Enregistrement et Modulation de l’activité épileptiforme dans des tranches de cerveau rongeur couplé aux baies de microélectrodes

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuromodulation pour le traitement de l’épilepsie, telles que la zone du cerveau et le protocole de stimulation les mieux adaptés. Le principal avantage de cette technique est que les tranches de cerveau de rongeur représentent un modèle simplifié et réaliste des circuits cérébraux, tandis que les réseaux de microélectrodes permettent d’observer plusieurs points à une distance inter-électrode connue. Pour préparer le MEA, répartissez uniformément le mastic élastomère sur la surface inférieure de la chambre d’enregistrement et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles.

Ensuite, montez la chambre d’enregistrement sur le MEA à l’aide d’une pince à épiler et appliquez une légère pression. Étalez une couche d’étanchéité autour du bord extérieur de la chambre d’enregistrement. Ensuite, placez l’ensemble MEA/chambre dans un environnement fermé et humide, et laissez-le durcir à température ambiante pendant la nuit.

Pour préparer le banc d’enregistrement, réglez le bain chaud à 32 degrés Celsius. Ensuite, versez l’ACSF de maintien dans les chambres de maintien et de préchauffage. Faites buliser les solutions avec un mélange de 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, et retirez les bulles piégées à l’aide d’une pipette Pasteur inversée.

Gardez la chambre de maintien à température ambiante et placez la chambre de préchauffage dans le bain chaud. Préparez des coupes horizontales de cerveau de l’hippocampe et du cortex selon les procédures standard et laissez-les récupérer dans la chambre de maintien à température ambiante pendant au moins 60 minutes. Versez 4AP ACSF dans une chambre d’incubation.

Ensuite, faites-le bouillonner avec un mélange de 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, et retirez toutes les bulles piégées à l’aide d’une pipette Pasteur inversée. Ensuite, couvrez la chambre et transférez-la dans le bain chaud. Assurez-vous que les températures de préchauffage ACSF et 4AP ACSF sont de 30 à 32 degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette Pasteur en verre inversé, transférez une tranche de cerveau dans la chambre de préchauffage et laissez reposer le tissu pendant 25 à 30 minutes. Ensuite, transférez la tranche de cerveau dans la chambre d’incubation 4AP ACSF et laissez-la reposer pendant 60 minutes. Laissez l’ACSF 4AP s’écouler à travers le tube de perfusion dans un bécher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air à l’intérieur.

Ensuite, arrêtez le flux de solution. Placez la puce MEA sèche à l’intérieur de l’amplificateur MEA et fixez la tête de l’amplificateur. Par la suite, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférez 4AP ACSF dans le réservoir d’entrée et de sortie de la chambre d’enregistrement.

Fixez la canule chauffante à un support magnétique et placez sa pointe à l’intérieur de l’orifice d’entrée de la chambre d’enregistrement. Ensuite, fixez le support magnétique à une bande magnétique sur la tête d’amplification MEA. Connectez la tubulure de perfusion à la canule et la canule au thermostat.

Ensuite, placez l’aiguille d’aspiration dans le réservoir de sortie. Vérifiez qu’il y a une pression négative en immergeant l’aiguille d’aspiration dans l’ACSF et vérifiez qu’il y a un bruit d’aspiration constant à basse fréquence. Ensuite, réglez le régulateur de débit pour qu’il autorise un débit d’un millilitre par minute et commencez à perfuser.

Une fois que l’ACSF 4AP s’écoule à travers la canule, allumez le thermostat. Réglez la canule chauffante à 37 degrés Celsius et la base MEA à 32 degrés Celsius pour atteindre une température de 32 à 34 degrés Celsius à l’intérieur de la chambre d’enregistrement. Ensuite, placez l’électrode de référence externe dans le réservoir d’entrée de la chambre d’enregistrement.

Une fois que le niveau 4AP ACSF et la température d’enregistrement sont stabilisés comme vous le souhaitez, tournez les robinets de perfusion et d’aspiration en position d’arrêt pour les arrêter temporairement. Transférez rapidement une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement MEA à l’aide d’une pipette Pasteur en verre inversé. Ajustez sa position sur la zone d’enregistrement MEA selon vos besoins à l’aide d’une pipette Pasteur polie au feu et recourbée ou d’un petit pinceau doux et compact.

Placez l’ancre de maintien sur la tranche de cerveau. Redémarrez la perfusion et l’aspiration en remettant leurs robinets d’arrêt en position marche. Prenez une photo de la tranche de cerveau à l’aide d’une caméra montée sur une platine de microscope inversé.

Ensuite, exécutez le script mapMEA sur le logiciel de l’ordinateur pour démarrer l’interface graphique afin de cartographier les électrodes. Cliquez sur le bouton Parcourir pour charger l’image de la tranche de cerveau. Assurez-vous que l’électrode de référence apparaît dans la colonne supérieure de la moitié gauche du MEA.

Cliquez ensuite sur le bouton Activer le pointeur. Sélectionnez les électrodes supérieure et inférieure dans la colonne la plus à gauche du réseau pour marquer les coordonnées XY pour le redressement de l’image et le mappage des électrodes. Dans le menu déroulant du type de tranche, sélectionnez Horizontal.

Cochez la case Structures par défaut. À l’aide des boutons-poussoirs numérotés situés sous l’image de la tranche de cerveau, sélectionnez les électrodes correspondant au retour sur investissement, puis cliquez sur les boutons-poussoirs correspondants dans le panneau de structure pour les attribuer. Répétez cette étape pour chaque retour sur investissement.

Ensuite, appuyez sur le bouton Enregistrer. Le logiciel générera un dossier de résultats contenant un tableau indiquant les électrodes et les zones d’intérêt sélectionnées. Pour l’étude électrophysiologique, allumez l’unité de stimulus au moins 10 minutes avant le protocole de stimulation pour permettre l’auto-étalonnage et la stabilisation.

Ensuite, démarrez le logiciel de contrôle du stimulus et vérifiez que le stimulateur et l’amplificateur MEA sont correctement connectés, comme indiqué par une LED verte sur le panneau principal du logiciel de contrôle du stimulus. Configurez la stimulation en configuration bipolaire. Connectez l’unité de stimulus au sol.

Ensuite, connectez les paires d’électrodes en contact avec la couche cellulaire pyramidale du subiculum CA1/proximal parmi celles cartographiées avec le script mapMEA. Pour acquérir des données, appuyez sur le bouton de lecture dans le panneau principal du logiciel d’enregistrement. Enregistrer au moins quatre décharges ictales.

Ensuite, exécutez un test d’entrée/sortie rapide pour identifier la meilleure intensité de stimulus. Pour ce faire, utilisez le panneau principal pour concevoir une impulsion de courant biphasique positive-négative carrée d’une durée de 100 microsecondes par phase. Dans l’onglet Amplitude d’impulsion, entrez une amplitude d’impulsion initiale de 100 microampères par phase.

Réglez l’impulsion de stimulation à 0,2 hertz ou moins en ajoutant un intervalle entre les impulsions de cinq secondes ou plus. Augmentez l’amplitude du stimulus de 50 à 100 microampères à chaque essai jusqu’à ce que la stimulation puisse évoquer de manière fiable des événements de type interictal dans les cortex parahippocampiques. Pour la modulation électrique de l’ictogenèse limbique, programmez l’unité de stimulus pour qu’elle délivre le protocole de stimulation d’intérêt, et utilisez l’amplitude du stimulus identifiée lors du test d’entrée/sortie.

Après l’arrêt de la stimulation, vérifiez la récupération du réseau à l’état d’avant le stimulus en enregistrant au moins quatre décharges ictales. Cette figure montre les enregistrements de l’activité ictale induite par 4AP dans le cortex entorhinal et le cortex périrhinal pendant la condition de contrôle, la stimulation périodique à un hertz et pendant la récupération lors du retrait du stimulus. Ce graphique montre la quantification de l’effet de la stimulation périodique à un hertz, ce qui indique une réduction significative du temps total de saisie pendant la stimulation.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de placer rapidement et correctement la tranche de cerveau sur le MEA. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la manipulation pharmacologique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la contribution des neurotransmetteurs ou du canal ionique à l’activité épileptiforme et à l’effet de la neuromodulation.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer l’interaction des réseaux neuronaux dans la santé et la maladie dans les neurones cultivés ainsi que dans les tranches de cerveau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer et de moduler électriquement l’activité épileptiforme induite par la four-aminopyridine dans des tranches de cerveau de rongeur couplées à des AEM.