Name: Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez l'intégration de la cytométrie en imagerie et du profilage transcriptomique pour évaluer l'altération de l'endocytose CD1d dans les cellules dendritiques humaines exposées aux polluants.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs remercient Robert Giulitto (Centre de sang Hoxworth) pour les échantillons de sang humain et Dr Liang Niu pour la normalisation de l’expression génique lit. Nous remercions également les subventions de l’Institut National of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for Environmental génétique (CEG) projetpilote (S.H.), Institut National des allergies et maladies infectieuses (AI115358) (S.H.), Université de Cincinnati University Research Council award (S.H.) et l’Université de Cincinnati College de médecine Enhancement financement de base (X. Z.).

Les protocoles humaines dans cette étude ont été approuvées par l’Institutional Review Board de l’Université de Cincinnati et toutes les méthodes ont été effectuées conformément aux directives et règlements. Des échantillons de sang provenant de donneurs sains ont été obtenues depuis le centre Hoxworth de sang au centre médical de l’Université de Cincinnati.
1. transcriptomique profilage de DCs de macrophages dérivés de monocytes humains exposés à des polluants
<ol><li>Extraction de l’ARN totale de DCs BaP-exposés<ol>
<li>Différencier les DCs humaines à l’aide de cytokines GM-CSF et IL-4 et exposer DCs au BaP pendant 4 jours,13.</li>
		<li>Trier DCs exposés au BaP utilisant l’écoulement cytometry basé sur les marqueurs de surface exprimées (lignée–HLA-DR,+), dont la majorité se compose de DCs classiques (CD11c+CD1c+)13. En général, trier les 10 000 contrôleurs de domaine dans le milieu de culture contenant 10 % FBS, centrifuger DCs à 600 x g et 4 ° C pendant 6 min et retirez immédiatement le surnageant par aspiration à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL.</li>
		<li>Une fois que le surnageant est éliminé par aspiration, lyse le culot cellulaire en ajoutant 0,4 mL de tampon de lyse/liaison depuis le kit d’isolation d’ARN pour le stockage à-80 ° C avant l’extraction de l’ARN.</li>
		<li>Utiliser le kit d’isolation d’ARN avec le protocole d’extraction ARN total pour extraire le RNA total14. Mesurer l’intégrité de RNA à l’aide d’un Bioanalyzer15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse transcriptomique des DCs triés (Figure 1 a)<ol>
<li>Préparer la bibliothèque à l’aide d’un kit de préparation d’ARN bibliothèque de RNA-seq. Bref, fragmentent l’ARN polyA (~ 200 bp), inverse transcrire les fragments pour le 1er volet du cDNA et suivi par la deuxième synthèse de cDNA de brin étiquetée avec dUTP.</li>
		<li>Ligaturer ADNc double brin à l’adaptateur avec une structure en épingle après purification de perle, fin-réparation et dA-tailing. Les résidus d’uracile dans le 2ème brin de la boucle d’ADNc et adaptateur avec enzyme utilisateur (réactif de l’Excision uracile-spécifique) pour maintenir la spécificité du strand et ouvrir la boucle de l’adaptateur pour PCR de l’accise.<ol>
<li>Effectuer 13 cycles de PCR avec des amorces universelles et indice spécifique afin d’enrichir la bibliothèque indexée. Nettoyer la bibliothèque et exécuté sur une puce de Bioanalyzer ADN haute sensibilité pour vérifier la qualité de la bibliothèque et la distribution de la taille.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utiliser un kit de quantification de bibliothèque et un système PCR en temps réel combinées avec des informations de taille de bibliothèque pour calculer concentration bibliothèque via une méthode de la courbe d’étalonnage.</li>
		<li>Proportionnellement poule individuellement indexées bibliothèques compatibles et ajuster la concentration totale finale à 15 h. Effectuer la génération de cluster de bibliothèque et la bibliothèque avec une valeur de lecture simple 1 x 50 bp pour produire 25 millions de lectures par exemple de séquence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Séquençage<ol>
<li>Charger le séquençage et l’indexation des réactifs pour les paniers de réactif SBS et PE, respectivement. Placer les réactifs dans un bain d’eau de qualité laboratoire pendant 1 h jusqu'à ce que toute la glace a fondu et les réactifs dans chaque bouteille/tube sont mélangés correctement.</li>
		<li>Préparer le mélange de l’ICB en ajoutant l’enzyme décongelé de colorant et de-20 ° C à la bouteille et mélanger. Préparer une solution de NaOH selon les instructions de séquençage. Placez tous les réactifs à 4 ° C jusqu’au moment de l’utiliser.</li>
		<li>Pendant les 1 h période d’attente, allumez le séquenceur. Attendez que le lecteur DONOTEJECT de comparaître et de connecter l’ordinateur à un lecteur réseau.</li>
		<li>Lancer le logiciel de commande de sequencer.</li>
		<li>Préparer 2 L de solution de lavage entretien contenant 0,5 % de Tween 20 et 0,03 % de ProClin 300 qualité en laboratoire l’eau.</li>
		<li>Dans le panier de réactif SBS, ajouter environ 100 mL de solution de lavage entretien à chacun des 8 bouteilles et bouchons de l’entonnoir pour les bouteilles. Dans le panier de réactif de PE, ajouter environ 12 mL de solution de lavage entretien à chacun des dix tubes coniques 15 mL et jeter les bouchons.</li>
		<li>Charger les deux paniers avec les bouteilles/tubes remplie de solution pour le séquenceur.</li>
		<li>Dans le logiciel de commande de sequencer, choisissez le cycle de lavage entretien ; Suivez les instructions à l’écran pour nettoyer le circuit de fluide de séquenceur jusqu'à ce que le processus est terminé.</li>
		<li>Commencer un nouveau départ dans l’onglet « Séquence » du logiciel ; diriger les données de sortie à un lecteur réseau. Choisissez les paramètres pour lecture seule 1 x 50 bp avec les bibliothèques de l’indice unique multiplexé.</li>
		<li>Éventuellement, ouvrir une session dans le moyeu de séquence BaseSpace afin que le statut de séquençage peut être contrôlé à distance via un ordinateur ou un téléphone intelligent.</li>
		<li>Télécharger un exemple de feuille de démultiplexage et renseignent le réactif selon l’exigence du logiciel.</li>
		<li>Charger les réactifs SBS et PE à l’aide du séquenceur. Amorcez le système avec une cellule de flux utilisés (~ 15 min).</li>
		<li>Une fois terminée la génération de cluster (~4.5 h), sortez la cellule de flux, vaporiser légèrement la cellule de flux d’eau et essuyer, sécher avec du papier de la lentille. Légèrement la cellule de flux de pulvérisation avec l’éthanol à 95 % et séchez-le. Sous une lumière pour vous assurer que la surface soit propre sans débris ou les résidus de sel.</li>
		<li>Une fois terminée l’étape de Prime, charger la cellule d’écoulement en cluster et démarrer le séquençage. Le logiciel de visualisation de l’analyse de séquence démarre automatiquement.</li>
		<li>Surveiller la qualité de données de séquençage par SAV dont la densité de cluster, filtre passe-bande lectures, cluster pass filtre %, % ≥Q30, % de legs de phase/la prophase, QC, etc. , que cela aide à comprendre la qualité des données et le dépannage de l’indexation.</li>
		<li>Changer le joint de cellule de flux et d’effectuer un lavage d’entretien après que le séquençage est terminé. Le séquenceur est prêt pour la prochaine exécution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse bioinformatique<ol>
<li>Effectuer la bioinformatique RNA-seq données analyse13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voie analyse des profils de transcriptomique (Figure 1 b)
<ol><li>Taille-bordure Bioconductor permet de comparer la résultante gene expression intensité comtes entre des contrôleurs de domaine BaP-exposés et non exposés de trois donateurs. Ensuite, identifier des gènes différentiellement exprimés entre des contrôleurs de domaine BaP-exposés et non exposés, basés sur la variation absolue de pli (> 2 plis) et la découverte de fausse taux de valeurs (FDR) - ajusté p-(< 0,05).</li>
	<li>Pour prédire les groupes fonctionnels d’expression différentielle des gènes exprimés, utilisez le paquet de logiciel de ToppCluster pour rechercher les gènes modifiés contre plusieurs bases de données y compris KEGG et REACTOME et générer des données clusters. ToppCluster utilise le test de hypergéométrique pour obtenir un enrichissement fonctionnel via le gène liste enrichissement analyse16.</li>
	<li>Outre l’entrée les résultats de ces groupes de fonction Cytoscape17,18 Version 3.3.0, une plate-forme logicielle de source ouverte largement utilisée pour la visualisation de réseaux complexes. Ainsi, les gènes impliqués dans les différents groupes ou voies, y compris les groupes intervenant dans l’endocytose et le métabolisme des lipides, sont présentés dans un réseau avec l’annotation de la couleur du changement sans moyenne pli de gene expression (Figure 1 b)13.</li>
</ol>3. imagerie cytométrie de CD1d et Lamp1 colocalisation
<ol><li>Anticorps d’étiquetage de DCs BaP-exposés<ol>
<li>Exposer 0,5 x 106 DCs humaines à 5,94 mM BaP pendant 4 jours à 37 ° C dans 2 mL de Dulbecco complet milieu Eagle modifié. Récolter DCs par centrifugation à 400 g pendant 10 min. bloc la DCs différenciée en incubant les cellules avec bloqueur de sérum humain et anti-humain Fc receptor anticorps pendant 10 min dans la glace, y compris les anticorps anti-CD16, CD32 et CD64.</li>
		<li>Incuber Violet brillant 421-anti-CD1c (L161), teindre de phycoérythrine/cyanine 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR et PE/Cy5-anti-CD11c avec DCs pendant 20 min dans la glace. Le tableau 1 montre cette liste des anticorps.</li>
		<li>Difficulté de DCs avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS et leur permeabilize avec tampon de lavage perméabilisation. Effectuer la coloration intracellulaire avec un mélange de PE marquée purifiée anti-humain CD1d (51,1) et marqué Alexa Fluor 647 anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie des mesure de cytométrie de débit (Figure 2)<ol>
<li>Analyse des échantillons colorés à l’aide d’un cytomètre de flux d’imagerie à la base de cytométrie en flux de l’hôpital pour enfants de Cincinnati en utilisant un objectif X 40 à 300 pixels pour une cellule avec environ 10 mm de diamètre. Taille d’un pixel est d’environ 0,5 mm de 0,5 mm de l’objet.</li>
		<li>Acquisition de 10 000 images cellulaires de manière impartiale, selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. imagerie Analyses d’Images de cytométrie en flux
<ol><li>Analyse de colocalisation à l’aide de logiciels d’idées (Figure 2)<ol>
<li>Effectuer une compensation avec single tachée par rapport aux échantillons non teinté en réglant l’intensité de la fluorescence des échantillons non teinté le seuil, y compris non colorés exposés au BaP DCs avec BaP autofluorescence, comme données de cytométrie en flux régulier analyse.</li>
		<li>Porte de coloration des cellules afin d’obtenir des sous-ensembles d’HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ cellules (Figure 2 a) et afficher les images cellulaire dans les sous-ensembles fermées (Figure 2 b).</li>
		<li>Enregistrer les images de cellule dans un format png, basé sur deux critères d’inclusion technique, la présence visuelle de forts signaux co tachées et localisation sous-cellulaire des protéines CD1d et Lamp1, pour les analyses de co-localisation avec ImageJ-Fidji (Figure 2 b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Logiciels ImageJ-Fidji permet d’effectuer des analyses de colocalisation (Figure 3).<ol>
<li>Préparer les fichiers image en fusionnant les 100 images enregistrées cellule pour DCs humaines non exposés et exposés au BaP, respectivement (Figure 3 a).</li>
		<li>Analyser CD1d (rouge) et Lamp1 colocalisation (vert) à l’aide d’un diagramme de dispersion.<ol>
<li>Exécutez le programme d’ImageJ-Fidji. Ouvrir le fichier .png avec 100 images de cellules (Figure 3 b et 4 a Figure) : « fichier | Ouvrir ».</li>
			<li>Fractionner l’image avec les canaux rouges et verts fusionnées en deux images avec un rouge ou un canal vert : « Image | Couleur | Fractionner des chaînes ».</li>
			<li>Dessiner un diagramme de dispersion en utilisant les commandes « Analyze | Colocalisation | Seuil de colocalisation ». Enregistrez le diagramme de dispersion à l’aide de la touche « PrintScreen » .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calculer les coefficients de colocalisation de Mander pour chaque image cellulaire unique (n = 100) (Figure 4 b)<ol>
<li>Sélectionnez une image de cellule unique sur le fichier image avec split chaînes à l’aide de la "ovale » outil de sélection.</li>
			<li>Utiliser les commandes « Analyze | Colocalisation | Seuil de colocalisation ». Sélectionnez « Channel 1 » dans la boîte de dialogue de la région d’intérêt (ROI). Garder toutes les options de calcul, y compris « Mander à l’aide de seuils » pour chaque image de la cellule.</li>
			<li>Répétez ce calcul pour toutes les images de 100 cellules.</li>
			<li>Enregistrer et ouvrir les résultats à l’aide d’une feuille de calcul.</li>
			<li>Tracer la moyenne et les erreurs-types pour les « Coefficients de binariser Massé » (n = 100, 0 signifie aucune colocalisation et 1 signifie colocalisation parfaite). Test t de Student permet de calculer la valeur de p pour la comparaison entre les groupes de BaP-exposés et non exposés (Figure 4 b).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calculer le pourcentage d’intensité pixel seuillée co localisée entre CD1d et Lamp1 pour plusieurs images de cellules (n = 100) (Figure 4).<ol>
<li>Utiliser le même protocole d’analyse en 4.2.3 et en outre, sélectionnez l' option de résultat « % intensité seuil épididymaire ».</li>
			<li>Effectuer cette analyse ainsi que les coefficients de colocalisation de Massé.</li>
			<li>De même, tracer la moyenne et les erreurs-types pour % intensité épididymaire entre CD1d et Lamp1. Test t de Student permet de calculer la valeur de p pour la comparaison entre les groupes de BaP-exposés et non exposés (Figure 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li>
<li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li>
<li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325(2009).</li>
<li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li>
<li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085(2017).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li>
<li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppCluster%3A+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li>
<li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li>
<li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li>
<li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594(2016).</li>
<li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Confirmation fonctionnelle d’une voie de gène est difficile, en raison de l’expression génique largement contaminé impliquant de multiples voies et la difficulté d’intégrer les activités cellulaires individuelles et populationnelles. Nous avons utilisé d’imagerie cytométrie à spécifiquement test CD1d traite des compartiments de l’endocytose. Cytométrie en flux d’imagerie intègre la mesure populationnelle des cellules et la démonstration individuelle de colocalisation subcellulaire des protéines multiples. Microscopie con...

Présentation de l’antigène implique en général des protéines intracellulaires traite, qui a été souvent étudié en utilisant la caractérisation morphologique et détermination des caractéristiques phénotypiques des antigène présentant des cellules1,2,3 . Pour intégrer les avantages de l’imagerie et les méthodes de phénotypage, nous décrivons une plate-forme d’analyse d’imagerie au niveau de la population à démontrer une colocalisation de protéine altérée dans les cellules dendritiques humaines (DCs) tant de cellule unique. Dans la présentation des antigènes peptidiques, complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules lier un peptide court (8-10 résidus) dans le réticulum endoplasmique pour activer classiques CD8+ T des cellules, tandis que les molécules MHC classe II lient un relativement plus longue peptide (~ 20 résidus) dans des compartiments endocytose pour activer classiques CD4 des cellules de+ T1,4. En revanche, les lipides spécifiques T cellules sont activées par CD1 protéines avec des antigènes lipidiques chargés principalement dans des compartiments endocytose5,6. Présentation des antigènes lipidiques exige la fourniture des lipides métabolites produits en lipide métabolisme7,8,9,10 et le chargement des métabolites de lipides fonctionnels aux protéines CD1 endocytose compartiments5,6. Dans ce contexte, différents facteurs cellulaires modulant la présentation des antigènes lipidiques, en particulier dans l’exposition dans l’environnement des polluants lipophiles et désordres du système immunitaire, sont essentiels pour être défini. Dans cette étude, nous avons utilisé analyse transcriptomique, image profilage et analyse d’imagerie cellulaire et populationnelle de DCs de macrophages dérivés de monocytes humains afin de déterminer la protéine intervenant dans l’endocytose traite contribuant à la présentation des antigènes lipidiques à l’exposition à des polluants. Certes, cette plate-forme combinée peut être appliquée à l’étude traite des protéines subcellulaire et colocalisation dans différents processus biologiques.
Sur le plan technique, localisation subcellulaire de protéine a été démontrée généralement à l’aide de la microscopie confocale et statistiquement analysées dans un nombre limité de cellules détectées1,2,3,11. En outre, cytométrie en flux a été largement appliquée aux populations de cellules de porte avec des signaux de co teinté de plusieurs protéines à un niveau cellulaire12; Toutefois, cela n’a pas une visualisation détaillée de colocalisation de protéine subcellulaire. Pour réaliser des analyses complètes et statistiques de pourcentage colocalisation de protéine au niveau cellulaire et la population, nous incorporons imagerie approches de profilage et d’analyse afin de déterminer les caractéristiques de la co-localisation de protéine avec biologique pertinence. Plus précisément, nous utilisons cytométrie en flux d’imagerie pour détecter la co-localisation de CD1d et protéine 1 (Lamp1) de la membrane lysosomale associés aux protéines dans cette étude. Le dosage des molécules épididymaire était auparavant difficile à accomplir à l’échelle populationnelle. Dans cette étude, nous avons adapté le programme de ImageJ-Fidji à examiner le pourcentage de colocalisation de protéine avec un grand nombre de cellules co colorées au niveau cellulaire populationnelle tant individuels. Plus précisément, nous avons mesuré des zones localisées de co, intensité et la taille populationnelle pour étayer la conclusion que la protéine CD1d a été largement conservée dans des compartiments endocytose fin de DCs humaines dans une exposition à un polluant lipophiles de benzo [a] pyrène (BaP)13 . Ce combiné cellulaire et la population d’imagerie analyse a fourni des résultats hautement reproductibles, complets et statistiquement significatives de colocalisation CD1d-Lamp1 pertinente pour la présentation des antigènes lipidiques inhibé.
Le transcriptome de DCs humains exposés au BaP a fortement soutenu l’hypothèse que le métabolisme des lipides endocytose et CD1d endocytose trafic ont porté atteinte aux exposition BaP. Pour tester cette hypothèse, nous avons appliqué la cytométrie en flux d’imagerie pour profiler les images de population DC qui ont été colorées conjointement avec plusieurs protéines dont CD1d, endocytose marqueurs et DC. Enfin, les cellules colorées co analysés statistiquement pour illustrer le pourcentage d’intensité et de zones de colocalisation CD1d et Lamp1.

<table><tbody><tr><td>Transcriptomique</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>Système Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>ImagingStream X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>Imagerie cytométrie en flux</td></tr><tr><td>mirVana Kit d’isolement des miARN</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Extraction totale de l’ARN</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent</td><td></td><td></td> Analyse <td>du contrôle qualité de l’ARN total</td></tr><tr><td>Veriti 96 puits Thermocycleur Thermo</td><td> </td><td></td><td>Fisher PCR, réaction enzymatique</td></tr><tr><td>NEBNext Module d’isolement magnétique de l’ARNm poly(A)&nbsp ;</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Purification de l’ARN PolyA</td></tr><tr><td>Système automatisé SMARTer Apollo</td><td>Purification de l’ARN</td><td>Takara</td><td></td> PolyA</tr><tr><td>NEBNext Ultra Kit de préparation de la bibliothèque d’ARN pour Illumina</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Perles magnétiques Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td>Purification de l’ADN&nbsp ;</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, analyse de la distribution de taille</td></tr><tr><td>Kit d’ADN haute sensibilité Agilent</td><td></td><td></td><td>Library QC, analyse de la distribution de taille</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Système de PCR en temps réel (Thermo Fisher)Quantification</td> <td>de la bibliothèque</td> <td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit Quantification</td><td></td><td></td> de la bibliothèque New England Biolab <td></td></tr><tr><td>Génération</td><td>de cluster de la bibliothèque</td><td>cBot Illumina</td><td></td></tr> Kit <tr><td>de cluster TruSeq SR v3 - cBot &ndash ; HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Library cluster generation</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Séquençage</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cycles)</td><td>Séquençage</td> <td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>Phycoérythrine/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td><td>Bio Legend</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Phycoérythrine/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td><td>Bio Legend</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Violet brillant 421</td><td>Bio Legend</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE-anti-souris IgG2b</td><td>Bio Legend</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647)</td><td>Bio Legend</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération cd1d endocytose traite

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Les analyses populationnelles de l’altération morphologique et fonctionnelle des protéines intervenant dans l’endocytose sont difficiles en raison de la demande de capture d’image à une analyse d’image plane et statistique unicellulaire à un niveau populationnelle. Pour surmonter cette difficulté, nous avons utilisé d’imagerie cytométrie et transcriptomique profilage (RNA-seq) pour déterminer la localisation sous-cellulaire altérée de l’amas de protéine de différenciation 1D (CD1d) associée à l’expression des gènes intervenant dans l’endocytose altérée chez l’homme les cellules dendritiques (CD), qui ont été exposés à la common liphophile air pollutant benzo [a] pyrène. La co-localisation de CD1d et protéines intervenant dans l’endocytose marqueur Lamp1 parmi des milliers de cellules images capturées avec écoulement cytometry d’imagerie a été analysée à l’aide d’idées et ImageJ-Fidji programmes. Nombreuses images cellulaires avec des protéines CD1d et Lamp1 co colorées ont été visualisées après blocage sur CD1d+Lamp1+ DCs idées. La co-localisation CD1d et Lamp1 améliorée sur BaP, l’exposition a été démontrée plus loin à l’aide de diagrammes de dispersion binariser, testé avec des coefficients de Mander pour co localisées d’intensité et tracés selon le pourcentage de zones co localisées à l’aide de ImageJ-Fidji. Nos données fournissent une approche instrumentale et bioinformatiques avantageuse pour mesurer la co-localisation de la protéine au niveau cellulaire unique et populationnelle, soutenant un résultat fonctionnel avec facultés affaiblies d’altération transcriptomique chez les humains exposés à des polluants Contrôleurs de domaine.

Les polluants lipophiles BaP modifie des groupes de gènes intervenant dans l’endocytose dans DCs de macrophages dérivés de monocytes DCs. homme humains de chaque donateur (n = 3) ont été incubées en présence de BaP et triés pour DCs classiques, qui ont été utilisés plus de RNA extraction et transcriptomique d’analyse tel que décrit . Lors de la normalisation de l’expression des gènes, les gènes modifiés entre groupes BaP-exposés et non exposés ont été regroupés selon la corrélation foncti...

Cytométrie en flux d’imagerie fournit une approche idéale pour détecter la modification morphologique et fonctionnelle des cellules aux niveaux individuel et populationnelles. Fonction d’endocytose perturbée pour présentation des antigènes lipidiques dans les cellules dendritiques humaines exposés à des polluants a été démontrée avec un combiné transcriptomique profilage de l’expression génique et démonstration morphologique de la protéine traite.

Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Ces méthodes intègrent l’analyse d’imagerie par séquençage et cytométrie de flux de prochaine génération. Il peut aider à répondre à des questions intéressantes, comme si certaines altérations phénotypiques sont impliquant, au lieu du transcriptome, en particulier dans l’environnement d’exposition aux polluants. Le principal avantage de cette méthode simple pour nous est que nous pouvons l’utiliser pour mesurer la colocalisation de protéines biologiquement importantes, pour interpréter les résultats de l’expression différentielle clé des gènes à un niveau fonctionnel.Les implications de cette technique s’étendent vers le diagnostic des résultats pathologiques et toxicologiques. Comme approche normale d’imageur, le forsee a la capacité de relier l’expression de gène à la fonction de protéine. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison des exigences techniques élevées de l’imagerie et de l’analyse transcriptomique.Pour séquencer la bibliothèque de cellules dendritiques dérivée du monocyte humain, chargez d’abord les réapprovisionnements de séquençage et d’indexation sur la biosynthèse séquençante et l’indexation des supports de reagent, respectivement

integrate-imaging-flow-cytometry-transcriptomic-profiling-to-evaluate

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La méthode IP-FCM est présenté, ce qui permet un sensible, robuste, l'évaluation biochimique de la maternelle interactions protéine-protéine, sans exiger le génie génétique ou échantillons de grande taille.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Nous décrivons ici une méthode d’isolement permettant d’obtenir des lymphocytes intra-épithéliales endocervicals humains pour l’analyse des lymphocytes T gamma delta intra-épithéliaux. Ce protocole peut être étendu pour la purification des lymphocytes T gamma delta endocervicaux par billes magnétiques ou par tri cellulaire.

Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

Une coulée d’essai de liaison cellulaire axée sur la cytométrie en flux est décrite qui est principalement utilisée comme outil de dépistage pour identifier les composés qui inhibent la fixation d’un ligand de chimiokines CXC fluorescent étiquetée 12 (CXCL12) pour les récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4).

Un test Flow Cytometry d’identifier des composés qui perturbent la fixation du Ligand de chimiokines CXC fluorescent marqué 12 au récepteur de chimiokines CXC 4

L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Ce protocole combine la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire pour isoler et caractériser les états des cellules microgliales dans le cervelet des cerveaux de souris postnatals précoces. Il utilise la dissociation enzymatique, la centrifugation de Percoll et l’immunomarquage pour révéler l’hétérogénéité des microglies et améliorer la compréhension de leurs rôles dans le développement et la maladie cérébelleux.

Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Découvrez l'intégration de la cytométrie en imagerie et du profilage transcriptomique pour évaluer l'altération de l'endocytose CD1d dans les cellules dendritiques humaines exposées aux polluants.

Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite

Explorer plus de vidéos