Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

L’objectif global de ce protocole est de permettre une évaluation qualitative et quantitative des modèles d’arborisation des axones du motoneurone à l’aide d’un microscope à feuille de lumière et d’un logiciel d’analyse d’images sur des embryons de souris. Cette méthode peut aider à comprendre le développement des motoneurones en coordination avec des mouvements complexes. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez observer et imager les modèles d’arborisation axonale des motoneurones sous différents angles et analyser quantitativement chaque nerf individuel.

Ya-Ping Yen et Ee Shan Liau, deux étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, fixez les embryons individuellement dans une plaque de 24 puits avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS fraîchement préparé par puits à quatre degrés Celsius sur un shaker pendant la nuit. Le lendemain, lavez les embryons fixés au moins trois fois, chacune pendant cinq à 10 minutes, avec un millilitre de 1X PBS et incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Ensuite, perméabilisez chaque embryon dans un millilitre de PBST à 0,5 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur. Bloquez chaque échantillon avec un millilitre de 10 % FBS préparé en 1X PBS pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un agitateur. Par la suite, incubez chaque embryon avec un millilitre d’anticorps primaire anti-GFP à 4 degrés Celsius pendant 72 heures en agitant constamment.

Après l’incubation primaire de l’anticorps, laver chaque embryon avec un millilitre de PBST à 0,5 % pendant un à deux jours à quatre degrés Celsius sur un agitateur. Ensuite, appliquez un millilitre d’anticorps secondaire et incubez toute la nuit dans l’obscurité à quatre degrés Celsius en secouant constamment. Le lendemain, lavez chaque embryon avec un millilitre de PBST à 0,5 % au moins trois fois à quatre degrés Celsius sur un agitateur pendant deux à trois jours.

Ensuite, incubez chaque embryon dans un réactif de clarification commercial avec un indice de réfraction de 1,49 nd dans un tube de 1,5 millilitre à l’abri de la lumière à température ambiante pendant la nuit. Configurez des optiques d’éclairage 5X/0.1 et des optiques de détection 5X/0.16. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon.

Préparez la chambre d’échantillonnage en la remplissant d’une solution éclaircissante. Pour monter l’embryon, préparez une pointe de pipette P200 en coupant la partie supérieure de manière à ce qu’elle s’adapte au diamètre du capillaire et retirez la partie pointue pour la fixation de l’échantillon. Ensuite, faites fondre l’extrémité émoussée de la pointe de la pipette à l’aide d’une petite flamme.

Éteignez la flamme et fixez rapidement l’embryon verticalement sur l’extrémité fondue. Ajustez la partie supérieure de la pointe de la pipette avec le capillaire de l’échantillon et placez la chambre d’échantillon préparée dans le microscope. À l’aide du logiciel d’imagerie, sélectionnez Localiser capillaire sous l’onglet Localiser et ajustez les axes X, Y et Z.

Ensuite, sélectionnez Localiser l’échantillon et zoomez sur 0,6X pour vous concentrer sur l’embryon. Laissez le tampon de la chambre s’équilibrer avec l’embryon pendant un certain temps pour éliminer tous les débris ou bulles. Pour l’acquisition d’images, sous l’onglet Acquisition, définissez les paramètres du trajet lumineux, tels que les objectifs de détection, le filtre de blocage laser, le répartiteur de faisceau, les caméras et les lasers.

Cochez la case Balayage pivot pour la réduction des ombres. Ensuite, définissez les paramètres d’acquisition, Bit Bepth à 16 bits, Zoom à la plage comprise entre 0,36 et 0,7X, éclairage de site unique ou éclairage de site double. Cliquez sur Continu et définissez l’intensité du laser, le temps d’exposition, la puissance du laser et la position de la feuille de lumière.

Ensuite, appuyez sur Stop pour terminer l’acquisition d’image. Il est important de s’assurer que l’échantillon transparent est positionné dans le trajet lumineux le plus court pour permettre l’acquisition détaillée d’images de fines structures arborisées sur les nerfs moteurs individuels. Pour l’acquisition multidimensionnelle, définissez la pile Z en déplaçant la position z de la première et de la dernière image.

Cliquez sur Optimal pour définir le numéro de tranche. Cliquez ensuite sur Démarrer l’expérience pour acquérir la pile Z sélectionnée. Lorsque c’est fait, enregistrez l’image au format czi.

Pour quantifier l’arborisation de l’axone, ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’imagination. Ajustez la couleur, la luminosité et le contraste de l’image à l’aide de la fenêtre de réglage de l’affichage pour détecter les filaments en fonction du contraste d’intensité locale. Ensuite, cliquez sur l’icône Ajouter de nouveaux filaments et sélectionnez l’algorithme Autopath dans le menu déroulant.

Sélectionnez la région qui vous intéresse, puis définissez les points de départ et d’amorçage en attribuant les mesures de diamètre les plus grandes et les plus fines qui peuvent être mesurées à l’aide du mode Tranche. Attribuez un point de départ à la limite de la région d’intérêt. Pour effectuer l’ajout ou la suppression manuelle de points de départ, modifiez d’abord le mode de pointeur, naviguez dans la sélection, puis effectuez une touche Maj et cliquez avec le bouton droit sur les points d’intérêt.

Ensuite, sélectionnez des seuils manuels pour les points de départ afin de vous assurer que toute l’arborescence visible est marquée. Ensuite, ajoutez ou supprimez manuellement des points de départ. Cochez la case Supprimer les segments déconnectés et supprimez les points de départ autour des points de départ.

Ensuite, ajustez le seuil de soustraction d’arrière-plan et terminez le processus. Il est nécessaire d’éliminer les artefacts d’arrière-plan et de confirmer que la trajectoire du détecteur reflète la véritable arborisation des axones pour une quantification précise. À la fin, choisissez le style et la couleur souhaités.

Sous l’onglet Statistiques, sélectionnez Détaillé et utilisez le numéro de filament, les points terminaux de la dendrite pour quantifier les terminaisons nerveuses motrices en tant qu’indicateur de l’arborisation de l’axone moteur. Ensuite, exportez l’image de l’axone reconstruit sous forme de fichier tiff. LSFM fournit une visualisation 3D détaillée de l’arborisation des axones moteurs dans les embryons de souris.

Les motoneurones sont soumis au protocole décrit ci-dessus et marqués avec la GFP exprimée par voie transgénique. Pour imager l’arborisation axonale plus en détail et effectuer une quantification, le grossissement peut être ajusté de manière à ce que chaque structure finement arborisée puisse être révélée. Enfin, le modèle d’arborisation axonale des nerfs individuels des membres antérieurs peut être reconstruit à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

L’algorithme autopath du logiciel trace le filament et quantifie le nombre total de terminaux axonaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons et d’imager les axones des motoneurones d’embryons de souris à l’aide d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière. De plus, vous saurez comment évaluer quantitativement le modèle d’arborisation de chaque nerf moteur individuel par MRS.