Name: Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Apprenez la livraison virale de guides CRISPR/Cas9 dans la prostate murine pour modifier l'expression génique. Cette méthode permet l'édition rapide de gènes multiples et l'étude du cancer de la prostate in vivo.

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Monsieur a été financée par une bourse de la société danoise de cancer (R146-A9394-16-S2). MFB et MKT étaient financés par AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). M. et MFB ont cofinancé par la Graduate School, la santé, AU. Le laboratoire E.F.W. est pris en charge par des subventions du ministère espagnol de l’économie (SAF2015-70857, cofinancé par le FEDER-UE) et un ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Nous tenons à remercier Liliana Fajardo Mellor (gènes, le développement et la maladie ; National Cancer Research Center) pour une lecture critique du manuscrit.

Ce protocole implique une intervention chirurgicale chez les souris de laboratoire. Toutes les expériences animales doivent être individuellement examinés et approuvés par un Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier. Car l’approche repose sur la survie et de récupération de l’animale, s’assurer anesthésie appropriée, gestion de la douleur et un environnement chirurgical aseptique en tout temps. Utiliser un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie pendant l’intervention et jusqu'à la guérison de l’anesthésie.
1. à partir de considérations
<ol><li>Selon le virus utilisé, exigences titre différentes peuvent s’appliquer ; diluer le virus en conséquence. Remarque : Dans cet exemple, un virus Adeno-associé, dilué dans du PBS est injecté à un titre de 1 x 1012 UI/mL. Le virus a sérotype 9 et contient le guide RNA Pten et expression de la protéine Cre sous un promoteur d’ubiquitine (Figure 1). Perte du gène Pten augmenté pAKT et la prolifération de l' épithélium prostatique13.</li>
	<li>Utilisez la souris mâles à l’âge de 8 semaines au moment de la chirurgie pour assurer le développement adéquat de la prostate. NOTE : Souris montrés dans cette expérience sont Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin souris C57BL/6J fond12 (Figure 1).</li>
	<li>Fraîchement préparer un mélange d’anesthésie générale et si possible garder stérile. Remarque : Pour une meilleure récupération animale après la chirurgie, antidote de l’anesthésie est fortement recommandé.<ol>
<li>Pour préparer un volume total de 5 mL d’anesthésique, mélanger 0,15 mL médétomidine chlorhydrate (1 mg/mL), midazolam 0,4 mL (5 mg/mL) et 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) avec 4,2 mL eau saline stérile. NOTE : Anesthésie autre méthodes, telles qu’isoflurane inhalable, peuvent être utilisées conformément aux directives de soins institutionnels des animaux.</li>
		<li>Pour inverser l’effet de médétomidine chlorhydrate après chirurgie, mélanger Atipamézole 0,1 mL (5 mg/mL) avec 4,9 mL eau saline stérile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un milieu aseptique chirurgical de stérilisation et de désinfection appropriées. Instruments chirurgicaux de autoclave avant utilisation.</li>
</ol>2. virus-livraison à la Prostate Murine
<ol><li>Anesthésier l’animal par injection intrapéritonéale avec une seringue stérile 1 mL et une aiguille de 27 x ½". Utiliser une dose d’anesthésie de 0,01 mL/g de poids corporel. Si la procédure dure plus de 30 min, maintenir l’anesthésie en injectant la dose de 1/3 de la mise en marche toutes les 30 minutes.</li>
	<li>Examiner la profondeur anesthésique en évaluant la relaxation musculaire, retrait de pédale et réflexes palpébrales. Lorsqu’on observe de perte des réflexes, se raser le bas ventre de l’animal.</li>
	<li>Couvrir soigneusement les yeux de l’animal avec l’Onguent ophtalmique vétérinaire, à l’aide d’un coton-tige stériles pour prévenir la cécité due à l’absence de réflexe cornéen.</li>
	<li>Essuyez l’abdomen rasé avec 70 % d’éthanol et 10 % polyvidone iodée pour désinfecter la zone chirurgicale. Frotter la zone chirurgicale du centre de la zone chirurgicale vers la périphérie.</li>
	<li>Effectuer une incision verticale de la peau à la basse-abdominale médiane d’environ 1 cm à l’aide de ciseaux chirurgicaux stérile.</li>
	<li>Soulevez le péritoine en utilisant une pince pointe fine pour éviter d’endommager les organes qui permettent de poser sous. Faites une incision < 8 mm à l’aide de ciseaux chirurgicaux par le péritoine. NOTE : Contrairement à l’homme, la glande de la prostate un rongeur se compose de quatre lobes distincts. Le lobe antérieur est attaché à la vésicule séminale.</li>
	<li>Déplacez doucement le tissu graisseux côté pour découvrir la vésicule séminale. À l’aide d’une pince anneau, soulever délicatement la vésicule séminale, jusqu'à ce que la prostate antérieure peut être identifiés (Figure 1).</li>
	<li>Injecter un volume total de 30 µL de solution de virus (3 x 1010 particules virales) dans l’épithélium antérieure de la prostate à l’aide d’une seringue d’insuline de 0,5 mL avec une aiguille de 30 x 8 mm. Minimiser les fuites et s’assurer que le liquide est absorbé dans les tissus, formant une petite bulle. Replacez la vésicule séminale dans la cavité abdominale.</li>
	<li>Suture du péritoine avec 2-3 points interrompus simples à l’aide de sutures résorbables 6-0 avec un 13 mm, 3/8 cercle et une aiguille à pointe conique.</li>
	<li>Agrafez la peau avec 3 agrafes stérile 4,8 x 6,5 mm, soulevant la peau avec une pince pour éviter d’endommager le péritoine.</li>
	<li>Pour une meilleure récupération, appliquez l’antidote de l’anesthésie en dose de 0,01 mL/g de poids corporel par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue stérile 1 mL et une aiguille de 27 x ½". Placez soigneusement le dos animal dans sa cage.</li>
</ol>3. après chirurgie
<ol><li>Gardez la cage avec la souris qui a été opéré sur un coussin chauffant pendant 1 h après l’intervention, pour éviter l’hypothermie jusqu'à ce que complètement guéri. Si l'on applique l’antidote, l’animal devrait être éveillé quelques minutes après l’injection.</li>
	<li>Surveiller les animaux tous les jours pour les indications de la guérison et la douleur approprié. Si nécessaire, administrer les antalgiques supplémentaires conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux.</li>
	<li>Retirez les clips de peau après 4-5 jours, une fois que la plaie est fermée.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour modifier l’expression des gènes dans le lobe antérieur de la prostate murine par injection de virus, en créant un nouveau modèle de souris puissante pour cancer de la prostate (Figure 2). L’administration réussie d’un adénovirus a été décrite par Leow et coll. 20058. Nous avons déjà montré comment un adénovirus codant pour une protéine de recombinase Cre peut remplacer des croisements fastidieux d’un allèle d...

Détection et le traitement du cancer de la prostate ont considérablement amélioré au cours de la dernière décennie. Pourtant, l’incidence du cancer de la prostate augmente, l’espérance de vie à la suite. Avec environ 1,1 millions nouveaux cas dans le monde entier, il est parmi les causes les plus fréquentes de décès liés au cancer chez les hommes 1. Cancer de la prostate est lent dans son développement, mais lorsque le cancer a progressé à un stade avancé métastatique, le pronostic est médiocre en raison des possibilités de traitement limitée. Jusqu’ici, seulement quelques gènes ont été identifiés comme les pilotes courants dans ce cancer, et son hétérogénéité et multifocality empêche la détection des biomarqueurs et maladie targetable pilotes2,3.
Les techniques classiques de production edged sont souvent affaiblies par leur complexité, les frais en temps opportun et coûts. Modèles knock-out conditionnel ont été employé couramment pour étudier les gènes candidats de cancer de la prostate, qui donnent lieu à une létalité embryonnaire lorsque inactivés dans les cellules germinales4. Les modèles plus courants comportent une recombinase de Cre spécifique de la prostate conduit par soit un Probasin mis à jour le5 ou un promoteur de6 PSA intégrés dans le GEMM de croisement supplémentaire. Dans ces modèles, le gène d’intérêt est ciblé dans la plupart des cellules épithéliales prostatiques, générant une hyperplasie dans l’organe entier, ce qui peut nuire à l’animal de fonction urinaire7.
Livraison viral de la protéine Cre par injection dans le lobe antérieur de la prostate murine peut résoudre ce problème en ciblant seulement quelques cellules8. Pré-requis techniques de laboratoires, d’expertise et objectifs tenant compte, les avantages de la méthode d’un large éventail de variations possibles. Les approches réussies utilisant des adénovirus ciblant JunB et Pten9 ou Lentivirus ciblant le gène Pten et Trp5310 auraient dû être divulgués parmi d’autres. Ajout de transgènes, tels que de la luciférase, la construction virale ou le GEMM permettra en outre une surveillance non invasive de la progression de la maladie par l’intermédiaire de bioluminescence imagerie11.
Génome montage basé sur la technologie CRISPR/Cas9 révèle une occasion nouvelle et rapide pour étudier le cancer grâce à la génération rapide des débouchures somatique12. Livraison virale d’ARN guide unique (sgRNAs) dirigé vers le lobe antérieur de la prostate murine établit un modèle physiologiquement plus pertinent de cancer de la prostate. Par ce moyen, cellules individuelles porteuses de mutations choisies peuvent former des clones capables d’expansion et d’invasion. En outre, utilisation du guide ARN pour plusieurs gènes cibles va générer des clones de cellules avec des altérations dans différents gènes. Cela permettra l’hétérogénéité tumorale et une pression de sélection naturelle sur la progression du cancer, qui peut révéler l’importance de chaque modification génique ou mécanismes épistatiques.
Nous présentons ici une méthode pour délivrer des particules virales à la prostate murine pour altération de l’expression génique. Par une petite incision abdominale, la murin lobe antérieur de la prostate est exposé et les particules virales sont injectées dans le lobe. Cinq jours après la chirurgie, chirurgies clips peuvent être retirés de la peau et le cancer prostatique peut être analysé de 8 semaines après. Dans l’ensemble, il s’agit d’une procédure rapide et rentable, qui a peu d’impact sur la souris et permet la plus grande tumeur de développer sans compromettre la souris.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 seringue à insuline</td><td>BD</td><td>324825</td><td>pour injection de virus</td>1</tr><tr><td>ml seringue</td><td>BD</td><td>300013</td><td>pour injection d’anesthésie</td></tr><tr><td>30 G 1/2' ' aiguille</td><td>BD</td><td>304000</td><td>pour l’injection d’anesthésie</td></tr><tr><td>6-0 Suture Polysorb</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>pour fermer le péritoine</td></tr><tr><td>Champ de chirurgie stérilisé jetable</td><td>plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussin de préparation à l’iode Povidone Fisher</td><td>Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Parage machine</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>pour raser l’abdomen</td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Needle Holder</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif étroit</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince à anneau</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Système de clip de plaie Poignée avec clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>pour fermer la peau</td></tr><tr><td>Système de clip de plaie Remover</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Différents modèles ont été utilisés</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisédan</td><td></td><td></td><td>obtenu de l’animalerie</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>obtenu de l’animalerie</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>obtenu de l’animalerie</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtenu de l’animalerie</td></tr><tr><td>100 % Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Pommade oculaire</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>plusieurs fournisseurs</td><td></td><td>virus utilisé dans ce protocole est une production interne</td></tr><tr><td>d’anticorps pAKT</td><td>CST</td><td>4060</td><td>utilisé 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>utilisé 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

livraison de virus de crispr guides pour la prostate murine pour modifications géniques

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Avec une incidence croissante du cancer de la prostate, l’identification de nouveaux pilotes de tumeur ou modulateurs est cruciale. Modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) pour cancer de la prostate sont entravés par l’hétérogénéité tumorale et sa dynamique de microévolution complexes. Modèles murins de cancer de la prostate traditionnels comprennent, entre autres, la lignée germinale et masquages conditionnels, transgénique expression d’oncogènes et des modèles de xénogreffes. Génération de mutations de novo dans ces modèles est complexe, fastidieux et coûteux. En outre, la plupart des modèles traditionnels cible la majorité de l’épithélium de la prostate, tandis que le cancer de la prostate humain est bien connu d’évoluer comme un événement isolé dans un petit sous-ensemble de cellules. Précieux modèles doivent simuler non seulement de début de cancer de la prostate, mais aussi de progression vers la maladie avancée.
Nous décrivons ici une méthode pour cibler quelques cellules de l’épithélium de la prostate par transduction des cellules par des particules virales. La livraison d’un virus machiné pour la prostate murine permet l’altération de l’expression génique dans l’épithélium de la prostate. Quantité et le type de virus par les présentes définira le nombre de cellules ciblées pour modifications géniques de transduction quelques cellules pour le déclenchement du cancer et nombreuses cellules pour la thérapie génique. Par injection à la chirurgie dans le lobe antérieur, distale de la voie urinaire, la tumeur dans ce modèle peut se développer sans nuire à la fonction urinaire de l’animal. En outre, en ciblant uniquement un sous-ensemble de cellules épithéliales prostatiques la technique permet une expansion clonale de la tumeur et imite donc tumorales humaines initiation, progression, ainsi que l’invasion à travers la membrane basale.
Cette nouvelle technique constitue un modèle de cancer de la prostate puissant avec pertinence physiologique améliorée. Souffrance animale est limitée, et puisqu’aucune reproduction supplémentaire n’est requise, nombre d’animaux dans l’ensemble est réduit. Dans le même temps, l’analyse des voies et de nouveaux gènes candidats est accélérée, qui à son tour est plus rentable.

Afin d’évaluer la prestation de virus à la prostate murine, les échantillons ont été analysés trois mois après la chirurgie. Le Rosa26-LSL-Cas9-EGFP souris12 express GFP dans des cellules qui ont été exposés à la Cre protéine exprimée par le virus. Les échantillons de la prostate ont été examinés avec une microscopie à fluorescence pour cerner avec signal GFP (Figure 2 a). Le signal GFP indique l’activité Cre dans l’épithélium de la pr...

Ce protocole décrit une méthode nouvellement créée pour la livraison de virus à la prostate murine. Utilisant la technologie CRISPR/Cas9, surexpression du gène ou livraison recombinase Cre, la technique permet l’orthotopic altération de l’expression génique et implémente un modèle de souris roman pour cancer de la prostate.

Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

L’objectif global de cette intervention chirurgicale est de modifier l’expression des gènes dans la prostate murine par l’administration virale de guides CRISPR Cas9 pour l’induction du cancer de la prostate. Cette méthode peut aider à répondre à de nouvelles questions en biologie du cancer de la prostate en ce qui concerne l’analyse et la validation de nouveaux gènes dans un cadre in vivo. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet l’édition rapide de plusieurs gènes en ne ciblant qu’un sous-ensemble des cellules prostatiques, comme on le voit dans le scénario humain.Quelqu’un qui est nouveau dans la procédure peut avoir des difficultés au début en raison de la taille de l’organe et de la précision nécessaire pour une réalisation chirurgicale réussie. Pour préparer fraîchement un volume total de 5 millilitres d’anesthésique, mélangez 0,15 millilitre d’un mg par millilitre de chlorhydrate de médétomidine, 0,4 millilitre de 5 mg par millilitre de midazolam et 0,25 millilitre de 10 mg par millilitre de butorphénol. Ensuite, ajoutez 4,2 millilitres d’eau saline stérile.Pour inverser les effets du chlorhydrate de médétomidine après la chirurgie, mélangez 0,1 millilitre de 5 mg par millilitre d’atipamézole avec 4,9 millilitres d’eau saline stérile comme antidote anesthésique. Préparez un environnement chirurgical aseptique par une désinfection et une stérilisation appropriées et autoclavez les instruments chirurgicaux. Pour administrer le virus à la prostate, après avoir anesthésié une souris mâle de huit semaines selon le protocole textuel ; Examinez la profondeur de l’anesthésique en évaluant la relaxation musculaire, le retrait de la pédale et les réflexes palpables.Lorsqu’une perte de réflexes est observée, rasez le bas-ventre de l’animal. À l’aide d’un coton-tige stérile, couvrez soigneusement les yeux de l’animal avec une pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la cécité causée par la xérophtalmie. Ensuite, utilisez 70 % d’éthanol et 10 % de profournine iode pour essuyer l’abdomen rasé afin de désinfecter la zone chirurgicale.Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faites une incision cutanée verticale d’environ un centimètre au niveau de la ligne médiane abdominale basse. Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, soulevez le péritoine pour éviter d’endommager les organes qui se trouvent en dessous ; et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire soigneusement une incision de huit millimètres ou moins à travers le péritoine. Écartez doucement le tissu adipeux pour découvrir la vésicule séminale.Ensuite, à l’aide d’une pince à anneau, soulevez soigneusement la vésicule séminale jusqu’à ce que la prostate antérieure puisse être identifiée. Maintenant, avec une seringue à insuline de 0,5 millilitre et une aiguille de calibre 30 de 8 millimètres ; Injecter un volume total de 30 microlitres de solution virale dans l’épithélium antérieur de la prostate. Minimisez les fuites et assurez-vous que le liquide est absorbé dans le tissu, formant une petite bulle.Ensuite, replacez la vésicule séminale dans la cavité abdominale. Pour s’assurer que le liquide est absorbé dans le tissu en une petite bulle et sans fuite, assurez-vous d’injecter parallèlement à la vésicule séminale et en suivant la forme du lobe antérieur de la prostate. À l’aide d’une aiguille à pointe conique et d’un cercle 3/8 de 13 millimètres, suturez le périnée avec deux à trois points de suture simples interrompus de suture résorbable 6-0.Ensuite, lifting de la peau à l’aide d’une pince pour éviter d’endommager le péritoine ; Agrafez la peau avec trois pinces stériles de 4,8 par 6,5 millimètres. Pour une meilleure récupération après la chirurgie, utilisez une seringue stérile de 1 millilitre et une aiguille de calibre 27 par 1/2 pouce pour administrer l’antidote anesthésique à une dose de 0,1 millilitre par gramme de poids corporel par injection intrapéritonéale. Ensuite, remettez soigneusement l’animal dans sa cage.Gardez la cage sur un coussin chauffant pendant une heure après l’intervention pour prévenir l’hypothermie jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. L’animal doit se réveiller quelques minutes après l’injection. Continuez à surveiller et à traiter l’animal quotidiennement selon le protocole textuel.Et, lorsque la plaie s’est refermée, retirez les pinces cutanées. Pour évaluer l’administration du virus à la prostate murine, des échantillons ont été analysés trois mois après la chirurgie. Comme le montre ici, les souris utilisées dans cette étude ont exprimé la GFP dans des cellules qui ont été exposées à la protéine Cree exprimée par le virus.Le signal GFP montre l’activité de Cree dans l’épithélium de la prostate, mais pas si l’édition de gènes a été induite par le guide CRISPR. Ces coupes immunohistochimiques identifient les zones focales des cellules présentant des expressions élevées de pAKT, indiquant une perte de P10. Dans ces panels, la cocoloration pour pAKT et GFP a permis d’identifier des cellules doublement positives, ce qui a confirmé cette transformation des cellules prostatiques par le virus adéno-associé.Dans l’ensemble, ces résultats montrent qu’in vivo, l’édition du gène CRISPR-Cas9 peut être réalisée dans l’épithélium de la prostate en utilisant la souris Rosa26-LSL-Cas9-EGFP et le virus adéno-associé. Une fois maîtrisée, la procédure peut être effectuée en 15 minutes. Cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine du cancer de la prostate pour examiner plusieurs gènes simultanément in vivo.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’administrer du substrat à la prostate murine. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec certains virus, cela peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de ces procédures.

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Cette vidéo décrit une méthode de modification de gènes spécifiques dans les cellules de la prostate à l’aide d’un système d’administration basé sur l’adénovirus. L’approche permet une altération orthotopique et localisée de l’expression génique à l’aide de la technologie CRISPR pour développer de nouveaux modèles murins pour le cancer de la prostate.

Modélisation du cancer de la prostate dans des modèles murins génétiquement modifiés : une technique d’édition de gènes localisée médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules du lobe antérieur de la prostate de souris

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Le but du présent protocole est de démontrer l’injection intra prostatique de cellules de cancer de la prostate, avec castration ultérieure. Orthotopique des modèles précliniques de cancer de la prostate androgéno-dépendants et résistant à la castration sont essentielles pour étudier la maladie dans le contexte d’un micro-environnement tumeur cliniquement pertinents et un hôte immunocompétent.

Un modèle murin syngénique bioluminescentes et Fluorescent orthotopique du Cancer de la Prostate androgéno-dépendants et résistant à la Castration

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour réaliser en vivo gène cardiaque édition chez la souris à l’aide de Virus recombinant de Adeno-Associated (rAAV)-mediated livraison de CRISPR. Ce protocole propose une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter la cardiomyopathie dystrophique dans la dystrophie musculaire de Duchenne et peut être utilisé pour générer des knockout spécifique cardiaque chez les souris après la naissance.

Adéno-associés de livraison induite par le Virus de CRISPR gène cardiaque édition chez la souris

Nous décrivons une nouvelle méthode pour la livraison de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de souris la vessie in vivo par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Il offre un moyen rapide et pratique pour générer des modèles autochtones murins de maladies de la vessie.

Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

Ici nous décrivons une méthodologie rapide et directe de criblage d’in vivo CRISPR/Cas9 utilisant des injections lentiviral embryonnaires ultrason-guidées dans utero pour évaluer simultanément des fonctions de plusieurs gènes dans la peau et la cavité buccale des souris immunocompétentes.

Dépistage in Vivo CRISPR/Cas9 pour évaluer simultanément la fonction génétique dans la peau de la souris et la cavité buccale

Le protocole actuel décrit une seule mutation M213L dans Gja1 qui conserve la génération Connexin43 pleine longueur mais empêche la traduction de l’isoforme GJA1-20k traduite en interne plus petite.

Retrait d’un site de démarrage translationnel interne de l’ARNm tout en conservant l’expression de la protéine pleine longueur

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

Nous présentons un protocole pour la transduction rétrovirale de l’ARN guide dans les lymphocytes T primaires de souris transgéniques Cas9, offrant une alternative efficace pour l’édition de gènes dans l’étude de la différenciation Th17.

Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro

Apprenez la livraison virale de guides CRISPR/Cas9 dans la prostate murine pour modifier l'expression génique. Cette méthode permet l'édition rapide de gènes multiples et l'étude du cancer de la prostate in vivo.

Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques

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