Toeprinting analyse de Translation Initiation complexe formé sur l’ARNm chez les mammifères

L’objectif global de cette analyse d’empreinte d’orteil est d’observer la formation du complexe d’initiation de traduction sur les ARNm de mammifères. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la traduction de l’ARNm, telles que l’initiation de la traduction médiée par l’IRES. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’effectuer une analyse détaillée de la formation complexe d’initiation de traduction sur un ARNm spécifique.

Assemblez les réactions de transcription pour transcrire l’ARN à partir des matrices d’ADN amplifiées par PCR, codant pour l’ARN XIAP IRES ou ses mutants. Ensuite, ajoutez deux unités de DNase sans RNase pour supprimer la matrice d’ADN à chaque réaction de 20 microlitres d’ARN. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, diluez l’ARN traité à la DNase avec de l’eau exempte de nucléases jusqu’à un volume final de 110 microlitres. Ensuite, ajoutez 110 microlitres de phénol acide pour commencer la purification de l’ARN. Agitez les échantillons pendant cinq secondes et centrifugez-les à 20 000 x g pendant trois minutes à température ambiante.

Il est essentiel de diluer l’ARN ou l’ADNC avant l’extraction au phénol. Si le volume est trop faible, il sera difficile de récupérer physiquement la phase aqueuse et le rendement final sera faible. Ensuite, transférez soigneusement 100 microlitres de la phase aqueuse contenant de l’ARN dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Ajouter 10 microlitres d’acétate de sodium 3 M, pH 5,5, et mélanger les échantillons. Ensuite, ajoutez trois volumes d’éthanol à 100 % pour précipiter l’ARN et vortex les échantillons pendant cinq secondes. Incuber toute la nuit à 20 degrés Celsius.

Le lendemain, centrifugez les échantillons à 20 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Ensuite, lavez le granulé avec 500 microlitres d’éthanol glacé à 70 % et répétez la centrifugation. Aspirez soigneusement autant de surnageant que possible sans déloger la pastille.

Ensuite, faites sécher la pastille à l’air libre pendant cinq à 10 minutes. Remettre la pastille en suspension dans de l’eau sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 0,5 microgramme par microlitre. Pour commencer le test d’impression des orteils, ajoutez 15 microlitres de lysat de réticulocyte de lapin non traité aux nucléases dans chaque tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, qui représentent l’ARN de type sauvage Xiap IRES et ses mutants.

Ajoutez un inhibiteur de la RNase, de l’ATP et du GMP-PNP dans chaque tube. Incuber à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, ajoutez un microlitre de l’ARN respectif dans chacun des tubes et incubez à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires.

Pendant la période d’incubation, ajoutez du DTT et de la spermidine au tampon d’impression des orteils. Ensuite, ajoutez 22 microlitres de tampon d’impression d’orteils dans chacun des tubes et incubez à 30 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitre d’apprêt d’impression d’orteil marqué IR et incubez la réaction sur de la glace pendant 10 minutes.

Par la suite, ajoutez deux microlitres de dNTP, deux microlitres d’acétate de magnésium et un microlitre de transcriptase inverse du virus de la myéoblastose aviaire. Portez le volume final à 50 microlitres avec tampon d’impression des orteils. Ensuite, laissez l’extension de l’amorce se produire pendant 45 minutes à 30 degrés Celsius.

Il est également essentiel d’ajouter de l’acétate de magnésium à la réaction d’impression des orteils, sans quoi la transcriptase inverse ne fonctionnera pas de manière optimale. Après cela, ajoutez 200 microlitres d’eau sans nucléases. Ajoutez 250 microlitres d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique 25:24:1, pH 8,0, pour commencer la purification de l’ADNc.

Après avoir tourbillonné les échantillons pendant cinq secondes, centrifugez-les à 20 000 x g à température ambiante pendant trois minutes. Ensuite, transférez soigneusement la phase aqueuse contenant l’ADN dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ensuite, ajoutez trois volumes de 100 % d’éthanol pour précipiter l’ADN et le vortex pendant cinq secondes.

Incuber toute la nuit à 20 degrés Celsius. Le lendemain, centrifugez les tubes à 20 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Ensuite, lavez la pastille d’ADN avec 500 microlitres d’éthanol glacé à 70 % et centrifugez-la à 20 000 x g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez autant de surnageant que possible, en prenant soin de ne pas déloger la pastille. Ensuite, faites sécher la pastille à l’air libre pendant cinq à 10 minutes. Dissoudre la pastille d’ADN dans six microlitres d’eau sans nucléase.

Ensuite, ajoutez trois microlitres de colorant de chargement de formamide. Utilisez un kit de séquençage pour préparer une échelle de séquençage de nucléotides didésoxy avec l’amorce d’impression des orteils et la construction d’ADN codant pour l’ARN XIAP IRES. Ensuite, mélangez six microlitres de chaque réaction de séquençage avec trois microlitres de colorant de chargement de formamide.

Après avoir nettoyé et assemblé les plaques, versez le gel et insérez le peigne. Suite à la polymérisation du gel, assemblez l’appareil de séquençage et remplissez les réservoirs avec 1x TBE. Ensuite, pré-exécutez à 1500 volts pendant 15 minutes jusqu’à ce qu’une température de 55 degrés Celsius soit atteinte.

Chauffez tous les échantillons avec un colorant formamide à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, chargez un microlitre de chaque échantillon sur un gel de séquençage de polyacrylamide à 6 % et faites fonctionner le gel à 1500 volts pendant huit heures. Enfin, lisez les bandes en temps réel à l’aide d’un imageur fluorescent.

Cette méthode montre que la confirmation de l’ARN est essentielle à la formation du complexe d’initiation de la traduction. La transcription inverse du complexe de ribosomes de l’ARNm XIAP produit des empreintes d’orteils typiques de 17 à 19 nucléotides en aval d’AUG. Le mutant 5'PPT montre une formation d’empreinte d’orteil altérée.

Cependant, lorsqu’il est transcrit avec le 5' cap, la formation du complexe d’initiation se produit. De même, le mutant 3'PPT présente également une altération de la formation des empreintes d’orteils. Cependant, la transcription avec le 5'cap conduit à la formation d’un complexe d’initiation.

Le mutant double PPT hébergeant à la fois les mutations 5'PPT et 3'PPT est capable de former le complexe d’initiation sans le capuchon 5'. La formation de l’empreinte orteil est fortement altérée pour le codon de départ mutant en l’absence de RRL et de GMP-PNP et d’une queue Poly A. Les produits CDNA sont comparés à une échelle de séquençage de nucléotides didésoxy.

La bêta-globine humaine, ou ARNm HBB, ne montre aucune empreinte d’orteil en l’absence de la capsule 5'. Cependant, le complexe d’initiation se forme sur le 5'UTR coiffé de HBB, produisant des empreintes d’orteils de 16 à 18 nucléotides en aval d’AUG. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours, y compris la préparation des matrices de transcription in vitro et de l’ARN, si elle est effectuée correctement.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le sondage structurel peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la structure secondaire du type sauvage ou des variantes mutantes de l’IRES. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la traduction de l’ARNm pour explorer la traduction in vitro médiée par l’IRES. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’empreinte des orteils de l’ARNm de mammifère et d’analyser la formation des complexes d’initiation de traduction.

N’oubliez pas que l’acide-phénol, le phénol, le chloroforme, l’alcool isoamylique et l’acrylamide peuvent être extrêmement dangereux. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté lors de l’utilisation de ces réactifs.