Évaluation de l’Inclusion d’Exon induite par Splice commutation oligonucléotides antisens de fibroblastes de patients de SMA

L’objectif global de ce protocole de lipotransfection est d’introduire des oligonucléotides antisens dans les cellules et d’évaluer l’efficacité de ces médicaments sur l’inclusion d’exons dans les cellules SMA. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie antisens. Par exemple, l’efficacité de nouveaux oligonucléotides antisens pour fournir un traitement aux patients.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, facile et suffisamment sensible pour tester diverses chimies d’oligonucléotides antisens. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour la transfection d’oligos antisens en fibroblastes, elle peut également être appliquée à d’autres types de cellules, tels que les myoblastes primaires et diverses autres lignées cellulaires. Aleks, un technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Tout d’abord, décongelez une solution de 10 micromolaires de mélangeur LNA/ADN sur de la glace. Diluer la solution de mélange dans un milieu privé de sérum à la concentration requise dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, diluez le réactif de transfection et ajoutez-le dilué au mélangeur dans un rapport de un à un.

Il est essentiel que la confluence cellulaire soit d’environ 65 à 80 % lors de la transfection. Si la confluence est supérieure à 80 %, l’efficacité de la transfection sera réduite. Ensuite, incubez le mélange de réactifs de transfection à température ambiante pendant 10 minutes.

Après 10 minutes, pipetez 900 microlitres de milieu privé de sérum avec 5 % de sérum bovin fœtal dans le tube. N’ajoutez pas le FBS avant l’incubation avec le réactif de transfection et les mélangeurs LNA/ADN, car cela affecte également l’efficacité de la transfection. Ensuite, aspirez l’ancien milieu de la plaque de culture.

Maintenant, ajoutez un millilitre du milieu contenant le mélangeur LNA/ADN dans la plaque de culture. Ensuite, laissez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Après l’incubation, aspirer le milieu de la plaque de culture.

Ensuite, injectez un millilitre de réactif GPC dans les cellules. Ensuite, lavez les puits plusieurs fois avec le réactif GPC. Après plusieurs lavages, prélevez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre et conservez les échantillons sur de la glace.

Ensuite, faites tourbillonner le tube à grande vitesse pendant 30 secondes. Ensuite, conservez le tube à moins 80 degrés Celsius pendant une heure. Maintenant, décongelez l’échantillon à température ambiante et vortexez-le rapidement.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chloroforme à l’échantillon et secouez-le vigoureusement pendant 15 secondes. Ensuite, incubez le tube à température ambiante pendant trois minutes. Après trois minutes, centrifuger l’échantillon à 12 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Une fois la centrifugation terminée, récupérez la phase aqueuse par le haut du tube de centrifugation. Transférez ensuite la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’isopropanol et un microlitre de huit microgrammes par microlitre de glycogène de qualité ARN à la phase aqueuse.

Agitez rapidement l’échantillon pendant 10 secondes et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, centrifuger l’échantillon à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décantez le surnageant une fois la course terminée.

Ajoutez un millilitre d’éthanol froid à 75 % et tourbillonnez brièvement pour laver le granulé obtenu. Encore une fois, centrifugez l’échantillon à 7500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, expulsez tout l’éthanol et séchez le granulé à température ambiante.

Une fois que la pastille a séché, dissolvez-la dans 30 microlitres d’eau libre de DNAse/RNAse. Ensuite, incubez l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, lisez la concentration de l’ARN à 260 nanomètres dans le spectrophotomètre et ajustez-la à 15 nanogrammes par microlitre.

Pour constituer le mélange maître RT-PCR, ajoutez les deux tampons de réaction X RT-PCR, le mélange d’enzymes RT-PCR en une étape, les amorces directes et inverses et l’eau distillée exempte d’ARNA/DNAse. Répartissez le mélange maître dans des tubes PCR de 0,2 millimètre et ajoutez l’ARN total pour chaque échantillon respectif. Démarrez ensuite la réaction PCR.

Une fois la RT-PCR terminée, ajoutez cinq microlitres de six colorants de chargement X au produit amplifié. Ensuite, chargez cinq microlitres du mélange sur un gel d’agarose à 2 %. Démarrez l’unité d’électrophorèse à 100 volts pendant 40 minutes.

Tout d’abord, l’efficacité de différents mélangeurs est étudiée. Pour ce faire, l’inclusion des niveaux de l’exon 7 SMN2 et du GAPDH dans les fibroblastes SMA transfectés avec les mélangeurs est analysée. L’image en gel montre l’inclusion de l’exon 7 où les bandes supérieure et inférieure représentent l’ARN SMN2 inclus et exclu de l’exon 7.

L’efficacité d’inclusion est également quantifiée à 78 à 98 % lorsqu’elle est transfectée avec les mélangeurs un à cinq. En revanche, aucun résultat significatif n’est obtenu lorsque les mélangeurs six à huit sont utilisés pour transfecter les fibroblastes SMA du patient par rapport au contrôle. Dans l’expérience, le GAPDH est utilisé comme témoin.

Ensuite, une PCR quantitative est effectuée pour analyser l’expression relative du SMN2 pleine longueur par rapport à GAPDH. Une forte augmentation de la quantité du niveau de transcrit SMN2 est observée lors de la transfection avec les mélangeurs un à trois et cinq, par rapport au témoin. Le niveau d’expression de la protéine SMN est également étudié, ce qui montre une augmentation du niveau d’expression de la protéine SMN dans le fibroblaste du patient transfecté avec des mélangeurs de un à cinq.

Une forte augmentation de 1,5 à 1,9 fois du taux de protéine SMN est observée. Ici, le contrôle utilisé est la cofiline. Au contraire, les mélangeurs six à huit ne modifient pas le niveau d’expression de la protéine SMN.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter des oligo-sens antisens aux fibroblastes et d’évaluer l’efficacité in vitro.