Identification des Sites de facteur de Transcription Olig2 génomique fixation aiguë purifiée cellules PDGFRα + par immunoprécipitation de la chromatine Low-cellule analyse de séquençage

L’objectif global de cette expérience est d’analyser la liaison à l’échelle du génome du facteur de transcription des oligodendrocytes deux dans des cellules précurseurs d’oligodendrocytes du cerveau purifiées de manière aiguë en effectuant un immunopanning, une immunoprécipitation de la chromatine à faible cellule, un séquençage à haut débit et une analyse des données bioinformatiques. Cette méthode est un outil puissant pour étudier la régulation transcriptionnelle à l’échelle du génome et les mécanismes épigénétiques, qui jouent un rôle important dans la différenciation et le développement cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est largement applicable dans le ChIP-seq d’autres facteurs de transcription avec n’importe quel type de cellule en nombre limité, y compris les cellules primaires purifiées de manière aiguë sans prolifération in vitro.

La démonstration de la procédure sera assurée par Yanan You, un post-doctorant de mon laboratoire. Elle est co-auteure de cet article. Pour sélectionner les cellules PDGFR-alpha-positives, préparez une plaque pour l’immunopanoramique.

Préparez deux autres plaques pour la déplétion des cellules endothéliales et de la microglie. Ensuite, enduisez une boîte de Pétri de 10 centimètres avec 30 microlitres d’immunoglobuline anti-rat de chèvre. Ensuite, agitez la plaque afin de vous assurer que toute la surface de la plaque est uniformément recouverte de la solution de revêtement.

Laissez la boîte de Pétri toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, diluez 40 microlitres d’anticorps anti-PDGFR-alpha de rat avec 12 millilitres de DPBS contenant 0,2 % d’albumine sérique bovine. Ensuite, lavez la plaque d’immunoglobuline G avec 10 millilitres de 1X DPBS pendant trois fois consécutives.

Ensuite, incubez la plaque d’immunoglobuline G avec une solution d’anticorps PDGFR-alpha à température ambiante pendant quatre heures. Après quatre heures, ajoutez soigneusement le DPBS le long de la paroi latérale de la plaque pour laver trois fois la plaque recouverte d’anticorps anti-PDGFR-alpha pour rat. Ne dérangez pas la surface revêtue de la plaque.

Ensuite, utilisez 20 millilitres de DPBS avec 2,3 microgrammes par millilitre de BSL-1 pour enduire deux plaques de Petri de 15 centimètres pendant deux heures. Après l’incubation, ajoutez soigneusement 20 millilitres de DPBS le long de la paroi latérale de la plaque pour laver la plaque BSL-1 trois fois. Ne dérangez pas la surface revêtue.

Après le lavage, centrifugez la suspension unicellulaire à 300 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, ajoutez 15 millilitres de tampon d’immunopanning à la pastille cellulaire. Ensuite, incubez les suspensions unicellulaires de deux cerveaux de souris de manière séquentielle sur deux boîtes de Pétri recouvertes de BSL-1.

Ensuite, laissez les plaques pendant 15 minutes à température ambiante. Agitez la plaque toutes les cinq minutes pendant l’incubation. Ensuite, faites tourner doucement la plaque pour recueillir toutes les cellules non adhérentes de la suspension cellulaire.

Ensuite, ensemencez les cellules sur la plaque recouverte d’anticorps PDGFR-alpha de rat. Incuber la plaque pendant 45 minutes à température ambiante. Au bout de 45 minutes, remuez à nouveau l’assiette.

Ensuite, jetez la suspension cellulaire. Ensuite, rincez la plaque avec du DPBS huit fois pour éliminer les cellules non adhérentes. Examinez la plaque au microscope.

Ensuite, ajoutez la solution de détachement cellulaire sur la plaque recouverte d’anticorps PDGFR-alpha de rat. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant ce temps, secouez la plaque pour déloger les cellules adhérentes et examinez-la au microscope.

Ensuite, centrifugez les cellules à 300 fois g à température ambiante. Après la centrifugation, remettre en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de milieu de culture cellulaire OPC. Ensuite, comptez les cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan dans un hémocytomètre.

Après avoir compté dans un hémocytomètre, ajoutez 20 000 OPC purifiés dans un millilitre de milieu de culture cellulaire OPC pour la réaction ChIP. Ensuite, ajoutez 27 microlitres de 36,5 % de formaldéhyde à température ambiante pendant 10 minutes. Cela fixera les cellules.

Après 10 minutes, ajoutez 50 microlitres de glycine à 2,5 molaires sur les cellules fixes pendant cinq minutes à température ambiante. L’ajout de glycine arrêtera la réticulation ADN-protéine. Ensuite, lavez les cellules réticulées avec un millilitre de tampon HBSS avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase.

Ensuite, centrifugez les cellules dans une centrifugeuse pré-refroidie à 300 fois g à quatre degrés Celsius. Après la réticulation des OPC purifiés, les cellules réticulées doivent être lavées à l’aide d’une solution HBSS glacée, et les étapes restantes de ChIP doivent être effectuées à quatre degrés, sinon l’anticorps ne peut pas précipiter correctement l’ADN génomique. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de tampon de lyse complet à la pastille cellulaire et laissez sur la glace pendant cinq minutes.

Ensuite, pipetez 75 microlitres de tampon HBSS glacé avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, cisaillez la chromatine du lysat cellulaire dans un système de sonication pré-refroidi avec cinq cycles de 30 secondes de marche et 30 secondes de programme d’arrêt. Une fois la chromatine cisaillée, centrifugez le lysat cellulaire à 14 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

À la fin de la centrifugation, récupérez le surnageant. Ensuite, diluez 100 microlitres de chromatine cisaillée avec un volume égal de tampon ChIP glacé avec inhibiteur de protéase. Ensuite, ajoutez un microlitre d’anticorps anti-Olig2 de lapin à 180 microlitres de chromatine cisaillée diluée.

Incuber les tubes sur une roue rotative pendant 16 heures à quatre degrés Celsius à 40 tours par minute. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de billes de protéine A prélavées dans le tube de réaction ChIP dans une chambre froide. Encore une fois, incubez les tubes ChIP à quatre degrés Celsius pendant encore deux heures sur la roue rotative.

Au bout de deux heures, laissez le tube de réaction ChIP sur la grille magnétique pendant une minute. Ensuite, lavez la pastille de perle avec 100 microlitres de quatre tampons de lavage chacun pendant quatre minutes sur une roue rotative à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon d’élution à la pastille de bille.

Incuber le tube de réaction à 65 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois que l’ADN double brin est dénaturé, déphosphorylez l’extrémité trois premiers de l’ADN simple brin en ajoutant de la phosphatase alcaline de crevette. Ensuite, ajoutez une queue poly-T à l’ADN simple brin en utilisant la désoxynucléotidyltransférase terminale.

Ensuite, recuit l’amorce poly-dA de l’ADN sur la matrice d’ADN simple brin. Ensuite, amplifiez la bibliothèque de séquences ChIP à l’aide d’amorces directes et inverses pour l’indexation. Le nombre de cycles de PCR pour la préparation de la banque dépend de la quantité d’ADN de départ.

Une bonne préparation de banque nécessite une quantification précise de la quantité d’ADN d’entrée. Trop ou trop peu de cycles de PCR peuvent influencer la concentration de la bibliothèque, ainsi que la complexité, conduisant à des artefacts de PCR. À l’aide de billes paramagnétiques, sélectionnez les fragments allant de 250 à 500 paires de bases dans la bibliothèque de séquences ChIP amplifiées par PCR.

Utilisez un dispositif d’électrophorèse capillaire à puce microfluidique pour examiner la qualité de la bibliothèque de séquences ChIP sélectionnée. Pour évaluer la pureté des OPC immunopanés, des études d’immunomarquage sont effectuées. En utilisant l’anticorps NG2, marqueur de la lignée OPC, il montre que la majorité des cellules immunopanées de l’anticorps PDGFR-alpha sont NG2 positives.

Ensuite, une PCR quantitative est effectuée pour vérifier l’enrichissement en PDGFR-alpha. Le graphique obtenu montre une faible expression de Tuj1, un marqueur neuronal indiquant un enrichissement significatif en PDGFR-alpha par rapport aux cellules cérébrales dissociées. Des résultats similaires sont obtenus montrant une faible expression de tous les autres marqueurs, tels que GFAP, Mog et Mbp, indiquant un enrichissement en PDGFR-alpha.

Ensuite, la qualité de la bibliothèque de séquences ChIP est analysée. L’électrophérogramme représente un pic clair pour le facteur de transcription Olig2 allant de 250 à 500 paires de bases après sélection de la taille du produit PCR de la bibliothèque. Ici, l’histogramme montre la clonalité de la balise, pour vérifier les métriques de contrôle qualité obtenues avant l’appel de pointe.

La barre indique que plus de 90 % des lectures sont mappées à un seul emplacement génomique. Ensuite, on obtient un graphique de corrélation des brins, qui représente un pic enrichi correspondant à la longueur prédominante du fragment. Dans le graphique, les lignes rouges représentent la longueur de lecture à 50 paires de bases et la longueur du fragment à 130 paires de bases, respectivement, indiquant ainsi des données de haute qualité.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer le site de liaison à l’ADN à l’échelle du génome des facteurs de transcription et d’autres protéines dans les cellules primaires ou les cellules rares. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les OPC primaires du cerveau de la souris par immunopanning et comment effectuer l’expérience ChIP-seq en utilisant un faible nombre de cellules.