprimant mCherry dans le pharynx à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent (Figure 1, jour 2 - 3). Choisissez des plaques de0 3 P qui contiennent les plupart des mCherry(+) F1 animaux.</li>
	<li>Dans chacune des trois sélectionnés P0 plaques, unique 8-12 mCherry(+) F1 animaux pour un total de 24-36 mCherry(+) F1s à l’aide d’un ver prélever (Figure 1, jour 2 - 3). Remarque : mCherry(-) animaux peut également être distingué de ces plaques de0 P, mais la probabilité d’identifier correctement édité animaux est beaucoup inférieur (Figure 2 a).</li>
	<li>Permettre aux individuels F1s pour auto-fécondent et pondent leurs œufs pendant 1 à 2 jours à température ambiante.</li>
</ol>7. simple ver PCR et génotypage
<ol><li>Après 1 à 2 jours de la ponte, transférer la F1s dans les couvercles sur le tube de barrette de la PCR individuels contenant 7 µL de tampon de lyse ver à l’aide d’une pique de ver (tableau 2, Figure 1, jour 4-5).</li>
	<li>Tubes à centrifuger PCR à vitesse maximum pendant 1 min à température ambiante pour apporter des animaux jusqu’au fond du tube et geler les tubes à-80 ° C pendant 1 h. Remarque : Les vers peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C.</li>
	<li>Lyse vers congelés dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 60 ° C pendant 60 minutes, 95 ° C pendant 15 min, 4 ° C tenir.</li>
	<li>Set-up PCR mastermix comme indiqué dans le tableau 3.</li>
	<li>Ajouter 21 µL de mastermix PCR dans des tubes PCR clean et puis ajoutez 4 µL de la lyse de la vis sans fin de l’étape 3. Mélangez bien à l’aide d’une pipette et exécuter le programme PCR en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).</li>
	<li>Purifier les réactions de PCR à l’aide d’un kit ADN pur et concentré, suivant les instructions du fabricant (voir Table des matières). Éluer ADN en ajoutant 10 µL d’eau à la colonne.</li>
	<li>Mastermix d’enzyme de restriction mise en place comme indiqué dans le tableau 4.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de l’enzyme de restriction mastermix dans chaque réaction de PCR nettoyée et incuber pendant 1-2 h à 37 ° C13.</li>
	<li>Separate digérés produits PCR sur un gel d’agarose de 1,5 % à 120 V à l’aide de 1 x du tampon Tris-acétate-EDTA (TAE)14.</li>
</ol>8. identification et vérification de la séquence des animaux édité
<ol><li>Examiner des échantillons d’enzyme de digestion pour la présence de bandes qui indiquent le potentiel édité animaux14 (Figure 1, jour 4-5). Remarque : Placez un contrôle N2 pour identifier les mutations indel potentiels qui peuvent être observées comme des changements dans la taille de bande et/ou inattendue et complexe enzyme de restriction digestion, profils de bandes.</li>
	<li>Après avoir identifié les éventuels animaux édité, utiliser le reste 3 µL de lyse ver et répétez la réaction PCR. Ne pas nettoyer ou restriction enzyme digérer la réaction PCR, une fois le programme terminé. Charger la réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 %, séparé et extraire la bande en utilisant un gel extraction kit15 (voir Table des matières).</li>
	<li>Gel de Sanger séquence16 extrait l’ADN à l’aide de l’apprêt de F1 pour identifier les animaux correctement modifié (Figure 1 a) NOTE : Hétérozygote lectures contiendra recouvert de pics en raison de la présence de la souche sauvage et machiné allèle.</li>
	<li>Pour obtenir animaux homozygotes vérifiées animaux hétérozygotes édité, unique 8-122 animaux et effectuez les étapes 7 et 8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient%2C+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li>
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<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
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<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Nous remercions les membres du laboratoire Beg pour une lecture critique de ce manuscrit. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis , qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Recherche dans le laboratoire de Beg est pris en charge par des subventions du NIH (R01 NS094678) et Muscular Dystrophy Association (MDA382300) à A.A.B.

Le système CRISPR-Cas9 est un outil puissant et efficace pour justement modifier le génome d’organismes modèles. Ici, nous démontrons que chimérique sgRNAs20 couplé avec ssODN HDR modèles permettent la génération très efficace de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Ce qui est important, nous démontrons que livraison RNP produit haute efficacité édition lorsque la fluorescence est utilisé comme marqueur de sélection Co, mettant en évidence la facilité et la fiabilité de la...

Les progrès technologiques récents ont radicalement transformé et accéléré la capacité à précisément les génomes ingénieur. En particulier, le système CRISPR-Cas9, qui repose sur l’endonucléase guidée RNA Cas9 pour induire une rupture double brin (DSB) près de la séquence cible des intérêts, a été largement utilisé à l’ingénieur avec précision le génome de la plupart des organismes modèles utilisés en recherche biomédicale1,2,3,4. Significativement, l’utilisation de CRISPR-Cas9 a débloqué génome édition même en difficiles espèces comme c. elegans5. Peu importe l’espèce, générant des mutations ponctuelles avec le génome CRISPR-Cas9 basé système d’édition s’appuie sur trois éléments de base : 1) Cas9 endonucléase, 2) un seul guide d’ARN (sgRNA) qui dirige l’endonucléase Cas9 à une séquence cible et 3) un utilisateur conçu modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR) contenant l’edit(s) désiré d’intérêt2.
Il existe plusieurs méthodes qui peuvent servir à introduire le ciblage sgRNA et Cas9 nucléase dans les cellules, y compris le plasmide, d’ARN et de méthodes de prestation virale6. Récemment, livraison directe de pre-complexé sgRNA-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) a émergé comme un outil puissant et efficace dans le génome CRISPR dotés de Cas9 édition7. La prestation directe de pre-complexé CRISPR-Cas9 RNP a plusieurs avantages distincts, à savoir : 1) RNP contourner la nécessité pour la transcription cellulaire et de traduction, RNP 2) sont rapidement éliminé, ce qui peut augmenter la spécificité en réduisant le temps disponible pour hors-cible clivage et 3) RNP ne contenir aucun élément d’ADN/ARN étranger qui contourne l’introduction des séquences non indigènes dans le génome hôte grâce à l’intégration au hasard. Ensemble, ces attributs susceptibles de fournissent une courte rafale de sur-cible CRISPR édition tout en minimisant les effets hors cible.
Les auteurs décrivent un protocole simple et efficace pour introduire des changements génomiques chez c. elegans. Ce protocole comprend ciblage sgRNA et unique oligonucléotide échoués (ssODN) HDR modèle conception, complexants RNP sgRNA-Cas9 et livraison et une stratégie de génotypage pour l’identification sans équivoque des animaux bien édité. En utilisant cette stratégie, non seulement les modifications spécifiques souhaitées peuvent être récupérées, mais autres mutations non-spécifiques indel peuvent aussi être récupérées. Ainsi, notre stratégie permet la génération d’une série allélique à l’aide d’une stratégie unique, où les deux allèles mono, bi-alléliques et indel mutants peuvent être générés dans la génération de1 F.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp ; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>ARNsg chimérique</td></tr><tr><td>sans nucléase TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>fourni avec le kit sgRNA EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Synthego Inc.</td><td>fourni avec le kit sgRNA EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9 protein</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2 ::mCherry Marker Plasmide</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ADN Clean & Concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit de récupération d’ADN</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Verre Borosilicate Micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD : 1.0mm. ID : 0.78mm</td></tr><tr><td>Chlorhydrate Trizma</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solution de décontamination</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

un rapide et facile de pipeline pour générer des mutants de point génomique dans c. elegans en utilisant crispr/cas9 ribonucléoprotéines

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Les répétitions de palindromes régulièrement intercalées en cluster (CRISPR) - CRISPR - protéine 9 (Cas9) système de défense immunitaire adaptative procaryotes a été coopté comme un outil puissant pour l’ingénierie des génomes eucaryotes précise associée. Nous présentons ici une méthode rapide et simple à l’aide de guide unique chimérique RNAs (sgRNA) et CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) pour la production efficace et précise de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Nous décrivons un pipeline pour sélection cible sgRNA, conception de modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR), complexants CRISPR-Cas9-RNP et livraison et une stratégie de génotypage permettant l’identification rapide et fiable des animaux correctement édité. Notre approche non seulement permet la génération facile et l’identification du point désiré de génomique des animaux mutants, mais facilite également la détection d’autres allèles indel complexe en environ 4-5 jours avec un rendement élevé et une charge de travail réduite.

Mutations humaines superoxyde dismutase 1 (SOD1) représentent environ 10 à 20 % de genetique latérale amyotrophique, une maladie neurodégénérative dévastateur qui mène invariablement à la paralysie et la mort de17. SOD-1 humain est une protéine évolutivement conservée partage 55 % d’identité et 70 % de similarité avec la protéine de SOD-1 c. elegans (Figure 1 b). Afin de démontrer la simplicité, la faisabilité et l’ef...

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des mutations génomiques ponctuelles chez C. Elegans en utilisant des modèles de réparation dirigée par homologie oligonucléotidique simple brin et des ribonucléoprotéines CRISPR/Cas9. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la détermination des conséquences pathologiques de la variance génétique associée aux maladies neurodégénératives. Le principal avantage de cette technique est que des mutations ponctuelles génomiques peuvent être générées rapidement, ce qui permet l’étude fonctionnelle de la variance génétique dans le contexte d’un contrôle régulateur endogène, tout en évitant les mises en garde de la surexpression des protéines.Pour effectuer la sélection de la cible de l’ARNsg, ouvrez la page Web illustrée ici. Entrez environ 60 paires de bases de séquence flanquant le montage souhaité qui vous intéresse. Après avoir sélectionné le génome de C.Elegans et le motif adjacent protospacer selon le protocole de texte, cliquez sur Soumettre.Sur la page de résultats, choisissez la séquence cible la mieux classée la plus proche de la modification qui vous intéresse. Dès réception, centrifuger le tube contenant de l’ARNsg lyophilisé à température ambiante et à au moins 12 000 g pendant une minute. Ajoutez 60 microlitres de TE sans nucléase dans le tube et utilisez une pipette p200 pour remettre doucement en suspension en pipetant de haut en bas 15 à 20 fois.La concentration finale est de 50 micromolaires. Concevez un modèle HDR ssODN contenant la mutation d’intérêt, un site unique d’endonucléase de restriction de trame, une mutation silencieuse de l’un ou des deux G dans la séquence NGG PAM et 50 paires de bases, cinq premiers et trois premiers bras d’homologie flanquant la première et la dernière mutation. Dès réception, centrifugez le tube contenant du ssODN lyophilisé comme nous venons de le démontrer, puis utilisez le DD H20 sans nucléase pour remettre doucement en suspension le ssODN à une concentration finale de 100 micromolaires.Pour préparer un mélange d’injection, centrifugez les réactifs présentés ici à la vitesse maximale et à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Dans l’ordre indiqué, ajoutez les réactifs dans un tube PCR sans nucléase. Ensuite, à l’aide d’une pipette p20, mélangez délicatement et soigneusement le contenu.Incuber le tube à température ambiante pendant dix minutes. Après avoir injecté des animaux P0 selon le protocole textuel, laissez-les récupérer à température ambiante pendant une à deux heures sur une plaque NGM de 35 millimètres ensemencée OP50. Par la suite, à l’aide d’un pic à vis sans fin en fil de platine, transférez des animaux P0 injectés individuellement sur des plaques NGM individuelles de 35 millimètres ensemencées en OP50.Deux jours après l’injection, utiliser un microscope fluorescent pour identifier les plaques P0 contenant la descendance F1, exprimant mCherry dans le pharynx. Choisissez trois plaques P0 qui contiennent le plus d’animaux F1 positifs à mCherry. À partir de chacune des trois plaques P0 sélectionnées, utilisez un pic à vis pour isoler huit à 12 animaux F1 mCherry positifs, pour un total de 24 à 36 mCherry F1 positifs.Laissez les F1 s’autoféconder et pondre des œufs à température ambiante pendant un à deux jours. Après un à deux jours de ponte, utilisez un pic à vis sans fin pour transférer les F1 dans des bouchons de tube de bandelettes PCR individuels contenant sept microlitres de tampon de lyse des vers. Centrifugez les tubes PCR à vitesse maximale et à température ambiante pendant une minute pour amener les animaux au fond du tube.Ensuite, congelez les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lysez les vers congelés dans un thermocycleur à l’aide du programme suivant. Ensuite, configurez un master mix PCR comme indiqué dans ce tableau.Ajoutez 21 microlitres de mélange maître PCR dans des tubes PCR propres, puis ajoutez quatre microlitres de tube de lyse vermifuge et mélangez bien par pipetage. Exécutez ensuite le programme PCR en suivant les directives du fabricant. Purifiez les réactions PCR à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentration d’ADN en suivant les instructions du fabricant.Diluez ensuite l’ADN en ajoutant 10 microlitres d’eau dans la colonne de spin. Après avoir mis en place le mélange maître d’enzymes de restriction, ajoutez 10 microlitres à chaque réaction PCR nettoyée et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Séparez ensuite les produits PCR digérés sur un gel d’agarose à 1,5 % à l’aide d’un tampon TAE x à 120 volts.Examinez les échantillons digérés par des enzymes pour détecter la présence de bandes indiquant des animaux modifiés potentiels. Après avoir identifié des animaux modifiés potentiels, utilisez les trois microlitres restants de lyse parasitaire et répétez la PCR. Ensuite, chargez immédiatement les réactions terminées sur un gel d’agarose à 1 % avant de séparer et d’extraire la bande à l’aide d’un kit d’extraction de gel.À l’aide de l’amorce F1, effectuez un séquençage de Sanger pour identifier les animaux correctement modifiés. Enfin, obtenir des animaux homozygotes à partir d’animaux modifiés hétérozygotes vérifiés, isoler huit à 12 animaux F2 et effectuer le génotypage et la vérification des séquences selon le protocole de texte. Pour démontrer la simplicité, la faisabilité et l’efficacité de l’approche basée sur CRISPR/Cas9 RNP, le gène C.Elegans sod-1 a été ciblé pour introduire la variante humaine G93a associée à la maladie dans le génome du ver.Cette image en gel montre les résultats du génotypage de 24 animaux F1 positifs à mCherry. 10 présentaient une modification monoallylique ou biallylique, 10 étaient de type sauvage, trois étaient des indels potentiels et un était un échec à la PCR. Pour démontrer que le marqueur fluorescent mCherry enrichit pour la modification du génome, huit animaux négatifs mCherry de chacune des trois plaques P0 ont été sélectionnés.Un seul animal a été correctement modifié alors que 23 étaient de type sauvage. Cette figure montre le chromatogramme du produit de PCR extrait en gel sur toute la longueur, démontrant que les changements nucléotidiques précis conçus dans la matrice HDR ssODN ont été fidèlement incorporés dans le génome de cet animal homozygote F1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour générer et identifier des mutations génomiques ponctuelles chez C. Elegans en quatre à cinq jours si elle est effectuée correctement.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des réactifs et des techniques sans noyau, notamment de l’eau sans RNase, des pointes de pipette filtrantes et des gants. À la suite de cette procédure, des tests cellulaires, moléculaires et comportementaux peuvent être effectués afin d’étudier les phénotypes qui peuvent être associés à la mutation d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer avec précision des mutations ponctuelles génomiques chez C. Elegans en utilisant des RNase chimériques à guide unique et des protéines ribonucléaires CRISPR/Cas9.

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PCR à ver unique : une méthode pour extraire et amplifier l’ADN génomique

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L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

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Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines (Vidéo) | JoVE Journal

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

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