Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

L’objectif global de cette expérience est de visualiser les interneurones GABAergiques corticaux génétiquement modifiés lors de la migration tangentielle dans l’environnement le plus naturaliste possible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences du développement en dépistant l’impact de la perte de fonction de gènes spécifiques de protéines au cours du développement du cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu coûteuse et relativement facile à réaliser par rapport à d’autres méthodes similaires telles que l’électroporation in utero.

Ainsi, cette technique peut finalement améliorer le diagnostic des patients atteints de troubles neurodéveloppementaux génétiques tels que l’autisme et l’épilepsie en clarifiant la pathogénicité de mutations spécifiques identifiées chez les patients ainsi que les rôles des nouveaux gènes de la maladie au cours du développement du cerveau. Commencez par mettre en place l’enceinte de biosécurité avec tous les instruments nécessaires à la dissection et à la culture. Vaporisez généreusement tous les instruments de l’enceinte de biosécurité avec de l’éthanol à 70 % et stérilisez les instruments et l’intérieur de l’armoire avec de la lumière UV pendant 15 à 20 minutes.

Lorsque vous êtes prêt à prélever des embryons, vaporisez généreusement l’abdomen de la digue euthanasiée avec de l’éthanol à 70 %. Tirez la peau abdominale vers le haut avec une paire de pinces stérilisées et de l’autre main, utilisez des ciseaux chirurgicaux stérilisés pour couper la peau de l’abdomen. À l’aide d’une deuxième paire de pinces et de ciseaux stérilisés, tirez le fascia abdominal vers le haut et coupez-le en évitant soigneusement l’utérus.

À l’aide d’une troisième paire de pinces et de ciseaux stérilisés, tenez les cornes utérines et coupez-les dans la cavité pelvienne. Placez les cornes utérines disséquées dans un pétridish stérile de 60 millimètres rempli d’un milieu de culture lebovitz à base de neuraux complété par des acides aminés, des vitamines et des sels inorganiques. Dans l’enceinte de biosécurité stérile, utilisez deux paires de pinces fines pour disséquer les embryons du placenta et isoler les têtes par décapitation.

Bevel a coupé l’extrémité d’une pipette de transfert en plastique stérile de trois millilitres et l’a utilisée pour aspirer les têtes et les transférer dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 60 millimètres remplie du même milieu de culture neuronal supplémenté pour éliminer le sang. Transférez-les à nouveau dans une troisième boîte de Pétri recouverte de cire noire solidifiée et remplie d’un milieu de culture supplémenté à base de neuraux. Placez la boîte de Pétri de 16 millimètres recouverte de cire noire et contenant les têtes décapitées dans un milieu de culture supplémenté à base de neurones sous le microscope de dissection dans l’enceinte de biosécurité.

Utilisez une pince à épiler fine tenue dans la main gauche pour stabiliser la tête avec la partie rostrale tournée vers la droite. Ensuite, utilisez le nano-injecteur dans la main droite pour injecter un à deux microlitres de la solution plasmidique enrichie de colorant dans le ventricule latéral droit. Électroporez le cerveau injecté en plaçant la tête entre les électrodes avec l’électrode négative positionnée dorsalement et parallèlement à la tête et l’électrode positive vers la face ventrale de la tête pour cibler le MGE.

Une fois que les électrodes sont bien positionnées, délivrez des impulsions carrées de 40 volts pendant 50 millisecondes à des intervalles d’impulsions de 500 millisecondes. Tout en continuant à travailler dans l’environnement stérile de l’enceinte de biosécurité, commencez à disséquer le cerveau du crâne. Tout d’abord, stabilisez la tête sur la couche de cire noire en insérant une aiguille dans chaque œil tout en évitant soigneusement le cerveau.

Ensuite, utilisez une paire de pinces fines pour tenir le côté gauche du cou et une deuxième paire de pinces fines pour déchirer la peau du crâne de l’arrière vers l’avant. Tout en tenant la tête latéralement avec une pince à épiler dans une main, utilisez une autre paire de pinces à épiler dans l’autre main pour couper soigneusement le crâne au niveau du tronc cérébral et tirer le crâne vers le haut. À l’aide de chaque pince à épiler, coupez le crâne dans le plan sagittal vers l’avant puis incisez latéralement pour libérer les fragments de crâne.

Ensuite, soulevez le tronc cérébral et coupez soigneusement les méninges et les nerfs crâniens jusqu’à ce que le cerveau soit complètement sorti du crâne. Remplissez une boîte de Pétri de 35 millimètres avec une solution d’agarose fondue maintenue liquide à 42 degrés Celsius. Ensuite, transférez rapidement un cerveau électroporé dans le plat rempli d’agarose à l’aide de la pipette de transfert préalablement coupée.

Remuez l’agarose avec un bâton métallique pour maintenir le cerveau au milieu du puits afin d’éviter qu’il ne coule et positionnez le cerveau dans un plan caudal rostral parallèle à la parabole. Arrêtez de remuer lorsque l’agarose commence à se solidifier pour éviter tout dommage au cerveau. En attendant que l’enrobage de l’agarose se solidifie, transférez 750 microlitres de milieu de culture supplémenté en N2 dans chaque puits de la plaque de culture à six puits en fonction du nombre de cerveaux à traiter.

Et placez un insert de membrane de 30 millimètres dans chaque puits rempli de milieu. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez l’agarose qui entoure le cerveau pour former un bloc rectangulaire laissant une marge d’un à deux millimètres autour du cerveau. Assurez-vous que la partie rostrale du cerveau est perpendiculaire à la limite antérieure du bloc afin de faciliter l’orientation pour les étapes de section suivantes.

Collez le bloc d’agarose sur la plate-forme du vibratome, bord rostral vers le bas et bord ventral face à l’utilisateur. Coupez le cerveau en coupes coronales pour obtenir des sections de 250 microns d’épaisseur à quatre degrés Celsius. À l’aide de spatules stérilisées, prélever deux à trois sections contenant le MGE et placer toutes les sections de cerveau d’un animal sur un seul insert de membrane de 30 millimètres.

Tout en évitant soigneusement les chevauchements entre les sections. Placez la plaque de culture dans un incubateur stérile ventilé à 37 degrés Celsius avec 60 % d’humidité et 5 % de CO2 pendant 48 ou 72 heures. Après le temps d’incubation souhaité, transférez les sections d’intérêt dans une lamelle à huit chambres remplie de trois à cinq microlitres de milieu de culture.

Placez la lamelle dans une chambre environnementale, connectez-la à un disque rotatif inversé confocal équipé d’un logiciel d’acquisition assistée par ordinateur pour configurer la session d’imagerie en accéléré. Des interneurones électroporés à E 13,5 avec un plasmide expérimental exprimant la cassette de tomate TD et un ARN SH ciblant un gène d’intérêt sont observés en migration tangentielle dans une tranche de cerveau organotypique obtenue à partir d’un embryon de souris DLX5 6Cre RCEE GFP après 48 heures de culture. Les interneurones ont été visualisés à l’aide de l’imagerie en direct pendant huit heures.

Dans cet exemple, le même interneurone électroporé est observé dans le processus de nucléokinèse. Tout en migrant tangentiellement dans le cortex parallèlement à la surface du pelage. Le neurone présente initialement un corps cellulaire allongé dans le processus de nucléokinèse.

Ainsi qu’un processus de traînée et un processus de direction ramifié. Après trois heures d’imagerie en direct, la nucléokinésie est terminée. L’apophyse traînante s’est rétractée et l’apophyse principale étend deux longues branches.

Après cinq heures et 30 minutes, l’une des principales branches du processus s’est rétractée et le corps cellulaire du neurone s’est avancé d’environ 10 microns. Enfin, après huit heures d’imagerie, la migration s’est arrêtée, le neurone a de nouveau étendu son processus principal et un processus de traînée est apparu. Mais le noyau n’a pas encore avancé.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de garder un environnement stérile à tout moment. Ainsi, à la suite de ces procédures, d’autres méthodes telles que des électroporations de MG suivies d’explants peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires afin d’élucider les processus cytosquelettiques dynamiques se produisant lors de la migration neuronale au niveau ultracellulaire.