Homogène Time-resolved Förster Resonance Energy axée sur le transfert test pour la détection de l’insulinosécrétion

L’objectif global de cette procédure est d’induire et de quantifier avec précision les niveaux d’insuline sécrétée par les cellules sécrétrices d’insuline. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diabète, telles que les principaux mécanismes de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose dans les cellules bêta pancréatiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier avec précision et rapidité la sécrétion d’insuline en réponse à la stimulation du glucose et de détecter les effets potentiels des médicaments sur la sécrétion.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie et à la découverte de médicaments pour traiter le diabète de type 2, car elle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes du dysfonctionnement métabolique induit par les médicaments. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la sécrétion d’insuline à partir de lignées de cellules bêta immortalisées, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les îlots pancréatiques intacts. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés, en raison des multiples étapes de manipulation des cellules et des préparations médicamenteuses.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons voulu mettre au point un test rapide pour étudier les actions des médicaments dopaminergiques sur la sécrétion d’insuline. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de manipulation des cellules sont difficiles à apprendre en raison de la nature délicate des cellules et de l’importance de la précision pour assurer la cohérence du test entre les expériences. Tout d’abord, cultivez les cellules INS-1E comme indiqué dans le protocole texte.

Une fois que les cellules atteignent la confluence souhaitée, aspirez le milieu. Lavez les cellules avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de trypsine à 025 % dans les cellules, puis laissez les cellules dans l’incubateur pendant trois à quatre minutes à 37 degrés Celsius.

Désactivez la trypsine en ajoutant neuf millilitres de milieu complet. Ensuite, transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pour former une pastille.

Après centrifugation, dissoudre la pastille dans cinq millilitres de milieu frais. Pipetez 10 microlitres de cellules remises en suspension du tube et mélangez-les avec 10 microlitres de colorant vital bleu trypan pour évaluer la viabilité. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules vivantes et mortes et assurez-vous que 90 % des cellules sont vivantes.

Après avoir compté, ajoutez un million de cellules par millilitre dans un milieu frais RPMI 1640, puis ensemencez 0,5 millilitre de 500 000 cellules INS-1E dans chaque puits d’une plaque à 24 puits recouverte de poly-L-lysine. Laissez l’assiette dans l’incubateur pendant une journée entière. Le lendemain, retirez le média et ajoutez 500 microlitres de milieu frais RPMI 1640 dans chacun des puits.

Incuber la plaque pendant encore 24 heures pour que les cellules se propagent à la surface du puits. Pour effectuer le test, préparez d’abord le tampon KRB, puis aspirez le milieu de chacun des puits et lavez-le avec une solution saline tamponnée au phosphate préchauffée, deux fois. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de tampon KRB, complété par de l’albumine sérique bovine, mais pas de glucose, dans chaque puits.

Laissez la plaque de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Préparez des dilutions en série des médicaments dans le tampon KRB, complétées par une concentration finale de 10X de 200 millimolaires de glucose. Après l’étape de privation de glucose, pipetez 50 microlitres de médicaments dilués en série dans chacun des puits correspondants.

Pour la stimulation du glucose, ajoutez les médicaments dilués en série respectifs en présence de 20 millimolaires de glucose. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Une fois la stimulation terminée, collectez les surnageants et transférez-les dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre étiquetés.

Transférez 10 microlitres de chaque surnageant collecté dans une plaque de 96 puits. Ajoutez 90 microlitres de KRB dans chaque puits pour obtenir un taux de dilution de un à 10. Mélangez les dilutions pour assurer l’homogénéité.

Ensuite, obtenez la courbe standard de l’insuline pour le dosage de l’insuline HTRF. Ensuite, ajoutez 10 microlitres chacun des échantillons d’insuline standard et les surnageants de dosage dilués dans une plaque à 96 puits. Préparez le mélange d’anticorps dans un à deux donneurs pour accepter un rapport dans le tampon de détection.

Après avoir préparé le mélange d’anticorps, ajoutez-en 30 microlitres dans chacun des puits dans une plaque de 96 puits. Fermez la plaque et incubez à température ambiante. Après deux heures d’incubation, lire la plaque avec le mélange d’anticorps sur le lecteur de plaques.

Utilisez le module optique HTRF approprié à 665 et 620 nanomètres pour la lecture et utilisez 200 flashs pour chaque puits. Tout d’abord, une courbe standard de l’insuline est tracée pour extrapoler les valeurs réelles d’insuline à partir des échantillons de test. La courbe standard montre que la lecture de fluorescence ratiométrique obtenue augmente significativement en fonction des concentrations standard d’insuline humaine prédéfinies.

Ensuite, le niveau basal de sécrétion d’insuline par les cellules INS-1E est étudié en présence ou en absence de glucose de 20 millimolaires. À partir du graphique, il montre que les cellules sécrètent environ 100 nanogrammes par millilitre d’insuline en présence de glucose. Fait intéressant, le niveau d’insuline est presque la moitié, soit environ 15 nanogrammes par millilitre en l’absence de glucose.

Ensuite, les cellules sont incubées en présence de concentrations croissantes de dopamine avec 20 millimolaires de glucose. L’insuline sécrétée est normalisée à la valeur moyenne du pourcentage maximal d’insuline de chaque puits. Le graphique montre que la dopamine inhibe le GSIS, indiquant ainsi l’importance fonctionnelle des récepteurs dopaminergiques dans le GSIS.

Ce graphique montre que la bromocriptine, un médicament contre le diabète de type 2, est plus puissante que la dopamine pour induire un GSIS. Ce graphique montre qu’avec une concentration croissante de quinpirole, un agoniste D2, bien que moins efficace que la bromocriptine, présente une puissance similaire à celle de la dopamine pour stimuler le GSIS. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de pipeter avec soin et cohérence. Suite à cette procédure, d’autres tests fonctionnels tels que le dosage cyclique AMP HDRF peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les effets dopaminergiques des médicaments sur la signalisation en aval. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du métabolisme pour explorer d’autres voies de sécrétion endocrinienne dans les lignées cellulaires immortalisées et les îlots pancréatiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer avec précision la sécrétion d’insuline à partir des cellules à l’aide de la HDRF.