Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

L’objectif général de cette vidéo est de démontrer la méthode de rappel cutané des ampoules d’aspiration, qui nous permet de récolter des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et des cytokines représentatives de la réponse immunitaire adaptative in vivo. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les réponses cellulaires et l’immunité adaptative chez l’homme. Le principal avantage de cette technologie est qu’elle nous permet de récolter des lymphocytes T spécifiques de l’antigène directement sur le site de la réaction immunitaire en utilisant une méthode relativement non invasive et sûre.

Le principe de base du rappel cutané est de déposer l’antigène dans la couche dermique de la peau. Chez les individus ayant une mémoire immunologique existante de l’antigène, les lymphocytes T migrent vers le site de réaction et induisent une réponse immunitaire locale où des lymphocytes T spécifiques sont développés clonalement et différenciés in situ. L’induction de vésicules d’aspiration au cours de cette réaction nous permet de récolter ces lymphocytes T spécifiques ainsi que les cytokines produites in vivo.

Dans cette démonstration vidéo, nous utilisons le PPD comme antigène de rappel. La DPP est couramment utilisée pour le diagnostic de l’infection à Mycobacterium tuberculosis. Mais, il induit également des réactions cutanées chez les personnes précédemment vaccinées avec le vaccin BCG, comme vous le verrez dans cette vidéo.

Le matériel pour le test cutané à la tuberculine comprend des tampons d’alcool, une seringue d’un millilitre avec une aiguille courte de calibre 27 à 30 et une solution de PPD approuvée pour l’usage humain. Utilisez une solution de DPP de 20 unités de tuberculine par millilitre. Désinfectez le flacon à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.

Et veuillez noter que la composition peut varier d’un fabricant à l’autre. Localisez ensuite le site d’injection sur la face ventrale de l’avant-bras du volontaire et désinfectez la zone à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool. Utilisez une seringue stérile d’un millilitre avec une aiguille fixe de calibre 29 et de 12 millimètres.

Mélangez doucement et aspirez 0,1 millilitre de la solution PPD. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles visibles. Stressez la peau et pointez l’aiguille à un angle de cinq à quinze degrés avec le biseau vers le haut.

Insérez la pointe de l’aiguille dans la couche dermique de la peau et assurez-vous que la pointe est presque visible à travers l’épiderme. Injectez lentement une solution PPD de 0,1 millilitre. S’il est administré correctement, une papule de six à dix millimètres apparaîtra immédiatement.

La papule disparaît au bout d’une dizaine de minutes. Des dépositions multiples de DPP sont possibles, mais pourraient nécessiter une approbation éthique supplémentaire. Si deux injections sont administrées, visez une séparation maximale tout en restant à une bonne distance de la zone du coude et du poignet.

La réaction cutanée clinique apparaît dans les premières 24 heures et s’accompagne d’une sensation de démangeaison. Mesurez la taille de la réaction cutanée 48 à 72 heures après l’injection. Lors de l’évaluation de la réponse, il est important de mesurer l’induration et non l’érythème.

Palpez le gonflement du chapeau à l’aide de votre doigt. Marquez ensuite les bords de l’induration à l’aide d’un stylo à bille. Enfin, à l’aide d’une règle souple, mesurez le diamètre d’induration et notez les résultats en millimètres.

Après sept jours, il est temps d’induire l’ampoule d’aspiration. Pour l’induction de l’ampoule d’aspiration cutanée, utilisez une pompe à vide avec une chambre d’aspiration attachée. Utilisez un appareil disponible dans le commerce ou personnalisé.

Il est important que la pompe soit réglable dans une plage de moins 20 à moins 40 kilopascals et qu’elle fournisse une pression négative stable et fiable. La partie inférieure de la chambre d’aspiration est constituée d’une plaque avec un petit trou qui est en contact avec la peau. Les plaques peuvent avoir un ou plusieurs trous et différentes tailles peuvent être appliquées afin de s’adapter à la réaction cutanée.

Le haut de la chambre doit permettre une surveillance visuelle de l’ampoule. Avant l’induction, désinfectez la peau et la plaque de la chambre. Assurez-vous que le bras repose confortablement.

Fixez et sécurisez la chambre, ici à l’aide de sangles réglables. Le centre de la réaction cutanée doit être visible à travers le trou de la plaque inférieure. Allumez l’appareil d’aspiration et réglez la pression négative à moins 20 kilopascals.

Après trente minutes, augmentez la pression à moins 25 kilopascal. Après 60 minutes, augmentez encore la pression à moins 30 kilopascals. Et maintenez la pression ici jusqu’à ce qu’une seule ampoule soit complètement formée.

La phase d’induction des ampoules dure normalement environ une à trois heures. La formation réelle de l’ampoule se produisant progressivement au cours des 30 dernières minutes, comme démontré ici à grande vitesse. S’il y a des signes de rupture de l’ampoule ou d’hémorragie, il est conseillé de relâcher lentement la pression et d’arrêter l’induction tôt.

Les cloques peuvent apparaître sous forme de cloques uniques ou multiples. Le processus est souvent associé à une sensation de démangeaison. Une fois que le blister est complètement formé, relâchez la pression et retirez délicatement la chambre d’aspiration.

Dans les cloques correctement induites, la couche épidermique est complètement séparée de la couche dermique de la peau, laissant une cavité remplie de liquide. Protégez l’ampoule en appliquant un pansement doux sur la zone cutanée environnante et en plaçant un capuchon dur sur l’ampoule, ici à partir d’un tube en plastique de 15 millilitres. Fixez le capuchon à l’aide d’un ruban adhésif non allergène suivi d’un bandage doux et extensible.

Demandez au bénévole de garder le pansement protecteur pendant la nuit. Le lendemain, retirez soigneusement le pansement et désinfectez la zone de l’ampoule à l’aide d’un spray. Utilisez une seringue stérile de 2 millilitres avec une aiguille de calibre 23 pour prélever le contenu de l’ampoule.

Insérez l’aiguille dans la partie latérale supérieure du toit du blister et aspirez lentement le liquide. Évitez de toucher le plancher de la cavité, mais assurez-vous de récolter tout le liquide car le volume de l’ampoule peut être faible, comme dans cet exemple. L’ampoule affaissée guérira sans laisser de cicatrices.

Ajoutez un pansement protecteur sur l’ampoule. Transférez ensuite le liquide de l’ampoule dans un tube stérile. Tournez pendant quatre minutes à 600 G à l’aide d’une centrifugeuse de table.

Ensuite, récoltez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de milieu cellulaire. Les cellules fraîches sont maintenant prêtes pour le comptage et l’analyse ultérieure. Les cellules alvéolées d’aspiration peuvent être utilisées pour l’analyse in vitro, comme la cytométrie en flux.

Dans cette expérience avec des volontaires vaccinés par le BCG, le rendement cellulaire variait de 15 000 à plus de 200 000 cellules par vésicule. Ici, nous avons isolé des cellules d’une seule ampoule d’aspiration et stimulé les cellules avec une PPD in vitro suivie d’une coloration et d’une cytométrie en flux. À titre de comparaison, nous avons effectué une analyse parallèle sur les PBMC du même volontaire vacciné par le PCG.

Dans les panneaux, vous voyez des populations de lymphocytes T CD4 positifs colorés pour la production intercellulaire de TNF-alpha, d’interféron-gamma et d’IL2. Chez ce volontaire, plus de 30 % des lymphocytes T CD4 positifs isolés de la peau étaient spécifiques de l’antigène. Dans les PBMC, cette fraction était inférieure à 1 %De plus, les profils cytokiniques individuels des cellules vésiculeuses étaient représentatifs à la fois des cellules T à mémoire centrale et des cellules T effectrices, illustrant comment cette méthode nous permet d’étudier les réponses de mémoire à longue durée de vie générées in vivo.

Ici, la figure A illustre que le liquide obtenu à partir de vésicules d’aspiration peut être analysé pour les cytokines produites in vivo. Dans la figure B, nous avons cultivé des cellules obtenues à partir de vésicules d’aspiration pendant quatre jours en présence de mycobacterium tuberculosis, illustrant comment les cellules vésiculeuses d’aspiration sont capables de produire de l’interféron-gamma et du TNF alpha ex vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire et de récolter des cellules à partir de cloques d’aspiration après un dépôt cutané d’antigène.

Dans cette démonstration, nous avons utilisé un antigène particulièrement pertinent dans le domaine de la recherche sur la tuberculose. Mais les principes de base de cette méthodologie peuvent être utiles dans les domaines de l’immunité adaptative ou dans des essais portant sur des agents ciblant les lymphocytes T. N’oubliez pas non plus que l’éthique et la sécurité sont une priorité absolue lorsque vous travaillez avec des bénévoles humains.

N’oubliez pas non plus que travailler avec des échantillons humains peut être dangereux et que des précautions de sécurité doivent toujours être suivies en laboratoire.