Name: Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Découvrez la méthode de boursouflure d'aspiration cutanée pour récolter des cellules T spécifiques d'antigène et des cytokines in vivo chez l'humain. Cette technique non invasive permet d'étudier les réponses immunitaires adaptatives et le développement vaccinal.

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Nous tenons à remercier Mads Radmer Jensen pour ses conseils pratiques et académiques ; Lau Lindqvist et Kaare Svejstrup pour fournir une expertise technique ; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt et Harpøth W. Solveig pour leur assistance technique ; le personnel de la clinique de Gentofte TB pour leur formation en administration de PPD ; et tous les bénévoles pour avoir participé à l’étude. Ce projet est financé par le programme européen Commission H2020 [numéro de licence TBVAC2020 643381], et nous tenons à remercier les partenaires du consortium des échanges fructueux.

Toutes les méthodes décrites ci-dessous, y compris l’utilisation de volontaires humains, ont été approuvés par le Comité danois santé éthique de la recherche (H-15002988) et l’Agence danoise de Protection des données (jr.nr. 2015-57-0102). PPD doit être un produit certifié approuvé pour usage humain et administré dans le dosage correct fourni par le fabricant. Toute déviation de la posologie ou l’administration peut exiger des autorisations éthiques supplémentaires et bénévoles doivent donner leur consentement éclairé.
1. Test cutané à la tuberculine
<ol><li>Obtenir le consentement éclairé oral et écrit de volontaires. Avant l’injection, s’assurer que le bénévole comprend et accepte la procédure, y compris les effets indésirables possibles. Remarque : Les critères d’Inclusion spécifiques au présent protocole sont âge > 18 ans et une vaccination par le BCG documentée. Critères d’inclusion peuvent varier en fonction de la question de la recherche (c.-à-d., un critère d’inclusion supplémentaire pourrait être une preuve de TCT positif).</li>
	<li>Utilisez une solution toute faite de PPD à usage humain [20 tuberculine unités (TU) / ml]. Désinfecter le bouchon d’un flacon à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.</li>
	<li>Préparer le site d’injection<ol>
<li>Localiser le point d’injection sur la face ventrale de l’avant-bras du bénévole.</li>
		<li>Placez le bras palm-up sur une surface plate et choisissez une zone sur le tiers supérieur de l’avant-bras, environ 5-10 cm de l’articulation du coude. Tenez-vous à l’écart des cicatrices, veines ou la peau endommagée.</li>
		<li>Désinfecter la zone à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la solution PPD<ol>
<li>Utiliser une seringue 1 mL stérile avec un 27-30G/court (p. ex., 12 mm) fixé l’aiguille.</li>
		<li>Doucement, mélanger et aspire 0,1 mL de la solution PPD. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles visibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injection intradermique de PPD Remarque : Cette étape explique comment effectuer un dépôt unique de PPD, mais plusieurs dépôts de PPD dans le même bras est possible. Toutefois, cela peut nécessiter une approbation éthique spécifique.<ol>
<li>La peau est tendue et pointer l’aiguille à un angle de 5-15° la peau avec le biseau vers le haut.</li>
		<li>Insérez l’extrémité de l’aiguille dans la couche cutanée de la peau et assurez-vous que l’embout est presque visible à travers l’épiderme.</li>
		<li>Injecter lentement 0,1 mL de solution PPD. Remarque : S’il est administré correctement, une papule pâle de 6-10 mm apparaîtra immédiatement. La papule disparaît après environ 10 min.</li>
		<li>Lorsque vous effectuez deux ou plusieurs dépositions, viser une séparation maximale (5-10 cm) les sites d’injection tout en gardant une bonne distance de la zone du coude et du poignet. NOTE : Cela empêche une confluence potentielle de la réponse du test cutané et permet le positionnement ininterrompu de deux chambres d’aspiration.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. évaluation de la réaction de la peau - jour 3
<ol><li>Après 48 à 72 heures, notez la taille de la réaction de la peau. Mesurer l’induration (l’enflure) et pas l’érythème (la rougeur) de la réaction.</li>
	<li>Palper le dur gonflement à l’aide des doigts, puis marquez les bords de l’induration à l’aide d’un stylo à bille. Utilisez une règle pour mesurer le diamètre de l’induration et noter le résultat en mm. Remarque : Une lecture de la taille de l’induration peut guider le choix du diamètre de l’orifice pour la chambre d’aspiration.</li>
</ol>3. d’aspiration Blister Induction - jour 7
<ol><li>Assembler le dispositif d’aspiration. Note : Unités de dispositif d’aspiration sont des pompes à vide avec chambres ci-joint pour l’induction de boursouflure d’aspiration. Le dispositif utilisé dans cette démonstration est faite sur mesure, mais les unités de dispositif d’aspiration sont également disponibles dans le commerce. La pompe doit être réglable dans la plage de -20 à-40 kPa et de fournir une pression négative stable et fiable. Approbation éthique régionale devrait être obtenue avant d’effectuer des expériences à l’aide de cette méthode.<ol>
<li>Tout d’abord, préparer la chambre d’aspiration par l’assemblage de la plaque à orifice inférieur et la plaque de la fenêtre avec la chambre et le tuyau de raccordement. Serrer le tuyau de raccordement à la chambre de la pompe à vide. Remarque : Les chambres devraient inclure une plaque de fond avec un trou pour l’induction de la boursouflure, qui devrait être adapté pour le contact avec la peau humaine, et d’un plateau supérieur avec une fenêtre, permettant le contrôle visuel de la cloque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer le diamètre d’orifice optimale de la plaque à orifice par rapport à la taille de la réaction de la peau ; plus la taille de l’orifice, plus la boursouflure.</li>
	<li>Désinfecter le diaphragme et la peau des volontaires à l’aide de tampons d’alcool.</li>
	<li>La chambre d’aspiration s’attacher à la peau.<ol>
<li>Assurez-vous que les bras des bénévoles se repose confortablement.</li>
		<li>Assurez-vous que le trou dans le fond de la chambre d’aspiration se trouve sur la réaction de PPD afin que le centre de la réaction de la peau soit visible.</li>
		<li>Sécuriser la chambre sans serrer à l’aide de sangles : lorsqu’on applique une pression négative, la Chambre va adhérer à la peau et maintenir sa position.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allumez le dispositif d’aspiration et régler la pression à-20 kPa.</li>
	<li>Après 30 min, augmenter la pression négative à-25 kPa.</li>
	<li>Après 60 min, accroître encore la pression négative à-30 kPa.</li>
	<li>Maintenir la pression à-30 kPa jusqu'à ce qu’une "ampoule" est complètement formée. S’assurer que les pressions négatives prévues dans le présent protocole sont spécifiques à un instrument sur mesure. Il peut être nécessaire d’ajuster la pression légèrement lors de l’application du protocole dans d’autres contextes. Remarque : La phase d’induction de boursouflure varie de 60 à 180 minutes (1-3 h) avec la formation de boursouflure réels survenant dans les derniers 30 min. cloquage est souvent associée à une sensation de picotement. Les cloques peuvent survenir comme des vésicules qui fusionnent simples ou multiples. Si rupture de boursouflure ou l’hémorragie se produit, il est conseillé de mettre fin à l’induction de boursouflure en relâchant lentement la pression.</li>
	<li>Une fois le blister est entièrement formé, relâcher la pression et retirer soigneusement la chambre d’aspiration de la peau sans rupture de la coque.</li>
	<li>Appliquer un pansement doux sur la zone de la peau environnante et placez un bouchon dur (par exemple, d’un tube en plastique de 50 mL) sur le blister.</li>
	<li>Fermer le capuchon avec ruban chirurgical non allergènes, suivie d’un bandage élastique doux.</li>
	<li>Instruire le volontaire pour éviter un effort physique excessif sur la zone de boursouflure pendant la prochaine 12 à 24 heures.</li>
</ol>4. récolte du Blister liquide - jour 8
<ol><li>Le 8ème jour, délicatement retirer le pansement protecteur et désinfecter la cloque avec un spray de désinfection de la peau.</li>
	<li>Utiliser une seringue stérile de 2 mL avec une aiguille de 23G pour récolter le contenu de boursouflure. Introduire l’aiguille dans le côté haut/latérale sur le toit de la boursouflure et aspirer lentement le liquide. Évitez de toucher le fond de la cavité, mais n’oubliez pas de récolter tout le liquide.</li>
	<li>Appliquer un pansement sur le blister s’est effondré.</li>
	<li>Transférer le liquide de boursouflure dans un tube stérile. Noter le volume.</li>
	<li>Faites tourner le fluide boursouflure vers le bas à 600 x g, en utilisant une centrifugeuse sur table pendant 4 min.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un autre tube et Resuspendre le culot dans 500 µL de milieu cellulaire. NOTE : Les cellules sont maintenant prêts pour dépouillement et analyse. Surnageants peuvent être conservés à -20 à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>5. analyses de succion Blister de cellules et les fluides
NOTE : Fourniture d’instructions détaillées pour l’analyse des cellules et le liquide de vésicules d’aspiration de la peau n’est pas dans le champ d’application du présent protocole. Toutefois, pour obtenir des résultats représentatifs pour ce rapport, tache intracellulaire écoulement cytometry et multiplex analyses ont été effectuées. La méthodologie est décrit brièvement ci-dessous.
<ol><li>Cytométrie en flux<ol>
<li>Stimuler des suspensions de cellules fraîches de 1 x 105 isolées de cloques d’aspiration de 1 volontaire vaccinés par le BCG avec 10 µg/mL de PPD et incuber les cellules à 37 ° C et 5 % CO2. Inclure des cellules non stimulées pour une incubation parallèle.</li>
		<li>Stimuler les suspensions 1 x 106 PBMC obtenues de 1 volontaire vaccinés par le BCG avec 10 µg/mL de PPD et incuber le mélange à 37 ° C et 5 % CO2. Inclure des cellules non stimulées pour une incubation parallèle.</li>
		<li>Après 2 h, traiter toutes les cellules avec Brefaldin A et monensine et les incuber pendant 6 h à 37° C.</li>
		<li>Colorer les cellules avec un panel de Live/Dead-tache-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 et anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Inclure des contrôles de la FMO dans le panneau PBMC.</li>
		<li>Effectuer une analyse de cytométrie en flux avec un cytomètre en flux et analyser les résultats à l’aide du logiciel concerné.</li>
		<li>Porte sur la production de cytokine CD3 + CD4 + CD8-sous-ensembles à l’aide de la stratégie de blocage suivante : maillots - > viable CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + ou IL-2 +.</li>
		<li>Porte sur les populations de cellules effectrices mémoire à l’aide de la stratégie de blocage suivante : maillots - > viable CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Calculer les profils de cytokine individuels à l’aide de gating booléenne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Démonstrations de libération de cytokines<ol>
<li>Pour une démonstration d’une cytokine release in vivo, une analyse multiplexe permet de quantifier les niveaux d’il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 et IL-13 dans le liquide décongelés boursouflure d’aspiration de 4 volontaires.</li>
		<li>Pour une démonstration d’une libération de cytokines par les cellules obtenues de succion ampoules ex vivo, utilisation des cellules fraîches boursouflure d’aspiration puis PBMC extraite de 1 volontaire vaccinés par le BCG.</li>
		<li>Infecter le PBMC et cellules blister avec 100 unités formant colonie (UFC) de Mtb H37Rv d’aspiration et les incuber pendant 4 jours.</li>
		<li>Une analyse multiplexe permet de quantifier les niveaux d’il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 et IL-13 dans les surnageants de culture.</li>
		<li>Ajuster les mesures au-dessus de la plage de calcul de dosage jusqu'à la limite supérieure de calcul.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article décrit une procédure pratique pour l’étude de la mémoire immunitaire humaine responses in vivo, à l’aide de récolte de rappel et les cellules cutanées antigène par induction de boursouflure d’aspiration. TST a été utilisé comme un exemple de dépôt antigène intradermique et rappel de vaccin BCG. Enfin, un exemple de caractérisation de spécimen de SB par analyse en flux par cytométrie en flux et multiplex cytokine a été fourni, démontrant qu’environ un tiers des cellules SB étaient spécifiques à l’antigène polyfonctionnels T-cellules du phénotype mémoire effecteur.
Les étapes critiques du présent protocole comprennent la technique d’injection intradermique, l’induction de boursouflure d’aspiration et la ponction de boursouflure. Tout d’abord, une déposition intradermique correcte nécessite du personnel qualifié. Un dépôt erroné peut conduire à des résultats sous-optimaux. PPD est généralement un antigène cutané bien connu et sans danger, mais sa composition peut varier entre fabricants, limitant la comparabilité13,20. Ce rapport fournit des instructions pour un seul dépôt intradermique de 2 TU et éventuellement deux dépositions parallèles (TU de 2 x 2), qui peuvent nécessiter une approbation éthique supplémentaire. Toutefois, d’autres études ont utilisé 10 TU, qui augmentent la probabilité d’une réaction de peau forte10,21. Durant l’étape d’induction de SB, petites augmentations progressive de la pression négative permettra de réduire le risque de rupture de l’hémorragie et blister. Les chances de contamination par les globules rouges ou de leucocytes du sang sont généralement faible2. La technique de ponction aseptique empêche la contamination microbienne et en évitant tout contact entre l’aiguille de ponction et le sol de boursouflure cutanée réduit les impuretés de débris ou de cellules résidentes de la peau. Toutefois, certains chercheurs préfèrent récolter le liquide SB en appliquant une pression de roulement à la boursouflure perforé10. Il peut être nécessaire de percer le septum dans le blister. La technique de SB elle-même est minimalement invasive ; SBs s’est effondrés guérissent sans laisser de cicatrices et les infections sont très rares. 2 Toutefois, une certaine hypo pigmentation peut-être survenir et induction SB devrait probablement être évitée chez les personnes ayant des antécédents de cicatrices colloïde.
Limitations techniques comprennent les rendements faibles cellulaires totales et par conséquent peu d’options pour le stockage à long terme. Les relations entre le rendement de leucocyte, les réponses cliniques de TST, le blister taille et contamination érythrocytaire a été minutieusement décrit ailleurs2,10. Dans les expériences de BCG-rappel présentés ici (Figure 1), le rendement total médian de chaque blister a 50 000, ce qui implique un montage expérimental à petite échelle à l’aide de ces cellules, surtout si SBCs sont étudiés seulement15. Cependant, la population de lymphocytes T spécifique dans un échantillon de SB pour la plupart dépasse ce qui est trouvé dans des échantillons de PBMC dans les deux chefs de cellule relative et absolue. Dans l’exemple présenté dans la Figure 2, le nombre de séropositifs au triple PPD-cellules T spécifiques dans un échantillon de 100 000 cellules SB ont été plus de 2 x plus grand que le numéro trouvé dans 1 x 106 PBMC auprès du même donneur (données non présentées). Un visuel marquant de la réaction de TST est la méthode la plus courante clinique pour l’évaluation du mémoire de M. tuberculosis . À noter, la réaction immunologique adaptative sous-jacent ne pas pointe en même temps que la clinique peau réaction2,21. Pas tous vaccinés par le BCG ou Mtb-individus exposés développera les fortes réactions TST et stratégies pour la classification et une manipulation des échantillons de TST non-répondeurs, ainsi qu’une sensibilisation cutanée préexistante dans la population étudiée, Il faut tenir compte avant d’entreprendre un essai de rappel à l’aide de cette méthode. Aussi, en échantillonnage SB et marquant visuel, il existe un potentiel pour un biais théorique chez les individus atteints de réponses réduite de la peau due à global ou liées à la peau atteinte immunité comme on le voit, par exemple, dans l’infection à VIH et de certains groupes d’âge2, 13,18,20. En outre, une stimulation immunologique des tests répétés sur la réaction au TCT est bien connu20,22. Toutefois, les phénotypes cellulaires de SB restent plutôt constantes lorsque TCT sont répétées10. Cette observation supporte le rôle de rappel SB dans des études longitudinales de la réponse immunitaire cellulaire.
Pour les immunologistes de lymphocytes, rappel SB permet pour la récolte des fractions élevées de cellules antigène-spécifiques. Cependant, le calendrier de SB pour un échantillonnage d’un PPD-dépôts est critique car tant la composition cellulaire et le microenvironnement de la cytokine changent avec le temps. Dans ce protocole, cloques ont été induit défi après 7 jours et les cellules isolées principalement CD4 + effectrices T-lymphocytes mémoires y compris les fractions élevées de cellules avec une co-expression d’IFN-γ, TNF-α et IL-2. Ces observations sont conformes à précédentes études qui décrivent comment T-cell activation, la prolifération et la différenciation se produit dans la peau de PPD-amorcé2,15,21. Des études cinétiques de SB chez les individus sensibilisés à la PPD suggèrent que la réponse très précoce de la peau est imprécise ; Cependant, déjà dans les premiers jours suivant le PPD-défi, la réponse devient dominée par les T-cellules CD4 + (les deux phénotypes de mémoire centrales en mémoire et processeur d’effets ont été décrits) et, après 3 jours, la réponse est dominée par des fractions hautes de PPD spécifique cytokines produisant des lymphocytes T CD4 +2,8,10,15,21. Cette réponse adaptative cytokine reste détectable pendant plus de 2 semaines2,8,10,23. Jour 7 post-TST semble être le point de temps optimal pour la collection de cytokine production memory CD4 + T-cellules2. Cependant, autres points dans le temps, bien sûr, peut-être pertinents selon l’antigène et la réponse d’intérêt. À noter, dans une étude, la réponse adaptative de la PPD a été signalée au max un peu plus tôt avec une diminution de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire déjà à 5 jours post-TST10.
SB liquide contient des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires et autres protéines indiqués comme représentative de la peau microenvironnement15,24. Les études cinétiques ont montré que TNF-α et IFN-γ niveaux dans les fluide pic SB après 3 jours tout en crête de niveaux IL-2 après 7 jours,2,10, reflétant probablement la domination des réponses adaptatives à cette date ultérieure. Parce que les cellules SB ont été activées in vivo, ils présentent une haute cytokines spontanée, mais aussi un potentiel pour une version spécifique à la restimulation (figures 3 et 4).
Ce rapport se concentre sur l’immunité des lymphocytes CD4 +. Comme l’a démontré à la Figure 2, la majorité des T-cellules isolées étaient en effet CD4 +, alors qu’il n’y avait presque aucune CD8 + T-cellules d’aspiration blister de fluide. C’est en ligne avec d’autres études de SB PPD-rappel présentant de faibles proportions et une capacité migratoire inférieure de T-cellules CD8 + par rapport aux lymphocytes T CD4 + cellules2,8,10,23. Une autre caractérisation de la contribution de CD8 + serait préférable ; Cependant, c’est au-delà de la portée du présent rapport.
T-cellules sont considérés comme essentiels pour le contrôle immunitaire du Mtb; Toutefois, il a été difficile d’identifier un corrélat fiable de la protection dans la réponse immunitaire adaptative du sang25,26. Ce barrage routier entrave gravement le développement de nouveaux vaccins contre la tuberculose, comme il n’existe actuellement aucune alternative à l’efficacité de grandes et très coûteux essais27. Les développeurs de vaccin TB déterminent immunogénicité des vaccins par évaluer les changements dans les populations de lymphocytes de vaccins spécifiques dans le sang28,29petites et transitoires. Toutefois, il est douteux que la petite fraction des lymphocytes T spécifiques de l’antigène présent dans le sang en circulation est pertinente (c'est-à-direcapables de migrer vers le site des maladies infectieuses et représentant de la T-cellule-rich microenvironnement contrôle Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basé sur des études antérieures et les données présentées ici, le modèle de rappel cutanée SB représente un potentiel inexploité pour l’étude des lymphocytes T spécifiques vaccin. Non seulement le modèle permet-il un rappel d’un vaccin réponse générée depuis des décennies, il permet également l’évaluation de la mémoire du vraie potentiel dans un contexte spécifique des tissus15,18,19,21. Roman, des tests cutanés spécifiques, qui comprennent des antigènes composés aussi des vaccins contre la tuberculose sous-unité candidat, suggèrent de nouvelles possibilités pour l’évaluation de vaccins à l’aide de ce modèle28,32. En outre, des analyses transcriptomiques suggèrent qu’une médiation réponse immunitaire cellulaire générée en peau de PPD-contesté est similaire à la réponse trouvée dans le VTT-infection pulmonaire18.
Alors que le poinçon biopsies de la peau aussi permettant une récolte de cellules de la peau et fournissent de l’information spatiale, par rapport à l’échantillonnage de SB, la méthode est plus invasive et nécessite un traitement enzymatique ou mécanique pour préparer des suspensions de cellules individuelles,33. Mesures de marqueurs de cytokines et de cellule sont comparables entre les deux méthodes2,10.
La méthode d’aspiration blister a déjà été appliquée dans de nombreux domaines de la recherche médicale en dehors de la dermatologie, seul ou en combinaison avec un défi systémique ou locale de la peau. Les exemples incluent des études de septicémie, maladie lymphoproliférative liée au virus Epstein - Barr, neuropathie diabétique, les effets de l’apport de glucocorticoïdes et essais humains test anticorps thérapeutiques ou modèles pour les thérapies de T-cellule-cible10 ,34,35,36,37,38.
D’un point de vue thérapeutique, la méthode de rappel cutanée SB offre des avantages uniques pour étudier la mémoire centrale de lymphocytes potentielle et -une fois biologique et technique point de vue-la peau semble fournir un échantillonnage pertinentes compartiment2, 15,18,19,21. En particulier, par rapport à l’échantillonnage passif traditionnel consistant à diffuser les PBMC, permet à la méthode de rappel cutanée SB pour l’étude des lymphocytes T qui ont prouvé la capacité de migrer à partir du ganglion lymphatique en réponse à leur antigène pertinente et remplissez la section locale expansion et la différenciation dans un tissu-spécifique en vivo contexte15,18,19,21.
En conclusion, le modèle a démontré ici pourrait être pertinente pour des chercheurs dans le domaine de l’immunité adaptative humaine et agents ciblage de cellules T (c.-à-d., dans la recherche de vaccinologie ou cancer maladies infectieuses). Le modèle TST appliqué dans le présent protocole est, bien entendu, une importance particulière dans le domaine de la vaccinologie TB. Cependant, le concept de base de ce modèle est très applicable dans d’autres domaines de la recherche.

Un peau SB est une boursouflure artificiellement induite, qui permet pour la récolte des cellules et liquide directement à partir de la peau. La technique d’élevage SBs sous vide est un outil bien connu dans le domaine de la dermatologie utilisée pour l’étude de l’immunologie de la peau en santé et la maladie1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. le présent rapport illustre comment la technique de SB combinée avec rappel antigénique cutanée (méthode de rappel cutanée SB) peut fournir un aperçu direct des réponses immunes adaptatives in vivo.
Le principe de l’induction de SB est simple : une légère dépression est appliquée à une petite zone de la peau. La pression négative forcera éventuellement l’épiderme pour séparer le derme, créant une "ampoule" locale remplie de liquide et les cellules1,2,9. Le fluide boursouflure peut être récolté par une ponction à l’aiguille fine et le contenu peut être utilisé pour plus amples études in vitro.
Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour la méthode SB pour l’étude de la réponse immunitaire en vivo autres que les maladies limités à la peau10,11. L’étude de l’immunité adaptative chez les humains est limitée par le fait que les cellules et les cytokines d’intérêt sont échantillonnées à partir du sang périphérique parce qu’un échantillonnage envahissant du ganglion lymphatique ou muqueuse gastro-intestinale peut être inacceptable et contraire à l’éthique. Un exemple est l’étude des réponses de longue durée de vie de la mémoire humaine lymphocytes après vaccination12. Dans ces essais, l’échantillonnage des lymphocytes T pertinents peut être un grand défi, car la population concernée de cellules qui assurent la médiation immunité réside dans le tissu lymphoïde, et qu’un nombre très limité de cellules T spécifiques circule dans le sang périphérique.
La technique de SB offre une occasion unique pour l’étude des lymphocytes T mémoires et autres populations de cellules spécifiques. Suite à l’inoculation cutanée de l’antigène, lymphocytes T spécifiques de l’antigène sont recrutés dans leurs cachettes lymphoïdes de la peau et peut facilement être dégustée de la SB. Les applications de méthodologie et de la recherche de ce modèle de rappel cutanées ont été décrites par Akbar et al. en 2013,2. Un antigène couramment utilisé pour le rappel de la peau est le dérivé protéique purifié commercialement disponibles (PPD) de mycobactéries utilisés pour effectuer un test cutané (TCT) de tuberculine13, où le PPD est injecté dans la couche cutanée de la peau. Chez les personnes ayant une mémoire immunologique existante vers PPD [par exemple, les personnes ayant une infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ou une vaccination préalable de bacille de Calmette-Guérin (BCG)], la déposition de l’antigène entraîne une rappeler la réponse avec la migration de la peau et une expansion clonale in vivo des cellules CD4 + T-PPD spécifique2,11,14,15. En conséquence, fractions hautes de PPD spécifique polyfonctionnels CD4 + T-cellules s’accumulent dans la peau prête pour l’échantillonnage de SB. T-cellules prélevés par cette méthode sont avérés robustes et sont suffisamment abondantes pour être caractérisée par un éventail de tests immunologiques et un à long terme in vitro culture15. Ainsi, le modèle de rappel cutanée et l’induction de SB peuvent s’avérer une méthode utile pour l’étude in vivo lymphocytes réponses par ex vivo des analyses et une meilleure connaissance de cette approche peut-être bénéficier des chercheurs ayant des intérêts dans l’immunologie cellulaire et vaccinologie.
Ce rapport présente le premier guide par étapes sur la façon d’induire des cloques d’aspiration de la peau humaine dans peau injection PPD. Le modèle de rappel des antigènes cutanés est démontré à l’aide du TCT chez les volontaires vaccinés par le BCG. Enfin, l’analyse pertinente ex vivo des cellules et des cytokines isolé par SB est illustré. Les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules T spécifiques PPD obtenus par la méthode SB sont minutieusement décrits ailleurs2,10,11,16,17, 18 , 19. ce rapport vise à discuter des aspects pratiques et immunologiques de la méthodologie pour faciliter l’application de cette technique par d’autres groupes de recherche.

<table><tbody><tr><td>Gants à usage laboratoire</td><td>Imtex, Danemark</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Spray désinfectant&nbsp ;</td><td>Apotek, Danemark</td><td></td><td>82 % d’alcool, avec glycérine, pour la peau humaine&nbsp ;</td></tr><tr><td>Échanges d’alcool</td><td>Mediq, Danemark</td><td>1131892</td><td></td></tr><tr><td>PPD RT 23 « SSI » (2 T.U./0.1ml)</td><td>AJ Vaccines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Seringue Myjector avec aiguille fixe&nbsp ;</td><td>Terumo</td><td>A236</td><td>1 ml/29G/12mm</td></tr><tr><td>Règle&nbsp ;</td><td>non pertinent</td><td></td><td>&nbsp ; pour l’évaluation de la réaction cutanée</td></tr><tr><td>Stylo à bille</td><td>non pertinent</td><td></td><td>&nbsp ; pour l’évaluation des réactions cutanées</td></tr><tr><td>Unité d’aspiration pulmonaire portable</td><td>Laerdal Medical, Danemark</td><td>78000011</td><td>REMARQUE.&nbsp ; Modifié pour des plages inférieures à -40 kPa et fourni avec un manomètre. (réf. 1031107) par le département technique, Hvidovre Hospital Negative</td></tr><tr><td>Pressure Chamber Assembly, non chauffé avec tube de raccordement</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque à orifice, 47mm, 10mm</td><td>Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de joint d’instrument à pression négative</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangle de chambre à pression négative</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, États-Unis</td><td></td><td>Ruban</td></tr><tr><td>chirurgical Micropore</td> 12 pouces<td>&nbsp ; 3M</td><td>1533-1</td><td>2,5 cm x 9,1 m</td></tr><tr><td>Capuchon de tube en plastique de 15 ml</td><td>Sarstedt, Allemagne</td><td>62 547 254</td><td></td></tr><tr><td>Bandage Tubigrip</td><td>M&ouml ; lnlycke Health Care, Suède</td><td>1443</td><td></td></tr><tr><td>Cosmopor heril pansement adhésif</td><td>Hartmann</td><td>9008337</td><td>7,2 x 5 cm</td></tr><tr><td>2ml Seringue Concentrique Luer Slip&nbsp ;</td><td>Becton Dickinson&nbsp ;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>Aiguille Microlance 23G/30mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>300700</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock microtubes à centrifuger (autoclavés)</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp ; 0030120086</td><td>centrifugeuse autoclavée</td></tr><tr><td>Minispin plus</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Gibco AIM V Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12055-091</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules t humaines rappel responses in vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutanée antigène-Rappel modèles permettent pour l’étude de la mémoire humaine responses in vivo. Lorsqu’il est combiné avec l’induction de peau boursouflure d’aspiration (SB), ce modèle offre l’accessibilité aux rares populations de représentant de lymphocytes T spécifiques de l’antigène de la réponse de la mémoire cellulaire ainsi que la cytokine microenvironnement in situ.
Ce rapport décrit la procédure pratique de rappel cutané, une induction de SB et une récolte des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Pour illustrer la méthode, test cutané à la tuberculine est utilisé pour le rappel antigénique chez les individus qui, avant cette étude, a subi un vaccin bacille Calmette-Guérin contre une infection par Mycobacterium tuberculosis. Enfin, exemples d’analyse de cytométrie de flux multiplex et flux des spécimens de SB sont fournies, illustrant les fractions hautes de polyfonctionnels spécifiques de l’antigène CD4 + T-cellules disponibles par cette méthode d’échantillonnage par rapport aux cellules isolées du sang.
La méthode décrite ici est sûr et peu invasive, offre une occasion unique d’étudier les réponses immunitaires innée et adaptative in vivoet peut être bénéfique à une large communauté de chercheurs travaillant avec l’homme et l’immunité à médiation cellulaire réponses de mémoire, dans le cadre du développement de vaccins.

Huit volontaires adultes sains (âge médian : 30 ans, plage : 26-43 ans) à un documentés de la vaccination BCG précédent (délai médian de vaccination par le BCG : 5,5 ans, plage : 1-30 ans) ont été inclus. Les participants ont été contestées par voie intradermique avec 2 TU du PPD, suivie d’une évaluation de TST le jour 3. SBs ont été induites sur jour 7 et récoltés le jour 8, et toutes les ampoules ont été soulevées à l’aide de chambres de boursouflure d’aspiration diamètre orifice de 10 mm. Sept personnes ont reçu 2 vaccins séparés de PPD simultanément dans le même bras, suivi de 2 inductions de SB parallèles (veuillez vous reporter à la note au sujet de plusieurs dépôts de PPD étape 1.4 dans le protocoleci-dessous). Sang périphérique a été dessiné le jour 7 de plasma et d’un isolement de PBMC par centrifugation en gradient de densité. Plasma et le liquide surnageant de SBs ont été conservés à-20 ° C. Des cellules fraîches de SB (SBCs) ont été dénombrées à l’aide de la microscopie et coloration de nigrosine.
Les réponses cliniques de TCT et le rendement de la SBC sont présentés dans la Figure 1. La taille médiane des indurations TST était 10,25 mm (gamme : 0 - 20 mm) et cellule médiane par blister, on comptait 50 000 (fourchette : 15 000-210 000 cellules, nombre d’ampoules : 15). Deux des volontaires n’avaient aucune réponse clinique ou l’autre des 2 TCT et un rendement faible total cellule correspondante de 15 000 cellules/blister. Le rendement de la cellule a été associé à la réponse clinique moyenne de TST (Spearman r = 0,643, p = 0,094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figure 1 : Rendement cellulaire de succion boursouflure. (a) ce panneau montre un représentant microscopie des cellules isolées de SBs nigrosine déclenché 7 jours post-TST. (b) ce panneau montre les relations entre l’induration de TST moyenne (mm) et le rendement cellulaire moyen (nblister) dans 8 volontaires vaccinés par le BCG (nombre d’ampoules = 15). Les points représentent les mesures moyennes individuelles. Veuillez noter que les 2 points sont chevauchent comme 2 volontaires les deux eu une induration TST de 0 mm et un rendement de la cellule de 15 000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour démontrer la caractérisation de cytométrie de flux SB de flux, SBCs proviennent d’un bénévole âgé de 43 ans qui avait été vaccinés par le BCG 30 ans plus tôt et n’avait aucune exposition connue à Mtb. The SBCs ont été isolés après l’induction d’un blister individuel ( Induration : 1,4 mm/100 000 SBCs). La figure 2 montre les emplacements représentatifs de la coloration de cytokine intracellulaire de la SBCs versus PBMC.
Ce bénévole, la fraction du CD3 + CD4 + CD8-SBCs est passé de 67 % dans les cellules non stimulées à &gt; 90 % à une PPD dans vitro restimulation, tandis que la fraction du CD3 + CD4 + CD8-PBMC est demeurée constante (~ 51 %, Figure 2). Plus de 92 % de l' in vitro PPD-, ainsi que les CD3 + CD4 + CD8-SBCs non stimulées, étaient du type mémoire effecteur (CCR7 - CD45RA-, données non présentées). Les fractions globales des cellules CD3 + CD4 + CD8 spécifiques induites par la stimulation de la PPD étaient plus élevées dans les SBCs contre les PBMC (33,1 vs. 0,2 %, les échantillons non stimulées soustraits). Dans les PBMC, les fractions de polyfonctionnels PPD spécifique des cellules CD3 + CD4 + CD8 sont tous &lt; 0,05 %.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figure 2 : Parcelles de cytométrie en flux représentatif de SBCs par rapport à PBMC. Panneaux a et b Voir la densité représentante parcelles des populations CD8 + et CD4 + (a) non stimulés vs. Stimulée par le PPD PBMC (c) SBCs. panneaux b et d lent des parcelles de cytokine intracellulaire de coloration au CD3 + CD4 + CD8-cellules stimulées par PPD pour (b) PBMC et (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a>
Comme prévu, CD3 + CD4 + CD8-SBCs étaient activées in vivo, illustrée par une forte proportion des cellules coloration pour surexprimés cytokines (12 %), avec les cytokines prédominants en TNF-α et IFN-γ. Toutefois, lors de la PPD-stimulation, la cytokine cellules sécrétrices transféré vers une triple ou double-positifs TNF-α, IFN-γ + IL-2 + (17 %) et IFN-γ + TNF-α + (15 %) profil (Figure 3 b, profils PBMC provenant du même donneur sont inclus à titre de comparaison, en Figure 3 a). Les profils d’expression de cytokines pour des sous-ensembles de T-cellules effectrices stimulée par le PPD memory CD4 + (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) étaient comparables à la CD3 + CD4 + CD8-population présentée dans les Figures 2 et 3 (données non présentées).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figure 3: profils de Cytokine pour SBCs non stimulées et stimulée par le PPD CD4 + versus PBMC.  Ces panneaux montrent des profils individuels de production de cytokine (un) CD3 + CD4 + CD8-PBMC cellules et (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Les barres représentent des fractions, des profils de cytokines spécifiques de l’antigène dans les cellules non stimulées (barres blanches) et lors d’une stimulation in vitro avec PPD (barres de couleur).
Pour explorer le fluide SB comme une source d’information sur le microenvironnement de la cytokine sur le site de l’essai de la peau, les niveaux de cytokine ont été mesurées dans le liquide récolté de SBs induit 7 jours post-TST (Figure 4 a). Les concentrations médianes d’IFN-γ, TNF-α et IL-2 étaient 339 pg/mL, 19 pg/mL et 1 pg/mL, respectivement (n = 6). Les concentrations plasmatiques ont été généralement très faibles. Les cellules isolées de SBs produisent des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires ex vivo (Figure 4 b). Titrages des SBCs de 1 volontaire ont été cultivés pendant 4 jours en présence de virulentes M. tuberculosis ± PBMC autologue. Les niveaux d’IFN-γ étaient &gt; 30 fois plus élevée chez les cultures contenant SBCs, indépendamment de la présence de PBMC.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figure 4 : Niveaux de Cytokine dans le liquide de SB, plasma, et MTB -infecté surnageants. (a) ce panneau montre des niveaux de cytokine dans le plasma et les liquides surnageants SB de 6 volontaires vaccinés par le BCG. Les barres représentent les niveaux de cytokine médian ; les barres d’erreur représentent la plage. (b) ce panneau montre les niveaux de cytokines dans les surnageants de 4 600 µl ex vivo 4 jours cultures parallèles de 1 x 106 PBMC (barres noires), 1,75 x 105 SBCs (barres blanches) et 1 x 106 PBMC additionné de 0,5 ou 1,75 x 10 5 SBCs (barres grises) infectés par m. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous fournissons une démonstration du modèle rappel cutanée vésiculeuse d’aspiration. Le modèle permet un accès simple étudier les humains in vivo les réponses immunitaires adaptatives, par exemple dans le cadre du développement de vaccins.

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

L’objectif général de cette vidéo est de démontrer la méthode de rappel cutané des ampoules d’aspiration, qui nous permet de récolter des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et des cytokines représentatives de la réponse immunitaire adaptative in vivo. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les réponses cellulaires et l’immunité adaptative chez l’homme. Le principal avantage de cette technologie est qu’elle nous permet de récolter des lymphocytes T spécifiques de l’antigène directement sur le site de la réaction immunitaire en utilisant une méthode relativement non invasive et sûre.Le principe de base du rappel cutané est de déposer l’antigène dans la couche dermique de la peau. Chez les individus ayant une mémoire immunologique existante de l’antigène, les lymphocytes T migrent vers le site de réaction et induisent une réponse immunitaire locale où des lymphocytes T spécifiques sont développés clonalement et différenciés in situ. L’induction de vésicules d’aspiration au cours de cette réaction nous permet de récolter ces lymphocytes T spécifiques ainsi que les cytokines produites in vivo.Dans cette démonstration vidéo, nous utilisons le PPD comme antigène de rappel. La DPP est couramment utilisée pour le diagnostic de l’infection à Mycobacterium tuberculosis. Mais, il induit également des réactions cutanées chez les personnes précédemment vaccinées avec le vaccin BCG, comme vous le verrez dans cette vidéo.Le matériel pour le test cutané à la tuberculine comprend des tampons d’alcool, une seringue d’un millilitre avec une aiguille courte de calibre 27 à 30 et une solution de PPD approuvée pour l’usage humain. Utilisez une solution de DPP de 20 unités de tuberculine par millilitre. Désinfectez le flacon à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.Et veuillez noter que la composition peut varier d’un fabricant à l’autre. Localisez ensuite le site d’injection sur la face ventrale de l’avant-bras du volontaire et désinfectez la zone à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool. Utilisez une seringue stérile d’un millilitre avec une aiguille fixe de calibre 29 et de 12 millimètres.Mélangez doucement et aspirez 0,1 millilitre de la solution PPD. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles visibles. Stressez la peau et pointez l’aiguille à un angle de cinq à quinze degrés avec le biseau vers le haut.Insérez la pointe de l’aiguille dans la couche dermique de la peau et assurez-vous que la pointe est presque visible à travers l’épiderme. Injectez lentement une solution PPD de 0,1 millilitre. S’il est administré correctement, une papule de six à dix millimètres apparaîtra immédiatement.La papule disparaît au bout d’une dizaine de minutes. Des dépositions multiples de DPP sont possibles, mais pourraient nécessiter une approbation éthique supplémentaire. Si deux injections sont administrées, visez une séparation maximale tout en restant à une bonne distance de la zone du coude et du poignet.La réaction cutanée clinique apparaît dans les premières 24 heures et s’accompagne d’une sensation de démangeaison. Mesurez la taille de la réaction cutanée 48 à 72 heures après l’injection. Lors de l’évaluation de la réponse, il est important de mesurer l’induration et non l’érythème.Palpez le gonflement du chapeau à l’aide de votre doigt. Marquez ensuite les bords de l’induration à l’aide d’un stylo à bille. Enfin, à l’aide d’une règle souple, mesurez le diamètre d’induration et notez les résultats en millimètres.Après sept jours, il est temps d’induire l’ampoule d’aspiration. Pour l’induction de l’ampoule d’aspiration cutanée, utilisez une pompe à vide avec une chambre d’aspiration attachée. Utilisez un appareil disponible dans le commerce ou personnalisé.Il est important que la pompe soit réglable dans une plage de moins 20 à moins 40 kilopascals et qu’elle fournisse une pression négative stable et fiable. La partie inférieure de la chambre d’aspiration est constituée d’une plaque avec un petit trou qui est en contact avec la peau. Les plaques peuvent avoir un ou plusieurs trous et différentes tailles peuvent être appliquées afin de s’adapter à la réaction cutanée.Le haut de la chambre doit permettre une surveillance visuelle de l’ampoule. Avant l’induction, désinfectez la peau et la plaque de la chambre. Assurez-vous que le bras repose confortablement.Fixez et sécurisez la chambre, ici à l’aide de sangles réglables. Le centre de la réaction cutanée doit être visible à travers le trou de la plaque inférieure. Allumez l’appareil d’aspiration et réglez la pression négative à moins 20 kilopascals.Après trente minutes, augmentez la pression à moins 25 kilopascal. Après 60 minutes, augmentez encore la pression à moins 30 kilopascals. Et maintenez la pression ici jusqu’à ce qu’une seule ampoule soit complètement formée.La phase d’induction des ampoules dure normalement environ une à trois heures. La formation réelle de l’ampoule se produisant progressivement au cours des 30 dernières minutes, comme démontré ici à grande vitesse. S’il y a des signes de rupture de l’ampoule ou d’hémorragie, il est conseillé de relâcher lentement la pression et d’arrêter l’induction tôt.Les cloques peuvent apparaître sous forme de cloques uniques ou multiples. Le processus est souvent associé à une sensation de démangeaison. Une fois que le blister est complètement formé, relâchez la pression et retirez délicatement la chambre d’aspiration.Dans les cloques correctement induites, la couche épidermique est complètement séparée de la couche dermique de la peau, laissant une cavité remplie de liquide. Protégez l’ampoule en appliquant un pansement doux sur la zone cutanée environnante et en plaçant un capuchon dur sur l’ampoule, ici à partir d’un tube en plastique de 15 millilitres. Fixez le capuchon à l’aide d’un ruban adhésif non allergène suivi d’un bandage doux et extensible.Demandez au bénévole de garder le pansement protecteur pendant la nuit. Le lendemain, retirez soigneusement le pansement et désinfectez la zone de l’ampoule à l’aide d’un spray. Utilisez une seringue stérile de 2 millilitres avec une aiguille de calibre 23 pour prélever le contenu de l’ampoule.Insérez l’aiguille dans la partie latérale supérieure du toit du blister et aspirez lentement le liquide. Évitez de toucher le plancher de la cavité, mais assurez-vous de récolter tout le liquide car le volume de l’ampoule peut être faible, comme dans cet exemple. L’ampoule affaissée guérira sans laisser de cicatrices.Ajoutez un pansement protecteur sur l’ampoule. Transférez ensuite le liquide de l’ampoule dans un tube stérile. Tournez pendant quatre minutes à 600 G à l’aide d’une centrifugeuse de table.Ensuite, récoltez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de milieu cellulaire. Les cellules fraîches sont maintenant prêtes pour le comptage et l’analyse ultérieure. Les cellules alvéolées d’aspiration peuvent être utilisées pour l’analyse in vitro, comme la cytométrie en flux.Dans cette expérience avec des volontaires vaccinés par le BCG, le rendement cellulaire variait de 15 000 à plus de 200 000 cellules par vésicule. Ici, nous avons isolé des cellules d’une seule ampoule d’aspiration et stimulé les cellules avec une PPD in vitro suivie d’une coloration et d’une cytométrie en flux. À titre de comparaison, nous avons effectué une analyse parallèle sur les PBMC du même volontaire vacciné par le PCG.Dans les panneaux, vous voyez des populations de lymphocytes T CD4 positifs colorés pour la production intercellulaire de TNF-alpha, d’interféron-gamma et d’IL2. Chez ce volontaire, plus de 30 % des lymphocytes T CD4 positifs isolés de la peau étaient spécifiques de l’antigène. Dans les PBMC, cette fraction était inférieure à 1 %De plus, les profils cytokiniques individuels des cellules vésiculeuses étaient représentatifs à la fois des cellules T à mémoire centrale et des cellules T effectrices, illustrant comment cette méthode nous permet d’étudier les réponses de mémoire à longue durée de vie générées in vivo.Ici, la figure A illustre que le liquide obtenu à partir de vésicules d’aspiration peut être analysé pour les cytokines produites in vivo. Dans la figure B, nous avons cultivé des cellules obtenues à partir de vésicules d’aspiration pendant quatre jours en présence de mycobacterium tuberculosis, illustrant comment les cellules vésiculeuses d’aspiration sont capables de produire de l’interféron-gamma et du TNF alpha ex vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire et de récolter des cellules à partir de cloques d’aspiration après un dépôt cutané d’antigène.Dans cette démonstration, nous avons utilisé un antigène particulièrement pertinent dans le domaine de la recherche sur la tuberculose. Mais les principes de base de cette méthodologie peuvent être utiles dans les domaines de l’immunité adaptative ou dans des essais portant sur des agents ciblant les lymphocytes T. N’oubliez pas non plus que l’éthique et la sécurité sont une priorité absolue lorsque vous travaillez avec des bénévoles humains.N’oubliez pas non plus que travailler avec des échantillons humains peut être dangereux et que des précautions de sécurité doivent toujours être suivies en laboratoire.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La caractérisation des épitopes T des agents pathogènes responsables d'infections localisées, comme le papillomavirus humain, représente un défi en raison du nombre limité de lymphocytes T en circulation. Une méthode est décrite, permettant l'isolement et la caractérisation de lymphocytes T rares à partir d'un très faible nombre de cellules.

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Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.

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Cette vidéo présente une technique in vitro pour étudier la formation de synapses immunitaires entre les lymphocytes T humains primaires et les bicouches lipidiques supportées (SLB). Les protéines de surface des lymphocytes T interagissent avec les ligands respectifs immobilisés sur la SLB pour former une synapse immunitaire, suivie du mouvement des granules lytiques vers la synapse, qui est visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence.

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La vidéo présente une méthode immunologique pour surveiller in vivo la production de lymphocytes T cytotoxiques induits par l’adjuvant. Une souris est pré-injectée avec des lymphocytes T CD8+ de donneur génétiquement modifiés et colorés par un colorant prolifératif. L’injection sous-cutanée d’ovalbumine avec des adjuvants génère des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques qui sont identifiés après la récolte par immunomarquage et cytométrie en flux.

Une technique immunologique pour surveiller la génération de lymphocytes T cytotoxiques médiés par adjuvant

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l'utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant&gt; 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

Le but du présent protocole est de permettre à détection d’in vivo antigène-spécifiques, tuant d’une cellule cible dans un modèle murin.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Nous présentons ici le protocole pour la reconstitution par étapes de cellules synthétiques présentatrices d’antigènes à l’aide de bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur utilisation pour interroger la sortie synaptique des cellules T activées.

Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T

L’étude démontre le rôle de la peau dans la modulation des réponses immunitaires chez la souris par l’immunisation épicutanée (EC). L’immunisation par EC avec un antigène protéique peut supprimer les réponses immunitaires en cas d’hypersensibilité de contact ou inverser la suppression induite par la peau lorsqu’elle est associée à des profils moléculaires associés à des agents pathogènes. L’immunisation EC est prometteuse en tant qu’approche efficace et sans aiguille de l’immunothérapie.

Modèle murin d’immunomodulation induite par l’épi-peau

Découvrez la méthode de boursouflure d'aspiration cutanée pour récolter des cellules T spécifiques d'antigène et des cytokines in vivo chez l'humain. Cette technique non invasive permet d'étudier les réponses immunitaires adaptatives et le développement vaccinal.

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

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