Murine salivaire évaluation fonctionnelle par l’intermédiaire de Pilocarpine Stimulation suit fractionnés rayonnement

Nous présentons une approche détaillée pour effectuer le prélèvement de salive, y compris la trachéotomie murin et l’isolement des trois glandes salivaires principales.

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la fonction salivaire murine par stimulation par pilocarpine. Cette méthode peut être appliquée à la fois pour comprendre l’histoire naturelle du dysfonctionnement des glandes salivaires et pour tester l’efficacité de toute intervention potentielle. Notre protocole fournit une plate-forme modulaire de techniques, y compris la trachéotomie murine, le prélèvement de salive et la dissection de la glande.

Cliniquement, cette technique a des implications pour les études évaluant soit la sécheresse buccale, soit la surproduction de salive. Et il peut également être appliqué à d’autres procédures intra-orales nécessitant une gestion des voies respiratoires. Les personnes qui apprennent pour la première fois ce protocole peuvent trouver la trachéotomie et la dissection de la glande difficiles.

Nous espérons que cette vidéo vous aidera à apprendre la bonne technique d’isolation des glandes, ainsi que l’anatomie pertinente. À l’aide d’une balance analytique, pesez 20 milligrammes de pilocarpine, puis dissolvez-la dans 2 millilitres de solution saline stérile. Les solutions de pilocarpine doivent être fraîches le jour de leur utilisation.

Ensuite, pesez tous les récipients de collecte pour la procédure et pesez la souris pour la doser avec précision. Utilisez la souche C57 black 6. Après avoir anesthésié la souris et confirmé l’anesthésie par le pincement de l’orteil, appliquez la pommade ophtalmique à l’aide d’un applicateur à bout de coton et positionnez la souris en décubitus dorsal.

Ensuite, fixez ses membres, son nez et sa queue avec du ruban chirurgical. Ensuite, nettoyez et mouillez le cou à l’aide d’une lingette imbibée d’alcool. Maintenant, utilisez une pince pour pincer la ligne médiane du cou ventrale et, avec des ciseaux, faites une petite coupe superficielle.

Ensuite, guidez les ciseaux dans l’ouverture et ouvrez lentement les lames sous-cutanées pour séparer les plans tissulaires. Tout en gardant la peau surélevée, faites soigneusement une autre incision à un centimètre sous la bouche. Ensuite, faites deux incisions latérales, inférieure et supérieure à la première coupe.

Maintenant, à l’aide d’une pince, séparez doucement la peau pour accéder à l’anatomie de la tête et du cou. Procéder à l’aide d’un microscope de dissection à un grossissement de huit fois. À l’aide d’une pince fine, soulevez doucement la glande sous-maxillaire pour exposer les quatre muscles infrahyoïdes recouvrant la trachée.

Évitez de déchirer ou de perturber le système vasculaire ou les canaux excréteurs environnants. Si vous recueillez la salive de plus d’une souris, préparez toutes les souris à ce stade avant de continuer. Une personne peut gérer jusqu’à cinq souris simultanément.

Maintenant, pour continuer la chirurgie, utilisez de petits ciseaux de dissection pour retirer la partie médiale des muscles de la sangle tout en restant près de la ligne médiane. Retirez juste assez de muscle pour visualiser la trachée et empêcher les muscles d’interférer avec la procédure. Lors de la dissection des muscles de la sangle, il est particulièrement important d’éviter d’entailler les vaisseaux voisins.

Une entaille peut entraîner une déplétion volémique secondaire à une hémorragie, et ainsi rendre la pilocarpine inefficace pour l’induction de la sécrétion salivaire. Pour continuer, réfléchissez les muscles de la sangle loin de la trachée pour visualiser le larynx, la trachée et la glande thyroïde. Assurez-vous que la trachée est exempte de tissu sus-jacent.

Enfin, faites une incision horizontale dans la trachée, inférieure à la thyroïde, à l’aide de petits ciseaux de dissection, et non d’un scalpel. Assurez-vous que ces voies respiratoires sont perméables et exemptes de liquide. Pour le prélèvement de salive, retirez d’abord le ruban adhésif près de la bouche, puis inclinez la scène de dissection à 45 degrés pour diriger le flux de salive vers le crâne.

Ensuite, utilisez une seringue de 0,5 millilitre avec une aiguille d’un demi-pouce de calibre 29 pour administrer une injection intrapéritonéale de pilocarpine. Ensuite, démarrez une minuterie. Si plusieurs souris sont injectées, travaillez rapidement avec l’aide d’un assistant.

Ensuite, utilisez une pince standard pour ouvrir la bouche et mettre un tube capillaire en position. Une perle de salive devrait se former en quelques minutes. Placez une extrémité du tube capillaire dans la salive et placez l’autre extrémité dans un tube collecteur positionné sous l’étape de dissection.

Au besoin, repositionnez le tube pour aspirer la salive. Évitez d’entrer en contact avec les muqueuses, car le mucus pourrait obstruer l’entrée. Prélever la salive pendant 12 minutes à partir du moment de l’injection.

La stomie doit rester dégagée tout au long de la stomie. Si la fonction salivaire de la souris est déprimée, transférez le liquide de sa bouche vers le tube de prélèvement à l’aide d’une micropipette P200. Utilisez toujours un tube ou une pointe différente pour chaque souris.

Après avoir terminé toutes les collectes, pesez à nouveau les récipients de collecte. Après avoir euthanasié la souris par asphyxie au dioxyde de carbone, faites une thoracotomie soigneuse et placez la souris en décubitus dorsal sur la platine du microscope de dissection. Ensuite, repositionnez les glandes au site chirurgical d’origine.

Sous un grossissement de huit fois, visualisez les glandes principales, le PG, le SMG et le SLG. Le PG est diffus et est positionné latéralement au SMG et au SLG. Disséquez d’abord le PG.

Saisissez la queue du PG à l’aide d’une pince, en l’éloignant des structures sous-jacentes. Construisez jusqu’à une tension douce, puis coupez la tête du PG avec des ciseaux de dissection. Ensuite, percez la capsule entourant les pistolets-mitrailleurs avec des pinces.

Ensuite, séparez doucement le pistolet-mitrailleur gauche et droit. Ensuite, libérez la face dorsale du SMG du tissu non glandulaire environnant. Pour retirer le SMG, serrez le conduit de Wharton avec une pince et coupez le conduit avec des ciseaux de dissection.

Le SLG est dans l’aspect supérolatéral du SMG. Pour séparer les deux glandes, saisissez chacune d’elles avec des pinces distinctes et positionnez une dent dans le plan tissulaire entre les glandes. Ensuite, augmentez lentement la tension et les deux glandes se sépareront progressivement.

Après avoir isolé le tissu glandulaire, pesez à nouveau immédiatement les vaisseaux collecteurs. Comme contrôle positif pour l’analyse, des SMG de souris ont été irradiés et comparés à des témoins. Deux semaines après quatre fractions de radiation à 6,85 gris, la fonction salivaire a considérablement diminué.

La sécrétion totale de salive et la sécrétion normalisée au poids humide de la glande ont montré que la capacité fonctionnelle salivaire était réduite, démontrant la sensibilité du test. Ensuite, les pistolets-mitrailleurs ont été disséqués. Ils pouvaient être réparés, sectionnés et teints.

La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a été utilisée pour comparer l’architecture grossière avec ou sans stimulation par pilocarpine. De plus, les tissus ont été immunomarqués pour un transporteur membranaire de chlorure de sodium-potassium, NKCC1. Dans les deux colorations, les tissus présentaient une morphologie cellulaire similaire, indépendamment de la stimulation par la pilocarpine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la fonction salivaire murine par stimulation pilocarpine. Une fois maîtrisée, cette technique complète peut être réalisée en moins d’une heure. Cette méthode permet aux chercheurs en salive de collecter de la salive entière pour quantifier la fonction des glandes et d’isoler proprement et de manière reproductible les trois principales glandes salivaires.

Lors de la tentative de cette procédure, en particulier avec plus d’une souris, il est important d’agir rapidement et de mettre fin à la collecte de salive au bon moment. À la suite de cette procédure, la composition et l’activité enzymatique peuvent être déterminées à partir de la salive entière, tandis que les tissus glandulaires peuvent être traités pour l’histologie ou l’immunomarquage.