Adéno-associés de livraison induite par le Virus de CRISPR gène cardiaque édition chez la souris

L’objectif global de ce protocole d’édition de gènes cardiaques in vivo est de restaurer l’expression de la dystrophine dans le cœur de souris dystrophiques en utilisant le virus adéno-associé recombinant rh. 74 avec CRISPR SaCas9 et des vecteurs d’ARN guide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dystrophie musculaire, par exemple si l’édition génomique est une stratégie thérapeutique fiable pour traiter la cause profonde de la cardiomyopathie associée à la dystrophie musculaire de Duchenne.

Le principal avantage de ces techniques est que l’expression du gène de la dystrophine corrigé est sous son contrôle régulateur endogène, et cet effet de sauvetage est permanent. L’implication de cette technique s’étend au traitement d’autres maladies génétiques où la correction du gène mutant peut être réalisée par la technologie d’édition de gènes CRISPR Cas9. Cette méthode fournit non seulement un aperçu de la restauration de la dystrophine dans le cœur dystrophique, mais elle peut également être utilisée pour éliminer le gène d’intérêt pour des études génétiques inverses.

La démonstration de la procédure sera assurée par Yandi Gao, un technicien de notre laboratoire. La bonne conception des ARN guides, ou ARNg, est essentielle au succès de ce protocole. Sélectionnez deux ARNg ciblant l’intron 20 et l’intron 23 de la dystrophine pour la protéine neuf associée à CRISPR de Staphylococcus aureus.

La séquence de motifs adjacente au protospacer pour chaque ARNg est soulignée et en italique. Pour recuire les oligonucléotides d’ARNg, mettez en place une réaction contenant 100 micromoles par litre d’oligonucléotides d’ARNg dans 1x tampon de recuit. Utilisez les paramètres PCR suivants : 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, 90 cycles de 95 à 59 degrés Celsius avec une diminution de 0,4 degré Celsius par cycle pendant 20 secondes, 90 cycles de 59 à 32 degrés Celsius avec une diminution de 0,3 degré Celsius par cycle pendant 20 secondes, et 20 cycles de 32 à 26 degrés Celsius avec une diminution de 0,3 degré Celsius par cycle pendant 20 secondes.

Ensuite, préparez-vous à ligaturer les oligonucléotides d’ARNg recuits dans le vecteur CRISP en une seule réaction. Ajoutez ce qui suit dans un tube : un microlitre de 50 nanogrammes par microlitre de vecteur CRISPR, un microlitre d’oligonucléotides recuits, 1,5 microlitre de 10 tampons d’ADN ligase T4, 0,5 microlitre d’ADN ligase T4, un microlitre de Bsal et 10 microlitres d’eau distillée doublement. Exécutez la réaction suivante dans un thermocycleur : cinq cycles de 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et 16 degrés Celsius pendant 10 minutes, 37 degrés Celsius pendant 20 minutes et 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transformez le produit de ligature de 15 microlitres en 30 microlitres de cellules compétentes, et plaquez les cellules sur une plaque de gélose contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, choisissez cinq à 10 colonies dans la plaque de gélose et cultivez-les dans un milieu LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline à 37 degrés Celsius et 250 tr/min pendant trois à quatre heures.

Pour cribler les colonies par PCR, préparez des réactions qui contiennent chacune 10 microlitres de mélange maître PCR, huit microlitres d’eau doublement distillée, un microlitre de culture d’E. coli, un microlitre d’amorce directe U6 et un microlitre d’amorce inverse d’ARNg i20 ou i23. Utilisez les paramètres de cycle PCR suivants :95 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivis de 35 cycles de 95 degrés Celsius pendant 30 secondes, 61 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant 30 secondes. Une fois que les clones positifs ont été identifiés, préparez une culture de cinq millilitres de chaque clone positif en ajoutant quatre millilitres de milieu frais LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline et en cultivant à 37 degrés Celsius et 250 tr/min pendant la nuit.

Le lendemain, purifiez l’ADN plasmidique à l’aide du kit d’extraction de plasmide approprié. Le plasmide est ensuite vérifié par séquençage de Sanger avec l’amorce U6-forward. Pour tester l’efficacité de l’édition génomique des plasmides, cultivez des cellules C2C12 dans du DMEM complétées par 10 % de FBS et 1 % de Pen-Strep jusqu’à ce que les cellules atteignent environ 70 % de confluence.

Électroporez un total de cinq microgrammes de mélange plasmidique SaCas9/ARNg dans un rapport molaire de un à un dans des cellules C2C12 conformément au protocole du fabricant. 48 heures après la transfection, récoltez les cellules C2C12 et extrayez l’ADN génomique comme décrit dans le protocole de texte. Utilisez l’ADN génomique comme matrice pour effectuer une PCR pour le locus de la dystrophine de souris.

Mettez en place des réactions contenant l’amorce directe, l’amorce inverse, le master mix PCR vert, de l’eau distillée deux fois et 100 nanogrammes d’ADN génomique. Utilisez les mêmes conditions de PCR que pour le dépistage des clones positifs. Avant de commencer cette procédure, préparez le virus adéno-associé recombinant, ou rAAV, comme décrit dans le protocole texte.

Administrer des bébés souris mdx du troisième jour avec des particules virales par voie systémique par injection intrapéritonéale. Laissez les souris récupérer et remettez-les dans leurs cages domestiques. À 10 semaines après l’administration du rAAV, prélevez des tissus sur les souris.

Congelez rapidement les tissus pour l’extraction de l’ADN génomique et de l’ARN, et utilisez de l’isopentane refroidi dans de l’azote liquide pour congeler les tissus avec un composé à température de coupe optimale pour la cryosection. Commencer le protocole de coloration par immunofluorescence en fixant les coupes de tissu congelées avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante pendant cinq minutes. Après 15 minutes, lavez les sections de tissu deux fois avec du PBS.

Incuber avec une solution de blocage à température ambiante pendant une heure. Ensuite, incubez avec l’anticorps primaire anti-dystrophine à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les lames avec du PBS, puis incubez avec des anticorps secondaires fluorescents à température ambiante pendant une heure.

Montez les lames à l’aide d’un support de montage avec DAPI et imagez avec un microscope confocal inversé. L’efficacité des ARNg à induire la délétion de la région cible de l’ADN génomique dans les cultures cellulaires a été évaluée par PCR. Un produit PCR d’environ 500 paires de bases indique une délétion réussie de l’ADN génomique cible résultant de l’édition de gènes, tandis que les cellules témoins ne devraient pas produire de bande.

Une fois que l’efficacité des ARNg a été confirmée dans des cultures cellulaires, les ARNg sont emballés dans rAAV. Les particules virales rAAV sont purifiées et la pureté analysée par SDS-PAGE. La présence de seulement trois bandes correspondant aux trois protéines de la capside indique une grande pureté.

Ces images d’immunofluorescence représentatives de coupes cardiaques de souris de type sauvage, mdx et mdx traitées avec l’ARNg AAV SaCas9 montrent systématiquement que l’ARNg AAV SaCas9 restaure l’expression de la dystrophine chez les souris dystrophiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser des modifications de gènes cardiaques in vivo chez des souris postnatales à l’aide de rAAV rh. Administration médiée par 74 de SaCas9 et d’ARNg.