Name: Injection de nanoparticules de Retroductal à la glande submandibulaire Murine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Apprenez l'injection rétroductale de nanoparticules polyériques à la glande submandibulaire murine. Cette méthode permet une administration directe contournant la circulation systémique pour étudier la biologie des glandes salivaires.

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Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Dental et recherche Craniofacial (NIDCR) et le National Cancer Institute (NCI) de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R56 DE025098 et UG3 DE027695 F30 CA206296. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce travail a été également soutenu par la NSF DMR 1206219 et de l’Innovation de l’AIRD en Oral Care Award (2016).
Nous tenons à remercier Jayne Gavrity pour son aide dans des expériences d’IVIS. Nous tenons à remercier Karen Bentley pour son entrée et l’assistance dans l’exercice de EM. Nous tenons à remercier Weng Pei-Lun pour son aide avec IHC. Nous tenons à remercier Matthew Ingalls pour son aide dans la préparation de la figure. Nous tenons à remercier le Dr Elaine Smolock et Emily Wu pour une lecture critique de ce manuscrit.

Toutes les procédures en vivo décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité Université sur les ressources animales à l’Université de Rochester, Rochester, NY.
1. préparation
<ol><li>Utilisez un tuyau de 32G cathéter intracrânienne avec incrustation de fil, couper 3 cm du tube pour former une extrémité biseautée, environ 45° à l’axe longitudinal. Confirmer que le fil soit au moins 1 cm de plus que le tube.</li>
	<li>Charge 50 µL de solution de nanoparticules LMFP (Figure 1), ou autre matériel d’injection, une seringue de Hamilton. Pour réduire la probabilité de barotraumatisme pendant l’injection, fixer la tubulure du cathéter, avec le stylet enlevé, à la seringue et expulser le volume mort.</li>
	<li>Inspecter la solution d’injection afin d’assurer que la nanoparticule est entièrement solvatés pour éviter l’obstruction canalaire après l’administration.</li>
	<li>Préparer la solution de l’atropine à 0,1 mg/mL. Remarque : Parce que l’atropine est sensible à la lumière et se dégrade au fil du temps, cette solution devrait être faite le jour de l’injection et abrie de la lumière jusqu'à ce que les administrés.</li>
</ol>2. accès et visualisation de Point d’entrée canalaire
<ol><li>Peser les souris C57/BL6 en utilisant une balance analytique.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue 0,5 mL avec aiguille 29 x ½", anesthésier la souris avec une solution saline stérile injectée par voie intrapéritonéale de xylazine kétamine et 10 mg/kg de 100 mg/kg. Passez à l’étape suivante lorsque la souris ne répond plus aux stimuli, qui survient généralement dans les 5 à 10 min après l’injection. Remarque : Cette procédure peut également être réalisée sous isoflurane, mais nécessitera un cône de nez personnalisé qui permet l’accès à la cavité buccale.</li>
	<li>Pour prévenir le dessèchement pendant la procédure, appliquer du lubrifiant sur les yeux et placez la souris dans une position couchée sur une scène personnalisée. Remarque : Pour maintenir des conditions appropriées pour procédure intra-buccaux, outils devraient être désinfectés ou stérilisés avant chaque utilisation.</li>
	<li>Ouvrir la cavité buccale en sécurisant les incisives maxillaires sur une poutre métallique et une bande élastique permet d’appliquer une tension vers le bas derrière les incisives mandibulaires (Figure 2 a).</li>
	<li>Aligner la souris sous le microscope à dissection, telle que la base de la mâchoire est visualisée.</li>
	<li>Afin d’élargir la bouche, utiliser un enrouleur acier incurvé, personnalisé pour appliquer une tension sur le plan bilatéral à la muqueuse buccale.</li>
	<li>Pour visualiser les papilles sous-mandibulaire, saisir et soulevez doucement la langue du plancher de la bouche avec une pincette émoussé. Remarque : Les papilles seront affiche comme deux protubérances pâles située sous la langue (Figure 2 b).</li>
	<li>Pour faciliter la visualisation et la manipulation plus loin dans la cavité buccale, placez le coton entre la langue et la muqueuse buccale.</li>
</ol>3. canalaire canulation et Placement de la ligne
<ol><li>Employer les fine pince courbée, saisir tubulure du cathéter avec l’encart de fil. Pour un contrôle manuel optimal pendant la canulation, aligner le tube avec la courbure de la pince (Figure 3 a).</li>
	<li>En utilisant le microscope à dissection, déplacer la pince et le fil dans le champ de vision. Remarque : Le fil doit dépasser de la tubulure.</li>
	<li>Exercez une légère pression sur la base d’une papille sous-maxillaire, en utilisant le fil encastré pour produire une perforation petite, superficielle, muqueuse (0,076 mm de diamètre) qui facilitera l’entrée plus tardive de la tubulure du cathéter (0,25 mm de diamètre). Cas de résistance, coupées fraîches conseils biseautés sur le tube et le médaillon de fil avec des ciseaux de dissection pointu.</li>
	<li>Suite à l’entrée, retirer le stylet et, en utilisant le microscope à dissection, confirment la présence de la salive sur le site de ponction. Évitez le mouvement énergique ou soudaine (retrait ou insertion) du stylet qui peut provoquer des saignements ou compromettre l’intégrité canalaire.</li>
	<li>Rétracter le stylet dans le tube (Figure 3 b).</li>
	<li>Afin d’assurer que tube d’injection s’adaptera dans un conduit de Wharton ouverture, insérer le tube contenant le stylet comme un guide rigide dans la ponction faite précédemment (Figure 2 C). Remarque : Si ne pas exécutés rapidement, gonflement local peut empêcher de ré-insertion.</li>
	<li>Pour empêcher la contre-pression de l’obstruction canalaire prolongée, retirer le tube. Inspecter pour vérifier qu’une ouverture, visible en microscopie, peut être vu dans la papille sous-maxillaire. En cas de saignement visible, retirer le stylet et retentez de l’étape 3.2 sur les papilles sous-maxillaire adverses.</li>
	<li>Sans bouger la souris, administrer une injection intrapéritonéale de la solution de l’atropine 1 mg/kg, pour réduire la salivation lors de la procédure. Attendre 5-10 min.</li>
	<li>Saisir l’extrémité de la tubulure de la seringue et l’insérer dans l’orifice en utilisant le microscope à dissection (Figure 3). Cas de résistance, couper une extrémité biseautée fraîche pour le tubage et la reattempt.</li>
	<li>Une fois que le tube est en place au sein de la papille sous-mandibulaire, avancer lentement 3-5 mm dans le conduit. Communiqué de la tubulure de la pince.</li>
	<li>Afin d’améliorer l’étanchéité entre le tube et la papille sous-mandibulaire, sécher l’interface en tamponnant doucement avec de la gaze pendant 1 min.</li>
	<li>Inspecter pour confirmer que la position du tuyau n’a pas changé pendant le séchage.</li>
</ol>4. injection
<ol><li>Injecter le matériau à un taux de 10 µL/min. inspecter pour confirmer que la souris reste sous sédation et ne montre pas de signes de détresse (Figure 2D). NOTE : Les Injections de 15 à 50 µL sont bien tolérées. Barotraumatisme peut entraîner l’injection de plus gros volumes.</li>
	<li>Suite à l’injection, maintenir la pression de la seringue pendant 5 min améliorer la rétention des matières dans SMG (Figure 4) et le canal de Wharton. Inspecter la papille sous-maxillaire périodiquement pour s’assurer que tube ne ferme pas l’orifice du canal artériel.</li>
	<li>À l’aide de pinces fines, saisir et retirer délicatement le tube les papilles sous-maxillaire. Remarque : Il est normal d’observer certains évacuation fluide de la papille.</li>
	<li>Supprimer l’enrouleur et le coton de la cavité buccale avant de passer la souris de la scène. Remarque : L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. En outre, assurez-vous que la souris n’est pas logée avec d’autres souris jusqu'à ce que complètement guéri.</li>
</ol>5. vérification et analyse
Remarque : An in vivo Imaging System (IVIS) peut être utilisé pour évaluer la rétention des nanoparticules fluorescent étiquetés après injection (comme indiqué 1 h et 24 h après l’injection dans la Figure 5).
<ol><li>Pour mieux visualiser un signal fluorescent au sein de la SMG à travers la peau, enlever la fourrure ventrale recouvrant le SMGs soit par rasage ou à l’aide d’un dépilatoires chimiques. Remarque : Après l’euthanasie, SMG tissu peut aussi être récolté, fixe (nuit à la paraformaldéhyde à 4 %) et souillé par immunohistochimie pour confirmer la persistance du NP fluorescent étiqueté un jour après l’injection (Figure 6).</li>
</ol>

<ol><li>Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Secretory+Disorders%2C+Inducing+Drugs%2C+and+Clinical+Management%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management.</a> International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).</li>
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<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Radiation-Induced+Salivary+Hypofunction+Following+hKGF+Gene+Delivery+to+Murine+Submandibular+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands.</a> Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Retroductal injection est critique pour la livraison de drogue localisé à la glande salivaire. Cette technique possède des applications dans le dépistage des agents thérapeutiques pour les conditions, y compris le syndrome de Sjögren et RIH9,10,28. Administration des médicaments directement dans le SMG par injection retroductal fournit un avantage clé sur une administration systémique dans son potentiel à réduire les effets hors...

Dysfonctionnement des glandes salivaires a plusieurs étiologies, y compris le syndrome de Sjögren, une perte de médiation auto-immune du tissu sécréteur fonctionnel et rayonnement induit hypoptyalisme (RIH), une commune séquelle de radiothérapie du cancer tête et du cou1. Perte de fonction salivaire en raison ou l’autre condition prédispose les individus à infections buccodentaires et systémiques, la carie, dysfonction digestive et déglutition, trouble de la parole et dépression majeure1,2,3. En conséquence, qualité de vie souffre considérablement, avec des interventions limitées à la palliation des symptômes plutôt que de guérir4. Afin d’étudier de nouveaux traitements en vivo, il est intéressant d’administrer les composés bioactifs directement à la glande salivaire.
Retroductal injection est une méthode utile pour livrer des composés bioactifs directement vers les glandes salivaires et de tester l’efficacité dans les maladies, blessures, ou en vertu de l’homéostasie tissulaire normale. Les trois glandes salivaires principales sont la glande parotide (PG), la sous-maxillaire (SMG) et la sublinguale (SLG), tous de quel vide dans la cavité buccale par l’intermédiaire de conduits excréteurs. L’anatomie de la murine SMG permet un accès direct par le biais de canulation du canal de Wharton, situé dans le plancher de la bouche sous la langue5. Après la canulation, solvatés médicaments peuvent être administrés directement à la SMG. Suite retroductal livraison, diffusion extra glandulaire est restreinte par la capsule de tissu environnant qui régit l’échange de documents avec entourant les structures6. Le SMG et sa gaine sont structurés de la même façon chez les humains et sont systématiquement accessibles au cours de la SMG chirurgie et sialoendoscopy7. Chez les humains et les souris, le PG est également accessible par l’intermédiaire de Sténon dans la muqueuse buccale8.
Dans les modèles murins de RIH, injection retroductal SMG a été utilisée pour livrer des produits thérapeutiques, y compris les facteurs de croissance, les cellules primaires, vecteurs viraux, cytokines et composés antioxydants pour moduler la réponse cellulaire à l’injure et réduire le les tissus des dommages5,9,10,11,12,13,14,15,16. Le plus notable succès clinique de retroductal injection est l’administration d’un vecteur adénoviral pour diriger l’expression d’un canal d’eau (aquaporine 1 ; AQP1) chez les patients ayant le rayonnement pour la tête et du cou, cancer du17.
Auparavant, nous avons développé et démontré l’efficacité d’un système de nanoparticules polymériques-siARN retroductally injecté pour protéger la glande salivaire de RIH11,18,19,20. Ici, dans le prolongement de nos travaux antérieurs, nous démontrons notre protocole pour l’injection de SMG retroductal à l’aide d’une NANOPARTICULE fluorescent étiquetée (NP) capable de charger et livrer autrement peu solubles médicaments21,22, 23.
Nous avons synthétisé la NP d’un copolymère à deux blocs de poly (styrène-alt-maléique anhydride)-b-poly(styrene) (LMFP) par le biais de polymérisation de fragmentation (RAFT) chaîne addition réversible, comme décrit plus haut21. Grâce à l’échange de solvant, ces polymères spontanément s’auto-assembler en structures NP micelle avec un hydrophobe intérieur et hydrophile extérieur21. Les NPs sont étiquetés avec un fluorophore Texas-rouge pour permettre la vérification de la livraison de NP dans les glandes sans pour autant sacrifier l’animal. Vivre l’imagerie animale et immunohistochimie SMG est affiché à 1 h et 1 jour après l’injection.
Cette mise à jour et protocole reproductible canulation devrait permettre à d’autres réaliser l’injection de retroductal. Gageons que cette technique raffinée deviendra critique pour des études in vivo et développement thérapeutiques24,25.

<table><tbody><tr><td>Chlorhydrate de pilocarpine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpine</td></tr><tr><td>Student Vannas Ciseaux à ressort</td><td>Outils de sciences fines</td><td>91500-9</td><td>Ciseaux à ressort pour trachéotomie</td></tr><tr><td>Solution saline stérile</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Saline</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Pince</td></tr><tr><td>incurvée Dumont #5 Forceps</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-10</td><td>Pince droite</td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Outils de science fine</td><td>11000-12</td><td>Pince émoussée</td></tr><tr><td>Ciseaux fins - Carbure de tungstène</td><td>Outils de science fine</td><td>14568-09</td><td>Ciseaux de dissection</td></tr><tr><td>Microhématocrite Tubes capillaires héparinés</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Tubes capillaires</td></tr><tr><td>Lubrifiant Pommade</td> <td>pour les yeuxRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Anticorps</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Statistical Software</td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Applicateur pour pommade oculaire</td></tr><tr><td>0,5cc Seringue à insuline, 29G x 1/2"</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Seringue pour injection intrapéritonéale</td></tr></tbody></table>

injection de nanoparticules de retroductal à la glande submandibulaire murine

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Deux objectifs communs de la glande salivaire thérapeutique sont la prévention et le traitement des dysfonctions tissulaires suivant une auto-immunes ou rayonnements des blessures. En fournissant localement des composés bioactifs vers les glandes salivaires, teneurs plus élevées en tissu peuvent être réalisées en toute sécurité par rapport à l’administration systémique. En outre, hors tissu cible peuvent être réduites considérablement les effets d’extra glandulaire accumulation de matière. À cet égard, l’injection de retroductal est une méthode largement utilisée pour l’étude des glandes salivaires biologie et la physiopathologie. Retroductal administration de facteurs de croissance, les cellules primaires, vecteurs viraux et médicaments à petites molécules a été démontrée à l’appui de la glande dans le cadre de la blessure. Nous avons déjà montré l’efficacité d’une stratégie de nanoparticules-siARN retroductally injecté pour maintenir la fonction de la glande après irradiation. Ici, une méthode très efficace et reproductible pour administrer des nanomatériaux pour la glande submandibulaire murine par canal de Wharton est détaillée (Figure 1). Nous décrivons accéder à la cavité buccale et décrivent les étapes nécessaires au canal de Wharton cannulate, outre les observations servant de contrôles qualité tout au long de la procédure.

Retroductal injection peut être utilisée pour administrer NPs à la SMG murin (Figure 1). Ici, nous livrons 50 µg LMFP NPs étiqueté avec Texas Red fluorophore.
Positionnement correct de la souris permet l’accès facile et visualisation du plancher de la bouche (Figure 2 a-B). Les papilles sous-maxillaires sont identifiées comme deux protubérances charnues...

Locaux de médicaments vers les glandes sous-maxillaires est intéressant en biologie de glande salivaire de compréhension et pour le développement de nouvelles thérapeutiques. Nous présentons un protocole d’injection retroductal mise à jour et détaillées, destiné à améliorer la précision de livraison et de la reproductibilité expérimentale. L’application présentée ici est la livraison de nanoparticules polymériques.

Injection de nanoparticules de Retroductal à la glande submandibulaire Murine

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des nanomatériaux directement à la glande sous-mandibulaire murine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’administrer directement des composés à la glande sous-mandibulaire tout en contournant la circulation systémique. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la dysfonction des glandes salivaires après une radiothérapie pour une tumeur maligne de la tête et du cou.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent être mises au défi par la localisation et la canulation du canal sous-mandibulaire pendant que l’animal est sous sédation. Pour commencer cette procédure, coupez trois centimètres d’un tube de cathéter intracrânien de calibre 32 avec un fil inséré pour former une extrémité biseautée à environ 45 degrés par rapport à l’axe long. Vérifiez que le fil est au moins un centimètre plus long que le tube.La création d’un bord biseauté au tube facilitera la canulation ductale. Si le tube est plié pendant la procédure, un nouveau bord biseauté doit être coupé. Ensuite, chargez 50 microlitres de solution de nanoparticules PSMA ou d’un autre matériau d’injection d

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Un protocole pour la canulation de la glande salivaire sous-maxillaire de la souris via le conduit de la Wharton est décrite. Pour cette expérience, la solution de bleu trypan est utilisé comme un teinturier de démontrer comment cette technique délivre effectivement des perfusions dans la glande cible, et de suggérer la fiabilité de cette nouvelle approche comme un potentiel clinique des médicaments / thérapie cellulaire pour la régénération des glandes salivaires.

Canulation de la glande salivaire sous-maxillaire de la souris via le conduit de Wharton

Cette vidéo décrit une technique d’injection intracanalaire où nous administrons un mélange d’injection dans les canaux des glandes mammaires de souris.

Injection intracanalaire : administration du mélange d’injection dans les canaux de la glande mammaire de la souris

La vidéo présente une technique d’injection guidée par ultrasons pour l’administration de médicaments thérapeutiques dans les glandes salivaires d’un patient humain.

Injection guidée par ultrasons de médicaments thérapeutiques dans les glandes salivaires humaines

Microscopie intravitale est un outil puissant qui permet l'imagerie de divers processus biologiques chez les animaux vivants. Dans cet article, on présente un procédé détaillé pour l'imagerie de la dynamique des structures sous-cellulaires, telles que les granules de sécrétion, dans les glandes salivaires des souris vivantes.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l'injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules.

Injection intra-canalaire pour localisée Drug Delivery de la glande mammaire de souris

Les ganglions lymphatiques sont les tissus immunologiques qui orchestrent la réponse immunitaire et constituent une cible critique pour les vaccins. Des biomatériaux ont été utilisés pour mieux cibler les ganglions lymphatiques et contrôler l’administration d’antigènes ou d’adjuvants. Cet article décrit une technique combinant ces idées pour injecter des particules de polymère biocompatibles dans les ganglions lymphatiques.

Injection intra-lymphatique de particules de polymère biodégradables

Hypofonction des glandes salivaires, un effet indésirable majeur de la radiothérapie de la tête et du cou, diminue la qualité de vie d’un patient. La démonstration de l’efficacité de nouvelles thérapies dans des modèles animaux est une condition préalable à la transition clinique. Ce protocole décrit l’administration rétroductale et l’irradiation locale des glandes sous-mandibulaires du rat.

Retroductal Submandibulaire Gland instillation et Localized Fractionnée Irradiation dans un modèle de rat de salivaire Hyposécrétion

Les auteurs décrivent un protocole pour chirurgicalement exposer et stabiliser les glandes salivaires sous-maxillaires murine intravitale imagerie microscopie intravitale verticale. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres glandes exocrines de la tête et la région du cou de la souris et autres petits rongeurs.

Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale

Les glandes salivaires ont été proposées comme site cible tissulaire pour la thérapie génique, en particulier dans le domaine de la vaccination par transfert de gènes. Nous démontrons l’administration de gènes dans un modèle de primate non humain utilisant une perfusion parotide rétrograde.

Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

Dans le présent protocole, la fonction de barrière endothéliale de la glande sous-maxillaire (SMG) a été évaluée en injectant différents traceurs fluorescents pondérés moléculairement dans les veines angulaires de modèles animaux testés in vivo sous un microscope à balayage laser à deux photons.

In vivo Détection de perméabilité vasculaire dans la glande sous-maxillaire de souris

L’imagerie par immunofluorescence est limitée par la capacité d’observer des processus biologiques complexes et dépendants du temps en un seul instantané dans le temps. Cette étude décrit une approche d’imagerie en direct menée sur des coupes de glandes sous-maxillaires de souris découpées avec précision. Cette approche permet d’observer en temps réel les interactions cellule-cellule au cours de l’homéostasie et des processus de régénération et de réparation.

Interrogation des interactions cellule-cellule dans la glande salivaire par imagerie ex vivo de cellules vivantes

Apprenez l'injection rétroductale de nanoparticules polyériques à la glande submandibulaire murine. Cette méthode permet une administration directe contournant la circulation systémique pour étudier la biologie des glandes salivaires.

Injection de nanoparticules de Retroductal à la glande submandibulaire Murine

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