Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

L’objectif global de cette procédure est de générer des mutations génomiques ponctuelles chez C. Elegans en utilisant des modèles de réparation dirigée par homologie oligonucléotidique simple brin et des ribonucléoprotéines CRISPR/Cas9. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la détermination des conséquences pathologiques de la variance génétique associée aux maladies neurodégénératives. Le principal avantage de cette technique est que des mutations ponctuelles génomiques peuvent être générées rapidement, ce qui permet l’étude fonctionnelle de la variance génétique dans le contexte d’un contrôle régulateur endogène, tout en évitant les mises en garde de la surexpression des protéines.

Pour effectuer la sélection de la cible de l’ARNsg, ouvrez la page Web illustrée ici. Entrez environ 60 paires de bases de séquence flanquant le montage souhaité qui vous intéresse. Après avoir sélectionné le génome de C.Elegans et le motif adjacent protospacer selon le protocole de texte, cliquez sur Soumettre.

Sur la page de résultats, choisissez la séquence cible la mieux classée la plus proche de la modification qui vous intéresse. Dès réception, centrifuger le tube contenant de l’ARNsg lyophilisé à température ambiante et à au moins 12 000 g pendant une minute. Ajoutez 60 microlitres de TE sans nucléase dans le tube et utilisez une pipette p200 pour remettre doucement en suspension en pipetant de haut en bas 15 à 20 fois.

La concentration finale est de 50 micromolaires. Concevez un modèle HDR ssODN contenant la mutation d’intérêt, un site unique d’endonucléase de restriction de trame, une mutation silencieuse de l’un ou des deux G dans la séquence NGG PAM et 50 paires de bases, cinq premiers et trois premiers bras d’homologie flanquant la première et la dernière mutation. Dès réception, centrifugez le tube contenant du ssODN lyophilisé comme nous venons de le démontrer, puis utilisez le DD H20 sans nucléase pour remettre doucement en suspension le ssODN à une concentration finale de 100 micromolaires.

Pour préparer un mélange d’injection, centrifugez les réactifs présentés ici à la vitesse maximale et à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Dans l’ordre indiqué, ajoutez les réactifs dans un tube PCR sans nucléase. Ensuite, à l’aide d’une pipette p20, mélangez délicatement et soigneusement le contenu.

Incuber le tube à température ambiante pendant dix minutes. Après avoir injecté des animaux P0 selon le protocole textuel, laissez-les récupérer à température ambiante pendant une à deux heures sur une plaque NGM de 35 millimètres ensemencée OP50. Par la suite, à l’aide d’un pic à vis sans fin en fil de platine, transférez des animaux P0 injectés individuellement sur des plaques NGM individuelles de 35 millimètres ensemencées en OP50.

Deux jours après l’injection, utiliser un microscope fluorescent pour identifier les plaques P0 contenant la descendance F1, exprimant mCherry dans le pharynx. Choisissez trois plaques P0 qui contiennent le plus d’animaux F1 positifs à mCherry. À partir de chacune des trois plaques P0 sélectionnées, utilisez un pic à vis pour isoler huit à 12 animaux F1 mCherry positifs, pour un total de 24 à 36 mCherry F1 positifs.

Laissez les F1 s’autoféconder et pondre des œufs à température ambiante pendant un à deux jours. Après un à deux jours de ponte, utilisez un pic à vis sans fin pour transférer les F1 dans des bouchons de tube de bandelettes PCR individuels contenant sept microlitres de tampon de lyse des vers. Centrifugez les tubes PCR à vitesse maximale et à température ambiante pendant une minute pour amener les animaux au fond du tube.

Ensuite, congelez les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lysez les vers congelés dans un thermocycleur à l’aide du programme suivant. Ensuite, configurez un master mix PCR comme indiqué dans ce tableau.

Ajoutez 21 microlitres de mélange maître PCR dans des tubes PCR propres, puis ajoutez quatre microlitres de tube de lyse vermifuge et mélangez bien par pipetage. Exécutez ensuite le programme PCR en suivant les directives du fabricant. Purifiez les réactions PCR à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentration d’ADN en suivant les instructions du fabricant.

Diluez ensuite l’ADN en ajoutant 10 microlitres d’eau dans la colonne de spin. Après avoir mis en place le mélange maître d’enzymes de restriction, ajoutez 10 microlitres à chaque réaction PCR nettoyée et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Séparez ensuite les produits PCR digérés sur un gel d’agarose à 1,5 % à l’aide d’un tampon TAE x à 120 volts.

Examinez les échantillons digérés par des enzymes pour détecter la présence de bandes indiquant des animaux modifiés potentiels. Après avoir identifié des animaux modifiés potentiels, utilisez les trois microlitres restants de lyse parasitaire et répétez la PCR. Ensuite, chargez immédiatement les réactions terminées sur un gel d’agarose à 1 % avant de séparer et d’extraire la bande à l’aide d’un kit d’extraction de gel.

À l’aide de l’amorce F1, effectuez un séquençage de Sanger pour identifier les animaux correctement modifiés. Enfin, obtenir des animaux homozygotes à partir d’animaux modifiés hétérozygotes vérifiés, isoler huit à 12 animaux F2 et effectuer le génotypage et la vérification des séquences selon le protocole de texte. Pour démontrer la simplicité, la faisabilité et l’efficacité de l’approche basée sur CRISPR/Cas9 RNP, le gène C.Elegans sod-1 a été ciblé pour introduire la variante humaine G93a associée à la maladie dans le génome du ver.

Cette image en gel montre les résultats du génotypage de 24 animaux F1 positifs à mCherry. 10 présentaient une modification monoallylique ou biallylique, 10 étaient de type sauvage, trois étaient des indels potentiels et un était un échec à la PCR. Pour démontrer que le marqueur fluorescent mCherry enrichit pour la modification du génome, huit animaux négatifs mCherry de chacune des trois plaques P0 ont été sélectionnés.

Un seul animal a été correctement modifié alors que 23 étaient de type sauvage. Cette figure montre le chromatogramme du produit de PCR extrait en gel sur toute la longueur, démontrant que les changements nucléotidiques précis conçus dans la matrice HDR ssODN ont été fidèlement incorporés dans le génome de cet animal homozygote F1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour générer et identifier des mutations génomiques ponctuelles chez C. Elegans en quatre à cinq jours si elle est effectuée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des réactifs et des techniques sans noyau, notamment de l’eau sans RNase, des pointes de pipette filtrantes et des gants. À la suite de cette procédure, des tests cellulaires, moléculaires et comportementaux peuvent être effectués afin d’étudier les phénotypes qui peuvent être associés à la mutation d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer avec précision des mutations ponctuelles génomiques chez C. Elegans en utilisant des RNase chimériques à guide unique et des protéines ribonucléaires CRISPR/Cas9.