Name: Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Apprenez à caractériser le microbiome racinaire du sol, de la rhizosphère et de l'endosphère racinaire par profilage de la communauté bactérienne 16S. Cette méthode standardisée permet d'étudier les facteurs biotiques et abiotiques.

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Ce travail a été financé par l’USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS est pris en charge par le programme de bourses en recherche universitaire NSF.

1. collecte et séparation des racines endosphère, la rhizosphère et des échantillons de sol
<ol><li>Avant d’entrer dans le champ, l’eau ultrapure (au moins 90 mL d’eau par exemple) autoclave pour stériliser. Préparer, tampon de retrait épiphyte (au moins 25 mL par exemple) en ajoutant 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g K2HPO4et 1 mL de Triton X-100, à 1 L d’eau stérile. Stériliser le tampon à l’aide d’un filtre à vide avec 0.2 µm taille de pores.<ol>
<li>Pour les étapes 1,2 à 1,5, porter des gants propres stérilisés avec de l’éthanol à toutes les fois et remplacer les gants entre chaque échantillon pour prévenir la contamination. Stériliser tous les appareils avec l’éthanol à 70 % et nettoyez tous les équipements entre les échantillons. Avant l’échantillonnage, déterminer la profondeur d’échantillonnage optimal pour votre expérience et être compatible avec toutes les collections de sol et des racines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour collecter des échantillons de sol en vrac, utilisez un collectionneur de noyau de sols stérilisés à l’éthanol pour obtenir du sol qui est exempt des racines des plantes en recueillant un noyau environ 23 à 30 cm de la base de la plante.</li>
	<li>Transférer le sol dans un sac en plastique, homogénéiser le sol en agitant doucement et transférer une partie aliquote de l’échantillon de sol (environ 600 mg) pour remplir un tube de 2 mL. Placer immédiatement le tube 2 mL sur la glace sèche ou flash freeze le tube dans le liquide N2 jusqu’au moment de procéder à l’extraction de l’ADN (étape 2).<ol>
<li>Dans certains environnements, le sol environnant peut contenir des matières végétales. Dans ce cas, utilisez un tamis stérilisée de 2 mm pour séparer les débris végétaux du sol avant de placer dans le sac en plastique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour collecter la racine et la rhizosphère, utilisez une pelle stérilisées en éthanol pour creuser vers le haut de la plante, en prenant soin d’obtenir autant de la racine que possible. Profondeur dépend directement de l’usine. Tandis que les petites plantes comme le blé peuvent être retirés en creusant de plusieurs centimètres, les grandes usines comme le sorgho peuvent exiger 30 cm ou plus. Secouer doucement excessif de sol des racines jusqu'à ce qu’il y a environ 2 mm du sol adhérant à la surface des racines. Remarque : prendre soin lorsque vous travaillez avec des petites plantes, avec des racines fragiles, ou dans les sols secs, haute-argile contenus. Idéalement, il faut seulement une mince couche de sol restant sur les racines après agitation. Si les grands agrégats du sol restent, un maillet en caoutchouc peut être utilisé pour déloger le sol en appuyant doucement sur la base de la tige. Si le montant du sol qui reste après ce processus supérieur ou inférieur à 2 mm, on notera l’épaisseur approximative.</li>
	<li>Pour les grandes usines, utiliser ciseaux stériles et/ou des cisailles pour couper un paragraphe représentatif des racines et placer un minimum de 500 mg de tissus racinaires dans une fiole conique de 50 mL. Pour les plus petites graminées, placer l’ensemble du système racinaire dans le flacon. Ajouter suffisamment épiphyte de tampon d’enlèvement pour couvrir les racines, puis placer immédiatement l’échantillon sur la glace sèche ou flash freeze l’échantillon liquide N2. Remarque : s’assurer pour ne pas trop remplir la fiole conique de 50 mL, car il sera difficile de laver l’étape. Il faut suffisamment d’espace vide, telle que la mémoire tampon épiphyte est capable de s’écouler vers le bas, entourent les racines tout au long de la fiole et couvrez le dessus. Parce que certaines graminées ont plus de biomasse racinaire ne tiendront dans une fiole conique de 50 mL, une sous-section des racines doit être recueillie. Toutefois, il est à noter que couper les racines pourrait conduire à des bactéries endophytes étant emportées dans la fraction de la rhizosphère, donc casser racines doit être minimisée. Si les échantillons ne sont pas traités immédiatement après son retour au laboratoire, ils peuvent être conservés à-80 ° C.</li>
	<li>Pour séparer les racines de la rhizosphère, décongeler l’échantillon de racine sur la glace, puis laisser agir les échantillons de racines à 4 ° C pendant 10 min avec des impulsions de 160 W pour 30 s, séparés par transfert s. 30 les racines dans un frais (4 ° C), nettoyer le tube à 50 mL à l’aide d’une pince stérile. Ne pas jeter le tube original avec tampon et le sol, qui est la fraction de la rhizosphère (Figure 1).</li>
	<li>Centrifuger le tube contenant un tampon et rhizosphère de Flash 10 min à 4 ° C, 4 000 x g. décanter le liquide surnageant, geler le tube contenant la fraction de la rhizosphère en liquide N2et stocker la fraction de la rhizosphère à-80 ° C jusqu’au moment de procéder à l’ADN extraction (étape 2).</li>
	<li>Pour laver les racines, ajoutez environ 20 mL d’eau stérile de frais (4 ° C) pour la fraction de la racine. Lavez la racine en agitant vigoureusement (à la main ou table de mixage, pour 15-30 s) et puis videz l’eau.</li>
	<li>Répétez cette opération au moins deux fois, jusqu'à ce qu’aucune saleté de la surface des racines. Si l’extraction de l’ADN (étape 2) n’est pas effectuée immédiatement, envelopper les racines en feuille d’aluminium stérile, flash geler les racines liquide N2et magasin les échantillons à-80 ° C jusqu'à prêt à procéder à l’extraction d’ADN.</li>
</ol>2. Extraction d’ADN
Remarque : Tout au long des étapes 2 et 3, des gants propres stérilisés avec de l’éthanol doivent être portées en tout temps et tous les travaux doivent être effectués sur une surface stérilisée avec de l’éthanol.
<ol><li>Extraire l’ADN des échantillons de sol et la rhizosphère.<ol>
<li>Utiliser une spatule stérile pour transférer rapidement les 250 mg de sol et la rhizosphère d’étapes 1.3 et 1.7 dans des tubes de collecte sélective fournie dans un kit d’isolation ADN commercial conçu pour l’extraction du sol, puis procéder à l’isolement d’ADN à l’aide du fournisseur de la trousse Protocole.</li>
		<li>Après élution de l’ADN dans le tampon d’élution, fourni par le kit d’isolation de l’ADN, stocker l’ADN à-20 ° C jusqu’au moment de passer à l’étape 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraire l’ADN d’échantillons de la racine.<ol>
<li>Faites refroidir un stérilisé mortier et un pilon à l’aide de liquide N2. Mesurer 600 à 700 mg de tissus racinaires et placez le tissu dans le mortier. Ajouter avec précaution, assez liquide N2 pour couvrir les racines.</li>
		<li>Broyer les racines en petits morceaux. Poursuivre le processus d’ajout de liquide N2 et meulage (au moins deux fois, être cohérent entre les échantillons), jusqu'à ce que les racines sont une poudre fine. Veiller à ce que les tissus racinaires ne pas décongeler pendant cette étape. ATTENTION : Utiliser les équipement de protection individuelle approprié (blouse, lunettes de protection et des gants cryogéniques) quand travailler avec liquide N2. Remarque : Pour une extraction d’ADN de faible qualité, il peut être bénéfique broyer les racines excédentaires en poudre et de stocker la poudre à-80 ° C.</li>
		<li>Rapidement, avant la racine poudre commence à dégeler, utiliser une spatule stérile pour transférer la poudre de racine dans tubes pré-pesés 1,5 mL sur la glace. Noter le poids du tube et de poudre. En règle générale, 300-400 mg de poudre est transférée.</li>
		<li>Utiliser une spatule stérile pour transférer rapidement 150 mg de poudre de la racine vers le tube de prélèvement fourni dans un kit d’isolation ADN commercial conçu pour l’extraction du sol, puis procéder à l’isolement d’ADN utilisant le protocole du fournisseur de la trousse. Remarque : Pour certains échantillons de racines, il peut y avoir une forte concentration de matières organiques restantes dans le granule d’ADN, qui empêche l’amplification de l’ADN pendant l’ACP, en particulier lorsqu’un protocole d’extraction d’ADN différent (p. ex.., extraction de CTAB) est utilisé. Si nécessaire, nettoyer l’ADN en suivant les instructions fournies dans le kit de nettoyage ADN environnemental.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la concentration de tous les échantillons d’ADN à l’aide d’un fluorimètre de benchtop de haute sensibilité.<ol>
<li>Ajoutez 1-20 µL de chaque échantillon d’ADN éluée dans des tubes fournis dans le kit de test de haute sensibilité ADN double brin. Ajouter la solution de travail fluorimètre (colorant : tampon de 1 : 200) jusqu'à 200 µL.</li>
		<li>Préparer deux tubes supplémentaires contenant 10 µL d’ADN standard 1 (0 ng/µL ADN) ou 10 µL de standard 2 (100 ng/µL) et ajouter 190 µL de solution de travail fluorimètre à chaque norme.</li>
		<li>Mesurer la concentration des normes et de chaque échantillon. S’il n’est pas fait automatiquement, calculer la concentration d’ADN de la sortie de l’absorbance par une régression linéaire des deux normes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. présentation et préparation de la bibliothèque de l’Amplicon
<ol><li>Mettre en place des matériaux pour la réaction d’amplification.<ol>
<li>Décongeler les échantillons d’ADN à 4 ° C et les garder sur la glace tout au long de l’étape 3. Randomiser l’ordre des échantillons d’ADN pour minimiser le biais dû à l’emplacement sur la plaque PCR (tableau 2).</li>
		<li>Dans un plat de PCR 96 puits, diluer ADN chaque échantillon dans l’eau moléculaire de qualité à 5 ng/µL dans un volume total de 20 µL. Ajouter 20 µL d’eau moléculaire de qualité sur les puits de quatre coin comme contrôles négatifs pour l’amplification (vides) (tableau 2).</li>
		<li>Organiser les amorces avec code à barres (10 µM) en tubes de bande PCR ou une plaque à 96 puits, tels qu’ils peuvent être ajoutés à l’aide d’une pipette multicanaux (Figure 2).</li>
		<li>Préparer suffisamment mélange maître PCR pour amplifier chaque échantillon d’ADN en triple exemplaire. Préparer 1,5 µL de BSA (20 mg/mL), 37,5 µL de pré-faites 2 x mélange principal (composé de tampon PCR, MgCl2, dNTPs et Taq DNA polymérase), 0,57 µL du chloroplaste PNA (100 µM), 0,57 µL de PNA mitochondriale (100 µM) et 25.86 µL d’eau moléculaire de catégorie.</li>
		<li>Versez le mélange maître dans un stérile 25 mL de réservoir pipette multicanaux et distribuer 66 µL du mélange maître dans chaque cupule d’une nouvelle plaque PCR 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Remarque : Lors du calcul des volumes de réactifs pour master mix, assurez-vous d’inclure également les 4 puits vides par plaque.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 6 µL de 5 ng/µL ADN (à partir de la plaque d’ADN normalisée) sur la plaque de mélange principal. Puis ajoutez à la µL de plat principal 1,5 d’apprêt avant de 10 µM, telle que chaque colonne possède un code-barres différent avant et 1,5 µL de 10 µM inverser apprêt tels que chaque ligne possède un code-barres différent inverse (Figure 2). Remarque : Avant d’ajouter les amorces, les plaques randomisés et les mélange maître pourraient servir pour amplifier les gènes fongiques STI ou ITS2 si différentes amorces ont été ajoutés. Si c’est le cas, une conception similaire d’amorce peut être utilisée.</li>
		<li>Centrifuger la plaque brièvement à 3 000 x g. Utilisez une pipette multi-canaux pour mélanger doucement, puis diviser en trois plaques et 25 µL du mélange réactionnel. Remarque : Bien que trois répétitions ne sont pas strictement nécessaires, il diminue l’incidence de la variabilité technique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplifier l’ADN dans chaque assiette en utilisant un thermocycleur défini aux conditions suivantes : 180 s à 98 ° C, 30 cycles de : 98 ° C pour 45 s (dénaturation), 78 ° C pendant 10 s (PNA recuit), 55 ° C pendant 60 s (apprêt recuit) et 72 ° C pendant 90 s (extension) , puis 600 s à 72 ° C, suivie d’un 4C ° tenir étape. Après l’amplification, centraliser les trois plaques répétées dans une seule plaque 96 puits.</li>
	<li>Quantifier l’ADN à l’aide de réactifs de haute sensibilité fluorimètre dans un lecteur de plaque à 96 puits.<ol>
<li>Ajouter 2 µL de chaque produit PCR d’une microplaque 96 puits, ainsi que 98 µL de solution de travail fluorimètre (colorant : tampon de 1 : 200). Comprend 4 puits en tant que normes : 5 µL d’ADN 1 standard (0 ng/µL ADN), 1 µL de norme 2 (10 ng/µL), 2 µL de norme 2 (20 ng/µL) et 5 µL de 2 standard (50 ng/µL). Ajoutez ensuite la solution de travail fluorimètre pour un volume final de 100 µL. Remarque : Chaque échantillon peut être mesurée au moyen d’un fluorimètre benchtop comme indiqué au point 2.3, si un lecteur n’est pas disponible.</li>
		<li>Calculer la concentration d’ADN de la sortie de l’absorbance par une régression linéaire des quatre normes.</li>
		<li>Pour le code-barres avec succès amplifié produits (ceux qui ont une concentration supérieure à 15 ng/µL), piscine de 100 ng de chaque échantillon dans un tube unique de 1,5 mL (tableau 2).</li>
		<li>Calculer le volume moyen des échantillons ajoutés au pool en utilisant la fonction =AVERAGE() dans un tableur. Ajouter le volume des produits PCR « en blanc » pour les pools d’échantillons. Remarque : Étant donné que les produits PCR « en blanc » ont leurs propres combinaisons de code à barres unique, ils peuvent être séquencés pour vérifier tout contaminant de laboratoire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la concentration du produit mis en commun à l’aide d’un fluorimètre benchtop tel que décrit à l’étape 2.3 et prendre 600 ng d’ADN et diluer dans l’eau moléculaire de qualité pour un volume final de 100 µL dans un tube de 1,5 mL. Stocker le produit restant groupé à-20 ° C.</li>
	<li>Laver l’ADN ng 600 aliquote en suivant le processus de purification PCR établi avec des perles de purification paramagnétique dans un format 96 puits à quelques exceptions près.<ol>
<li>Faire une douce 600 µL aliquote d’éthanol à 70 %. Agiter vigoureusement la bouteille de billes magnétiques pour remettre en suspension les perles qui se déposent au fond.</li>
		<li>Ajouter 1 volume x (100 µL) de solution de perle à l’aliquote de 600 ng d’ADN. Bien mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Placer le tube sur le support magnétique, 2 min (ou jusqu'à ce que la solution est claire) pour séparer les perles de la solution. Alors que le tube est toujours dans le support magnétique, aspirer le surnageant clair soigneusement sans toucher les billes magnétiques et éliminer le surnageant clair. Remarque : À ce stade, les produits amplicon respectent les billes magnétiques. Les perles qui sont perturbée ou perdue pendant aspiration seront traduira par une perte de l’ADN.</li>
		<li>Maintenir le tube dans le support magnétique et ajouter 300 µL d’éthanol à 70 % dans le tube ; Incuber à température ambiante pendant 30 s. aspirer à l’éthanol et le jeter. Répétez ce processus et enlever tout l’éthanol après le deuxième lavage. Enlever le tube du support magnétique et laisser sécher pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter 30 µL d’eau moléculaire de qualité aux talons secs et mélanger en pipettant également 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 2 min. retour du tube sur le support magnétique pendant 1 min pour séparer les billes de solution. Transférer l’éluat dans un nouveau tube. Remarque : Les billes magnétiques n’affectera pas les réactions en aval.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la concentration finale de nettoyé, mis en commun ADN à l’aide d’un fluorimètre benchtop comme indiqué au point 2.3. Diluer une aliquote de 10 nM dans un volume final de 30 µL, ou à la concentration et volume préféré par l’installation de séquençage.</li>
	<li>Utiliser les services d’une installation de séquençage à séquencer l’ADN sur une plate-forme NGS, 2 x 300 séquençage jumelé-fin de bp.</li>
</ol>

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<li>Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+primer+choice+and+short+read+sequences+on+the+outcome+of+16S+rRNA+gene+based+diversity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies.</a> PLoS One. 8 (8), e71360(2013).</li>
<li>Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+nucleic+acid-mediated+PCR+clamping+as+a+useful+supplement+in+the+determination+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity.</a> Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).</li>
<li>Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+DNA+extraction+method%2C+16S+rRNA+targeted+hypervariable+regions%2C+and+sample+origin+on+microbial+diversity+detected+by+454+pyrosequencing+in+marine+chemosynthetic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems.</a> Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).</li>
<li>Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+correlation+of+hypervariable+regions+in+16S+rRNA+genes+in+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis.</a> BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole montre un pipeline établi pour explorer la racine endosphère, la rhizosphère et compositions de communauté microbienne du sol, de l’échantillonnage sur le terrain pour le traitement des échantillons et le séquençage en aval. Experimentation microbiomes associés à racine présente des difficultés particulières, dû en partie aux difficultés inhérentes à l’échantillonnage du sol. Les sols sont très variables en fonction des propriétés physiques et chimiques, et les différentes conditions du sol peuvent être sépa...

Associées aux plantes microbiomes se composent des communautés microbiennes dynamiques et complexes, composées de bactéries, archées, virus, champignons et autres micro-organismes eucaryotes. Outre leur rôle bien étudié en provoquant des maladies des plantes, associées aux plantes microbes peuvent également influencera phytosanitaire en améliorer la tolérance aux stress biotiques et abiotiques, promouvoir la disponibilité des nutriments et l’amélioration de la croissance des plantes par le biais la production des phytohormones. Pour cette raison, un intérêt particulier existe pour caractériser les taxons qui associent à la plante racine endosphères, rhizosphères et le sol environnant. Alors que certains microbes peuvent être cultivés dans un isolement sur milieux généré de laboratoire, beaucoup ne peuvent pas, en partie parce qu’ils peuvent compter sur des relations symbiotiques avec d’autres microbes, poussent très lentement, ou nécessitent des conditions qui ne peuvent pas être répliquées dans un environnement de laboratoire. Parce qu’il contourne la nécessité pour la culture et est relativement peu coûteux et haut-débit, profilage phylogénétique basé sur séquence d’échantillons microbiens environnementaux et liés à l’hôte est devenue une méthode de choix pour doser la communauté microbienne composition.
La sélection des technologies de séquençage approprié fourni par divers prochaine génération séquençage (NGS) plates-formes1 repose sur les besoins des utilisateurs, avec des facteurs importants dont : couverture désirée, longueur de l’amplicon, attendu communautaire diversité, ainsi que le séquençage de taux d’erreur, lire-la longueur et le coût-par-run/megabase. Une autre variable qui doit être examinée dans les expériences de séquençage axée sur l’amplicon est quels gènes seront amplifiés et quelles amorces seront utilisés. Lors de la conception ou choix d’amorces, chercheurs sont souvent contraints d’opérer compromis entre l’universalité de l’amplification et la résolution taxonomique réalisable depuis les amplicons qui en résulte. Pour cette raison, ces types d’études choisi souvent des amorces et des marqueurs qui ciblent sélectivement des sous-ensembles spécifiques du microbiome. Évaluation de la composition des communautés bactériennes est couramment exécutée par séquençage un ou plusieurs des régions hypervariables des bactérienne 16 s rRNA gene2,3. Dans cette étude, les auteurs décrivent un amplicon basé le séquençage protocole développé pour une plate-forme NGS région du gène de l’ARNr 16 s bactérienne, qui permet une amplification large de taxons bactériens tout en offrant une variabilité suffisante pour cibles les 500 bp V3-V4 distinguer les différents taxons. En outre, le présent protocole peut être facilement adapté pour l’utilisation avec d’autres paires d’amorces, telles que celles qui visent le marqueur ITS2 de champignons ou de la sous-unité d’ARNr 18 s des eucaryotes.
Tandis que d’autres approches comme fusil métagénomique, metatranscriptomics et séquençage des unicellulaires, offrent des autres avantages notamment résolu de génomes microbiens et une mesure plus directe de la fonction communautaire, ces techniques sont généralement plus cher et par le calcul intensif que le profilage phylogénétique décrites ici4. En outre, exécutant fusil métagénomique et metatranscriptomics sur des échantillons de racines donne un pourcentage élevé de lectures appartenant au génome de la plante hôte, et des méthodes pour contourner cette limitation sont toujours développés5,6.
Comme avec n’importe quelle plateforme expérimentale, axée sur l’amplicon profilage peut introduire un certain nombre de biais potentiels qui doivent être considérés lors de l’analyse de données et la conception expérimentale. Il s’agit de méthodes de prélèvement d’échantillons ADN extraction, choix des amorces de PCR et comment la préparation de la bibliothèque est effectuée. Différentes méthodes peuvent avoir un impact significativement la quantité de données utilisables générées et peuvent aussi entraver les efforts visant à comparer les résultats entre les études. Par exemple, la méthode d’élimination de bactéries rhizosphère7 et l’utilisation de techniques d’extraction différente ou choix de DNA extraction kits8,9 montrent significativement en aval l’étude d’impact, ce qui conduit à conclusions différentes concernant les microbes sont présents et leur abondance relative. Étant donné que le profilage basé sur amplicon peut être personnalisé, faire des comparaisons entre les études peut être difficile. La terre Microbiome Project a suggéré que les chercheurs qui étudient les systèmes complexes comme le microbiome associées aux plantes bénéficieraient de l’élaboration de protocoles normalisés comme un moyen d’atténuer la variabilité causée par l’application de différentes méthodes entre études10,11. Ici, nous discutons beaucoup des thèmes ci-dessus et approprié de présenter des propositions quant à où les meilleures pratiques.
Le protocole montre le processus de collecte de sol rhizosphère et échantillons de racines de Sorghum bicolor et extraction ADN à l’aide d’un kit isolement d’ADN bien établi11. En outre, notre protocole inclut un flux de travail de séquençage détaillé amplicon, utilisant une plate-forme NGS couramment utilisée, pour déterminer la structure des communautés bactériennes12,13,14. Ce protocole a été validé pour l’usage dans une large gamme de plantes-hôtes dans une récente étude publiée des racines, rhizosphère et associés-les sols de 18 espèces de monocotylédones dont Sorghum bicolor, Zea mays et Triticum aestivum15. Cette méthode a également été validée pour être utilisé avec d’autres gènes marqueurs, comme en témoigne son application réussie à l’étude du gène de marqueur ITS2 fongique dans les études de l’agave microbiome16,17 et fraise microbiome 18.

<table><tbody><tr><td>0,1 à 10/20 et micro ; L pointes de micropipette filtrées</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Peut remplacer par un équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Peut être remplacé par un équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>10 et micro ; L Pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>3122000027</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>10 et micro ; L, 100 et micro ; L, et 1000 &micro ; L micropipettes</td><td>Eppendorf</td><td>3120000909</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>100 et micro ; L Pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>Peut remplacer par un équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>1000 et micro ; L pointes de micropipette filtrées</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Tamis de sol de 2 mm</td><td>Fournisseurs forestiers</td><td>60141009</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>200 et micro ; L pointes de micropipette filtrées</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Réservoirs de 25 mL</td><td>VWR International LLC</td><td>89094-664</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Fioles coniques de 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>peut être remplacée par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Filtres à vide de 500 ml (0,2 & micro ; taille des pores)</td><td>VWR International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques à 96 puits</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Plaques PCR à 96 puits</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP billes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9933872</td><td>Mode d’emploi : https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Boardwalk</td><td>7124</td><td>Peut être remplacée par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Balance analytique avec une résolution de 0,001 g</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Échosoniseur Bioruptor Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) 20 mg/mL</td><td>Centrifugeuse New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5811000908</td><td>Y compris 50 ml et 96 puits Adaptateurs de seau à plaques de 50 ml et 96 puits</td></tr><tr><td>Gants cryogéniques</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z183490</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Kit DNeasy PowerClean (en option)</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>Anciennement MoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil kit</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12888-100</td><td>Précédemment MoBio</td></tr><tr><td>Glace carbonique</td><td>Tout</td> aimant <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Ne pas substituer</td></tr><tr><td>l’éthanol</td><td>VWR International LLC</td><td>89125-188</td><td>Peut remplacer par un équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Sacs de congélation de la taille d’un gallon</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td>Peut être remplacé par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Gemini EM Lecteur de microplaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>EM</td><td>Peut utiliser un autre fluorimètre qui lit les plaques à 96 puits par le haut.</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Blouse de laboratoire</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>Peut être remplacée par un équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Liquide N2</td><td>Tout</td><td>NA</td><td>Peut être remplacé par un équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Liquide N2 dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4150-9000</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Système de purification d’eau ultra-pure Milli-Q</td><td>Millipore Sigma</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité moléculaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4387937</td><td>Peut être remplacée par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Mortiers</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-150</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Gants en nitrile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19167032B</td><td>Peut être remplacé par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td>VWR International LLC</td><td>BWK6212</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Film d’étanchéité de plaque PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bande PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>Pilons</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-166</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Spatules en plastique</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNAs - chloroplaste et mitochondriale</td><td>PNA Bio</td><td>NA</td><td>Assurez-vous de vérifier la séquence bioinformatique</td></tr><tr><td>Lunettes de protection</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z759015</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 3.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Maillet en caoutchouc (en option)</td><td>Ace Hardware</td><td>2258622</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Cisailles ou ciseaux</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Pelle</td><td>Home Depot</td><td>2597400</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Collecteur de carottes de sol (petit diamètre : < 1 pouce)</td> <td>Ben Meadows</td><td>221700</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Flacons pulvérisateurs</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-395278</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Amorces standard dessalées à code-barres (10 & micro ; M) (Tableau 1)</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo avec dessalage standard. L’adaptateur NGS et l’amorce de séquençage (Tableau 1) sont conçus pour être utilisés avec Illumina MiSeq en utilisant la chimie v3.</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E950040015</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Peser les bateaux</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>B6001W</td><td>Peut remplacer par l’équivalent d’autres fournisseurs.</td></tr></tbody></table>

explorant le microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

L’interaction intime entre la plante hôte et les microorganismes associés est cruciale dans la détermination de remise en forme de plante et peut favoriser l’amélioration de la tolérance aux stress abiotiques et aux maladies. Le microbiome usine peut être très complexes et à faible coût, haut débit méthodes telles que l’amplicon basée sur le séquençage du gène de l’ARNr 16 s sont souvent préférées pour caractériser sa composition microbienne et sa diversité. Toutefois, le choix d’une méthodologie appropriée lorsqu’il procède à de telles expériences est essentiel pour réduire les préjugés qui peuvent compliquer l’analyse et des comparaisons entre les études et les échantillons. Ce protocole décrit en détail une méthode normalisée pour la collecte et l’extraction de l’ADN d’échantillons de sol, rhizosphère et racine. En outre, nous mettre en évidence un pipeline bien établi 16 s rRNA amplicon séquençage qui permet l’exploration de la composition des communautés bactériennes dans ces échantillons et peut facilement être adaptées pour d’autres gènes marqueurs. Ce gazoduc a été validé pour une variété d’espèces de plantes, y compris le sorgho, le maïs, blé, fraise et agave et peut aider à surmonter les problèmes associés à la contamination des organelles de la plante.

Exécutant le protocole recommandé devrait se traduire par un ensemble de données indexées lectures jumelé-fin qui peut être assorti à chaque échantillon et assignés à une ou l’autre bactérienne des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) ou une séquence exacte variante (ESV, également dénommé amplicon variante de séquence (ASV) et sub-operational unité taxonomique (sOTU)), selon l’analyse en aval. Afin d’obtenir des données sur les séquences de haute qualité, il faut à chaque étape pour...

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir des données de séquence amplicon du sol, la rhizosphère et racine endosphère microbiomes. Cette information peut être utilisée pour étudier la composition et la diversité des communautés microbiennes associées aux plantes et est adaptée pour l’utilisation avec un large éventail d’espèces végétales.

Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

L’objectif global de cette expérience est de caractériser trois compartiments du microbiome racinaire, le sol, la rhizosphère et l’endosphère racinaire, en utilisant le profilage de la communauté du gène de l’ARN ribosomique 16S. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne, telles que les facteurs biotiques et abiotiques qui sont les principaux moteurs de la structure du microbiome. Le principal avantage de cette technique est qu’elle standardise chaque étape, de la séparation de la racine et de la rhizosphère à l’extraction de l’ADN jusqu’à la préparation d’une banque de séquençage.La démonstration de cette procédure sera faite par Tuesday Simmons, un étudiant diplômé du laboratoire Coleman-Derr. Pour commencer le protocole, prélevez des échantillons de sol en vrac à l’aide d’un collecteur de carottes de sol stérilisé à l’éthanol afin d’obtenir un sol exempt de racines de plantes. Prélevez un noyau à environ 23 à 30 centimètres de la base de la plante.Ensuite, transférez le sol dans un sac en plastique, homogénéisez le sol en secouant doucement le sac, transférez une aliquote de 600 milligrammes de l’échantillon de sol dans un tube de deux mill

exploring-root-microbiome-extracting-bacterial-community-data-from

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.

Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

Excavation des racines des plantes sur le terrain, ainsi que traitement d’échantillons dans la rhizosphère, endosphère et le sol sont décrites en détail, y compris les méthodes d’analyse de données et extraction de l’ADN. Cet article est conçu pour permettre aux autres laboratoires d’utiliser ces techniques pour l’étude du sol, endosphère et rhizosphère microbiomes.

Isolement et analyse des communautés microbiennes dans le sol, rhizosphère et racines dans des expériences de graminée vivace

Visualisation et en mesurant la croissance racinaire in situ sont extrêmement difficile. Nous présentons une méthode de rhizobox personnalisable pour suivre le développement racinaire et prolifération au fil du temps en réponse à l’enrichissement en éléments nutritifs. Cette méthode est utilisée pour analyser les différences génotypiques maïs dans la plasticité de la racine en réponse à une source d’azote organique.

Un protocole de Rhizobox optimisé pour visualiser la croissance racinaire et la réceptivité aux nutriments localisées

Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.

Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

L’analyse du réseau a été appliquée pour évaluer l’association de diverses communautés microbiennes écologiques, telles que le sol, l’eau et la rhizosphère. Présenté ici est un protocole sur la façon d’utiliser l’algorithme WGCNA pour analyser différents réseaux de co-occurrence qui peuvent se produire dans les communautés microbiennes en raison de différents environnements écologiques.

Divergence du microbiote racinaire dans différents habitats sur la base de réseaux de corrélation pondérés

Les microcosmes de compost apportent la diversité microbienne trouvée dans la nature en laboratoire pour faciliter la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans. Voici des protocoles pour la mise en place d’expériences de microcosme, les expériences démontrant la capacité de moduler la diversité microbienne environnementale pour explorer les relations entre la diversité microbienne environnementale et la composition du microbiome intestinal du ver.

Microcosmes de compost en tant qu’environnements naturels diversifiés sur le plan microbien pour la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans

Nous présentons un protocole pour un système expérimental semi-hydroponique à base de verre supportant la croissance d’une variété de plantes phylogénétiquement distinctes avec ou sans microbes. Le système est compatible avec différents milieux de culture et permet un échantillonnage non destructif de l’exsudat racinaire pour une analyse en aval.

Un système de bocal en verre polyvalent pour le profilage de l’exsudat racinaire semi-hydroponique

Ce protocole présente un flux de travail fiable et efficace, de la collecte d’échantillons à l’analyse des données, pour le profilage des microbiomes bactériens endophytes et épiphytes présents dans l’écorce de Populus trichocarpa.

Un flux de travail pour l’évaluation quantitative des microbiomes bactériens endophytes et épiphytes de l’écorce de Populus trichocarpa

Une procédure rapide et standardisée pour établir des communautés de biofilms multi-espèces synergiques à partir de divers sols de la rhizosphère est présentée ici. Il s’agit d’un protocole unique conçu pour sonder et simuler le microbiote complexe du sol de la rhizosphère.

Une approche pour la construction de communautés de biofilms multispécifiques à partir du sol de la rhizosphère

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver un gène d’intérêt impliqué dans la conjugaison plasmidique et analysons ensuite l’impact de son absence à l’aide de tests d’accouplement. La fonction du gène est explorée plus en détail dans une région spécifique de sa séquence à l’aide de délétions ou de mutations ponctuelles.

Conjugatif Mating Assays pour l&#39;analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

Apprenez à caractériser le microbiome racinaire du sol, de la rhizosphère et de l'endosphère racinaire par profilage de la communauté bactérienne 16S. Cette méthode standardisée permet d'étudier les facteurs biotiques et abiotiques.

Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

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