Name: Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Apprenez à visualiser et quantifier l'arborisation des axones des neurones moteurs dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP par microscopie à feuille de lumière. Cette méthode permet une analyse 3D détaillée du développement neuronal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LSFM expériences et analyse des données ont été réalisées en partie en utilisant les microscopes optiques avancés de la Division du Service de l’Instrument à l’Academia Sinica et avec l’aide de Mme Shen Shu-Chen. Nous remercions Mme Sue-Ping Lee de l’Imaging Core Facility de IMB pour une assistance technique considérable avec l’analyse d’image Imaris. Scientifique anglais édition Core les microbilles ont examiné le manuscrit. Ce travail est financé par l’Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), plus (104-2311-B-001-030-MY3) et INDH (INRH-EX106-10315NC).

Tous les animaux vivants ont été entretenus dans un agent pathogène spécifique gratuit (SPF) animalerie, approuvé et supervisé par IACUC de l’Academia Sinica.
1. la fixation
<ol><li>Recueillir des embryons de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) puis décapiter et éviscérer leur.</li>
	<li>Difficulté les embryons individuellement en plaques 24 puits avec 1 mL/puits de paraformaldéhyde fraîchement préparée de 4 % en 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) du jour au lendemain. Incuber à 4 ° C dans un agitateur.</li>
	<li>Lavez les embryons fixes au moins 3 x, chacun pendant 5-10 min, avec 1 mL de PBS 1 x et incuber une nuit à 4 ° C dans un agitateur pour enlever le paraformaldéhyde résiduelle.</li>
</ol>2. ensemble-Mont Immunostaining
<ol><li>Permeabilize chaque embryon dans 1 mL de 0,5 % PBS-Triton-X-100 (PBST) durant la nuit à 4 ° C dans un agitateur.</li>
	<li>Bloquer chaque échantillon avec 1 mL de 10 % FBS préparé dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C dans un agitateur.</li>
	<li>Incuber l’embryon avec 1 mL d’anticorps primaire anti-GFP (1:1, 000 dilution à 10 % FBS) à 4 ° C pendant 72 h avec agitation constante pour intensifier le signal GFP des nerfs moteurs.</li>
	<li>Après l’incubation de l’anticorps primaire, se laver avec 1 mL de 0,5 % PBST au cours des 1-2 jours à 4 ° C dans un agitateur, changeant le 0,5 % PBST au moins trois fois.</li>
	<li>Appliquer 1 mL d’anticorps secondaire (1:1, 000 dilution à 10 % FBS) et incuber pendant la nuit dans l’obscurité à 4 ° C sous agitation constante.</li>
	<li>Laver 3 x avec 1 mL de 0,5 % PBST à 4 ° C dans un agitateur au cours des 2 ou 3 jours. Conserver les échantillons dans du PBS 1 x à 4 ° C jusqu'à la veille de l’imagerie. Remarque : Les embryons peuvent être disséqués en segments plus petits avant d’effacer, selon celle qui part des embryons sont projeté. Les membres antérieurs sont conservés dans cette approche expérimentale (Figure 1 a).</li>
	<li>Incuber l’embryon dans un réactif de compensation commerciale avec un indice de réfraction ND 1.49 dans un tube de 1,5 mL, abri de la lumière à température ambiante pendant la nuit, afin de restituer l’embryon transparent pour l’imagerie. NOTE : Le volume de la compensation de réactif est environ cinq fois celle du volume de l’échantillon.</li>
</ol>3. LSFM (2 – 3 h)
<ol><li>
Montage de l’échantillon
	<ol>
<li>Mis en place 5 X / 0,1 optique de l’éclairage et 5 X / 0,16 optique de détection. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon (1,5 mm de diamètre intérieur, vert) et placez-les dans le microscope. Remarque : Reportez-vous au manuel de fonctionnement du microscope pour les procédures d’installation détaillées.</li>
		<li>Monter l’embryon comme suit :<ol>
<li>Préparer l’embout de la pipette P200 en coupant la partie supérieure afin qu’elle s’adapte au diamètre du capillaire et enlever la partie triangulaire (~ 3 mm) pour la fixation de l’échantillon.</li>
			<li>Faire fondre la fin mitigée de l’embout de la pipette à l’aide d’une petite flamme.</li>
			<li>Éteindre la flamme et de fixer rapidement l’embryon verticalement sur la fin fondue.</li>
			<li>Monter la partie supérieure de l’embout de la pipette avec l’échantillon capillaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laisser le tampon de la chambre s’équilibrer avec l’embryon pendant 1 min débarrasser des débris ou des bulles.</li>
		<li>En utilisant le logiciel d’imagerie, sélectionnez Locate capillaire sous l’onglet Rechercher et réglez x, y, axes z pour positionner le capillaire de l’échantillon.</li>
		<li>Sélectionnez l’échantillon de localiser et de zoom à 0,6 X de se concentrer sur l’embryon. Faire pivoter l’embryon pour s’assurer que l’axe longitudinal de la branche image s’aligne sur le trajet optique des deux sources lumineuses (Figure 1 b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisition d’images
	<ol>
<li>Sous l’onglet Acquisition , définir les paramètres de parcours lumineux tels que les objectifs de détection, laser blocage filtre séparateur de faisceau, caméras et lasers. Remarque : Le canal de la GFP est utilisé dans cette expérience (longueur d’onde Excitation : 488 nm ; filtre d’émission : BP 505 à 545 nm, séparateur de faisceau : SPS LP 560).</li>
		<li>Cochez la case scan de pivot pour la réduction de l’ombre.</li>
		<li>Définir les paramètres d’acquisition : profondeur de couleur, 16 bits ; Zoom, 0,36-0,7 X ; illumination de simple-côté (gauche/droite) ou double-côté éclairage.</li>
		<li>Cliquez sur continue , puis définir l’intensité du laser, durée d’exposition, puissance laser et position de la nappe de lumière d’acquérir des images plus nettes. Remarque : La puissance du laser est maintenue aussi basse que possible réduire au minimum le photovieillissement.</li>
		<li>Appuyez sur STOP pour mettre fin à une acquisition d’images.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisition de multidimensionnelle
	<ol>
<li>Définir la z-pile en déplaçant la position Z pour la première et la dernière image. Cliquez sur Optimal pour définir le nombre de tranche.</li>
		<li>Cliquez sur Démarrer expérience pour acquérir la z-pile sélectionnée.</li>
		<li>Lorsque c’est fait, enregistrez l’image au format .czi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Traitement de l’image (facultatif)
	<ol>
<li>Procéder à la fusion double côté sous le canal de Lightsheet traitement si dual-side illumination est appliquée. MultiView de traitement n’est nécessaire si plusieurs vues sont acquis pour combiner des images sous plusieurs angles.</li>
		<li>Créer une image 2D en utilisant les données de pixels plus hautes intensité le long de l’axe de projection sous le canal de la Projection d’intensité maximale .</li>
		<li>Sous canal de copie , cliquez sur sous-ensemble pour sélectionner des sous-ensembles d’images du jeu original.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la quantification de l’arborisation Axon (30 Min pour chaque nerf individuel)
<ol><li>Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’imagerie (par défaut, l’image qui contient les données XYZ est ouvert en mode Surpass et comme un point de vue 3D-rendu).</li>
	<li>Ajuster la couleur de l’image, luminosité et contraste à l’aide de la fenêtre de Réglage de l’affichage (Edit | Réglage de l’affichage montrent) pour détecter les filaments basées sur le contraste de l’intensité locale.</li>
	<li>Cliquez sur l’icône Ajouter nouveaux Filaments et sélectionnez l’algorithme Autopath (pas de boucle) dans le menu déroulant.</li>
	<li>Sélectionnez la région d’intérêt (dans ce cas, l’axone segmentation d’intérêt). Cliquez sur suivant lorsque vous avez terminé.</li>
	<li>Définir les points de départ et semences en attribuant les mesures de diamètre plus grand et plus mince, ce qui peuvent être mesurées en utilisant le mode de la tranche .</li>
	<li>Attribuer un point de départ au bord de la région d’intérêt. Pour obtenir le manuel ajout ou la suppression des points de départ, d’abord changer le mode de pointeur (naviguer | Sélectionnez) et puis MAJ + clic-droit sur les points d’intérêt.</li>
	<li>Sélectionnez manuelles seuils pour les points de la graine pour s’assurer que tous l’arborisation visible est marqué. Changer le mode de pointeur (naviguer | Sélectionnez) et puis MAJ + clic gauche sur les points d’intérêt pour manuellement ajouter ou supprimer des points de la graine. Remarque : Il est important de supprimer manuellement les signaux et les bruits de fond des nerfs voisins.</li>
	<li>Cochez la case Supprimer les graines points autour de points de départ.</li>
	<li>Vérifiez supprimer déconnecté segments afin de permettre l’exclusion des points qui sont trop loin et qui peuvent représenter des bruits de fond. Indiquer la Longueur maximale de Gap à l’étape suivante pour définir la limite supérieure de l’exclusion.</li>
	<li>Ajustez le seuil pour la soustraction de fond, qui utilise un filtre gaussien pour estimer l’intensité de l’arrière-plan de chaque voxel.</li>
	<li>La valeur seuil automatique pour diamètre de dendrite en utilisant l’algorithme approximatif transversale .</li>
	<li>Ignorez les étapes pour le calcul de la colonne vertébrale.</li>
	<li>Terminer le processus et choisissez le style désiré et la couleur.</li>
	<li>Décochez la case de volume dans les Propriétés pour afficher uniquement les axones reconstituées.</li>
	<li>Sous l’onglet statistiques , sélectionnez détaillée. Utiliser des filaments de no. Dendrite Terminal Points pour quantifier les terminaisons nerveuses moteur comme indicateur de l’arborisation axone moteur. NOTE : Les statistique annotation peut être ajoutée si vous le souhaitez.</li>
	<li>Exporter l’image de l’axone reconstruit comme un fichier .tif.</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
<li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).</li>
<li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A%3AEphA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li>
<li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li>
<li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+%28DINE%29+during+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li>
<li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li>
<li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret%2FGfralpha+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li>
<li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li>
<li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li>
<li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685(2017).</li>
<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Plusieurs étapes dans le protocole peuvent être soumis à des changements dans certaines circonstances. Par exemple, la durée de fixation varie selon l’âge des embryons, variant de 2 h à 1 ou plusieurs jours à l’aide de paraformaldéhyde fraîchement faites. Étant donné que la fixation est effectuée avant toute monture immunomarquage, des anticorps qui sont sensibles aux protéines de réticulation, méthanol peut servir un autre agent fixateur. Pour un rapport signal sur bruit élevé sur la coloration, il est nécessaire d’opti...

MNs de la colonne vertébrale sont la partie du système nerveux central mais innervent des muscles périphériques pour contrôler le mouvement. Dans la pays en développement de la moelle épinière, progéniteurs MN (PMN) sont établis selon les signaux émanant de la notochorde et des somites adjacents. Toutes différencient MNs post-mitotiques sont ensuite générés à partir de PMN, éventuellement donnant lieu à une série de sous-types de MN le long de l’axe Rostro de la moelle épinière1,2. La colonne vertébrale MNs sont topographiquement et anatomiquement bien organisés. Leur arrangement morphologique est en corrélation avec la position de leurs cibles respectives dans la périphérie de3. En atteignant leurs objectifs de muscle, axones recevoir des facteurs neurotrophiques cellulaires et exogènes que les inciter à s’étendre et de la branche plus loin dans les muscles. Innervation et défauts ramifications peuvent contribuer à l’échec pour former des jonctions neuromusculaires (NMJ). Par exemple, des facteurs neurotrophiques gliales (GDNF)-Pea3 induite est indispensable pour ces axones dans maximus cutanée (CM) et4,5les muscles grand dorsal (LD). En outre, des embryons de souris knock-out DINE montrent défectueuse arborisation des nerfs phréniques dans le diaphragme, provoquant la mortalité et une insuffisance respiratoire immédiatement après la naissance de6,7. Cette dernière étape de maturation de MN (c.-à-d., projection axonale et ramification) est donc essentielle pour assurer la communication entre les neurones et les cellules cibles.
Pour afficher les modèles de l’arborisation, chercheurs procéder normalement à imagerie confocale ou microscopie de fluorescence biphotonique sectionnés ou entier-montent des échantillons8,9,10. Deux de ces techniques de microscopie génèrent acceptable résolution et profondeur de pénétration. Microscopie de fluorescence biphotonique implique l’excitation des fluorophores par absorption simultanée de deux photons de faible énergie,11. Puisque l’excitation biphotonique utilise le rayonnement infrarouge, la fréquence d’excitation baisse contribue à la diffusion réduite et meilleure pénétration tissulaire jusqu'à 1 mm dans les tissus, permettant ainsi l’imagerie avec une plus grande profondeur. Microscopie confocale supprime par les filtres de signaux de l’out-of-focus et recueille uniquement la lumière dans le plan focal12. Avec cette approche, images des échantillons provenant des plans focaux différents peuvent être combinés pour produire une image tridimensionnelle de (3D) via une fonction de Z-pile. Néanmoins, intensité du signal est réduite car la plupart de la lumière est bloquée et les ouvertures numériques hautes obscurcir la profondeur de champ. Plus important encore, les deux techniques contribuent au photovieillissement sévère et phototoxicité puisque l’échantillon entier reçoit illumination même lorsque qu’un avion est imagé à un moment donné.
Pour contourner ces lacunes, LSFM est devenu une alternative favorisée, avec l’avantage d’être rapide et efficace à la lumière et les moins phototoxique13,14. En outre, LSFM permet l’imagerie multi-vues. Cette approche est particulièrement adaptée à la visualisation des axones moteurs et leurs terminaux de dispersion comme ils se propagent dans l’espace 3D. LSFM surpasse les deux autres options parce que les échantillons sont montés sur une scène qui permet la rotation autour d’un axe vertical et les mouvements le long des x, y et les axes z. Cette configuration permet non seulement pour une vue bloqué au minimum de l’échantillon, mais aussi le choix d’un chemin de l’illumination souhaitable, une lacune de la microscopie biphotonique et confocale, qui nécessitent le montage d’échantillons sur une lame plate. LSFM est donc l’outil plus approprié pour l’imagerie 3D d’arborisation axon et pour la quantification des terminaisons nerveuses moteur dans des embryons de souris.

<table><tbody><tr><td>Hb9 ::GFP</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>005029</td><td>Recueillir les embryons du jour embryonnaire 12.5 (E12.5)</td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde (PFA)</td><td></td><td></td><td>Pour 200ml : Ajouter 20ml 10X PBS, 8g PFA dans ddH2O. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH (10N). Filtrer, stériliser et conserver à -20 °C.</td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Pour 1L : Ajouter 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4 et compléter avec de la ddH2O. Autoclave et magasin chez RT.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Mouton polyclonal anti-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-mouton</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 réactif nettoyant</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml micro tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>24 puits plaque</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA Pince à épiler</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>Iris Ciseaux striaght sharp/sharp</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels de microchirurgie, à usage unique</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1</td><td>microscope Carl Zeiss Microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.0 logiciel d’analyse d’images</td><td>Bitplane, Zurich, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9 ::GFP souris)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de l’axone moteur navigation et la quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de fluorescence nappe de lumière

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Les neurones moteurs spinaux (MNs) étendent leurs axones pour communiquer avec leurs cibles innervating, contrôlant ainsi le mouvement et les tâches complexes chez les vertébrés. Ainsi, il est essentiel de découvrir les mécanismes moléculaires de comment moteur axones Placez-vous, arborize et innervent leur musculature périphérique cible pendant le développement et la dégénérescence. Bien que les lignées de souris transgéniques Hb9::GFP ont longtemps servi de visualiser les trajectoires de l’axone moteur durant le développement embryonnaire, des descriptions détaillées de l’ensemble de l’arborisation terminale axon restent incomplets en raison de la complexité du modèle et limitations de la microscopie optique actuelle. Nous décrivons ici un protocole amélioré qui combine la microscopie de fluorescence de nappe de lumière (LSFM) et analyse d’images robuste qualitativement et quantitativement visualiser des axones moteurs de développement. Ce système peut être facilement adopté pour traverser mutants génétiques ou des modèles de maladies MN avec des lignes Hb9::GFP , révélant de nouveaux mécanismes moléculaires qui conduisent à des irrégularités dans la navigation de l’axone moteur et arborisation.

LSFM fournit une visualisation 3D détaillée d’arborisation de trajectoire et axon MN chez la souris embryons. Sous champ lumineux, tissus apparaissent complètement transparents après une immersion dans le réactif de compensation commerciale. Aucun retrait ou gonflement de l’échantillon a été remarqué après une semaine de stockage en apurant réactif avant l’imagerie. Sous le canal de la fluorescence, neurones moteurs sont étiquetés avec GFP transgéniquement expresse (film 1</strong...

Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

L’objectif global de ce protocole est de permettre une évaluation qualitative et quantitative des modèles d’arborisation des axones du motoneurone à l’aide d’un microscope à feuille de lumière et d’un logiciel d’analyse d’images sur des embryons de souris. Cette méthode peut aider à comprendre le développement des motoneurones en coordination avec des mouvements complexes. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez observer et imager les modèles d’arborisation axonale des motoneurones sous différents angles et analyser quantitativement chaque nerf individuel.Ya-Ping Yen et Ee Shan Liau, deux étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, fixez les embryons individuellement dans une plaque de 24 puits avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS fraîchement préparé par puits à quatre degrés Celsius sur un shaker pendant la nuit. Le lendemain, lavez les embryons fixés au moins trois fois, chacune pendant cinq à 10 minutes, avec un millilitre de 1X PBS et incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Ensuite, perméabilisez chaque embryon dans un millilitre de PBST à 0,5 % pendant la nu

visualization-motor-axon-navigation-quantification-axon-arborization

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Cette vidéo présente une méthode de suivi du transport axonal dans les motoneurones à l’aide d’un système de chambre microfluidique. Il s’agit de cultiver des tissus embryonnaires de la moelle épinière de souris dans des puits recouverts de polymères avec un milieu nutritif pour induire la croissance axonale. Le mouvement des organites colorés par fluorescence dans l’imagerie en direct confirme le transport axonal bidirectionnel.

Suivi du transport axonal d’organites dans les motoneurones à l’aide d’un dispositif microfluidique

Source : &lt; style='text-decoration :none ;' href='https ://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Visualisation de la navigation axonale motrice et quantification de l’arborisation axonale chez les embryons de souris à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière. J. Vis. Exp. (2018). &lt;p...

Visualisation des projections des motoneurones et de la ramification des axones à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

Source : Boyer, N. P. et al., imagerie et analyse du transport des neurofilaments dans le nerf tibial de souris excisé. J. Vis. Exp. (2020) &lt;p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'&gt;Cette vidéo démontre la méthode de photoactivation par fluorescence pour analyser le transport des neurofilaments dans les axones myélinisés des nerfs périphériques. En suivant les neurofilaments verts photoactivés marqués au fluorophore, la...

Imagerie par photoactivation par fluorescence du transport des neurofilaments dans les axones de souris myélinisés 

Source : Jeong, S. Visualisation du modèle de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la visualisation des projections axonales dans les embryons de Drosophila. L’immunomarquage des motoneurones, la dissection précise pour exposer les structures neuronales et la microscopie à contraste d’interférence différentielle révèlent collectivement une architecture neuronale détaillée, mettant l’accent sur les modèles de projection axonale.

Visualisation des modèles de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez la drosophile

Nous présentons ici un protocole optimisé pour génotypager, colorer et préparer des souris fœtales pour l’imagerie des projections axonales du nocicepteur périphérique chez l’animal entier, comme méthode efficace pour évaluer les phénotypes de croissance des axones sensoriels chez les souris génétiquement modifiées en développement.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Apprenez à visualiser et quantifier l'arborisation des axones des neurones moteurs dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP par microscopie à feuille de lumière. Cette méthode permet une analyse 3D détaillée du développement neuronal.

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

Explorer plus de vidéos