Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

L’objectif global de cette expérience est de caractériser trois compartiments du microbiome racinaire, le sol, la rhizosphère et l’endosphère racinaire, en utilisant le profilage de la communauté du gène de l’ARN ribosomique 16S. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne, telles que les facteurs biotiques et abiotiques qui sont les principaux moteurs de la structure du microbiome. Le principal avantage de cette technique est qu’elle standardise chaque étape, de la séparation de la racine et de la rhizosphère à l’extraction de l’ADN jusqu’à la préparation d’une banque de séquençage.

La démonstration de cette procédure sera faite par Tuesday Simmons, un étudiant diplômé du laboratoire Coleman-Derr. Pour commencer le protocole, prélevez des échantillons de sol en vrac à l’aide d’un collecteur de carottes de sol stérilisé à l’éthanol afin d’obtenir un sol exempt de racines de plantes. Prélevez un noyau à environ 23 à 30 centimètres de la base de la plante.

Ensuite, transférez le sol dans un sac en plastique, homogénéisez le sol en secouant doucement le sac, transférez une aliquote de 600 milligrammes de l’échantillon de sol dans un tube de deux millilitres et placez immédiatement le tube de deux millilitres sur de la glace sèche jusqu’à l’extraction de l’ADN. Pour recueillir la racine et la rhizosphère, utilisez une pelle stérilisée à l’éthanol pour déterrer la plante, en prenant soin d’obtenir le plus de racine possible. Secouez doucement l’excès de terre des racines jusqu’à ce qu’il y ait environ deux millimètres de sol adhérant à la surface des racines.

Pour les grandes plantes, utilisez des ciseaux stériles pour couper une sous-section représentative des racines et placez un minimum de 500 milligrammes de tissu racinaire dans un flacon conique de 50 millilitres. Ajoutez suffisamment de tampon d’élimination des épiphytes pour couvrir les racines, puis placez immédiatement l’échantillon sur de la glace sèche. Pour séparer la rhizosphère des racines, décongelez l’échantillon de racine sur de la glace, puis soniquez les échantillons de racines.

Transférez les racines dans un tube de 50 millilitres réfrigéré et propre à l’aide d’une pince stérile. Ne jetez pas le tube d’origine avec un tampon et de la terre. Celle-ci contient la fraction de la rhizosphère.

Ensuite, centrifugez le tube contenant le tampon et la rhizosphère. Décantez le surnageant et placez la fraction de la rhizosphère dans de la glace sèche. Pour laver les racines, ajoutez environ 20 millilitres d’eau stérile à quatre degrés Celsius à la fraction de racine.

Lavez la racine en secouant vigoureusement pendant 15 à 30 secondes, puis égouttez l’eau. À l’aide d’une spatule stérile, transférez rapidement 250 milligrammes de sol et de rhizosphère dans des tubes de prélèvement séparés fournis dans un kit d’isolement d’ADN commercial pour l’extraction du sol, puis procédez en utilisant le protocole du fournisseur du kit. Après l’élution, stockez l’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à procéder à la préparation de la bibliothèque d’amplicons, puis extrayez l’ADN des échantillons de racines.

Réfrigérez un mortier et un pilon stérilisés avec de l’azote liquide. Mesurez 600 à 700 milligrammes de tissu racinaire et placez le tissu dans le mortier et ajoutez soigneusement suffisamment d’azote liquide pour couvrir les racines. Broyez les racines en petits morceaux.

Continuez le processus d’ajout d’azote liquide et de broyage au moins deux fois, en étant cohérent entre les échantillons, jusqu’à ce que les racines soient une poudre fine. Rapidement, avant que la poudre de racine ne commence à décongeler, utilisez une spatule stérile pour transférer la poudre de racine dans des tubes pré-pesés de 1,5 millilitre sur de la glace. Notez le poids du tube et de la poudre.

À l’aide d’une spatule stérile, transférez rapidement 150 milligrammes de poudre de racine dans le tube de collecte fourni dans le kit d’isolement d’ADN commercial conçu pour l’extraction du sol, puis procédez à l’isolement de l’ADN en utilisant le protocole du fournisseur du kit. Préparez suffisamment de mélange maître PCR pour amplifier chaque échantillon d’ADN en trois exemplaires. Versez le mélange maître dans un réservoir de pipette multicanaux stérile de 25 millilitres et distribuez 66 microlitres de mélange maître dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR à 96 puits.

Ensuite, ajoutez six microlitres de cinq nanogrammes par microlitre d’ADN de la plaque d’ADN normalisée à la plaque de mélange principale. Ensuite, ajoutez à la plaque maîtresse 1,5 microlitres d’amorce avant de 10 micromolaires, de sorte que chaque colonne ait un code-barres avant différent, et 1,5 microlitre d’amorce inverse de 10 micromolaires, de sorte que chaque rangée ait un code-barres inversé différent. Couvrez la plaque d’un film et faites tourner la plaque brièvement à 3 000 RCF.

Utilisez une pipette multicanaux pour mélanger délicatement le contenu, puis divisez-le en trois plaques avec 25 microlitres de mélange réactionnel et recouvrez les plaques d’un film PCR. Amplifiez l’ADN dans chaque plaque à l’aide d’un thermocycleur. Après l’amplification, regroupez les trois plaques répliquées en une seule plaque de 96 puits.

À l’aide d’un tableur informatique, calculez le volume de 100 nanogrammes de chaque échantillon, ainsi que le volume moyen de tous les échantillons. Pour chaque produit PCR à blanc, ajoutez le volume moyen calculé dans un seul tube de 1,5 millilitre. Pour les échantillons amplifiés avec succès, regroupez 100 nanogrammes de chaque échantillon dans le même tube, puis mesurez la concentration du produit mélangé à l’aide d’un fluorimètre de paillasse et éluez 600 nanogrammes d’ADN dans de l’eau de qualité moléculaire jusqu’à un volume final de 100 microlitres dans un tube de 1,5 millilitre.

Conservez le reste du produit à moins 20 degrés Celsius. Avant de purifier l’aliquote d’ADN de 600 nanogrammes, préparez 600 microlitres d’éthanol frais à 70 %. Suivez le processus de purification PCR établi à l’aide de billes paramagnétiques.

Secouez le tube de billes magnétiques pour remettre en suspension les billes qui se déposent au fond. Ajouter 1x volume, 100 microlitres, de solution de billes à l’aliquote de 600 nanogrammes d’ADN. Mélangez soigneusement la solution et les billes en pipetant 10 fois.

Après un mélange minutieux, incubez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante. Placez le tube sur le support magnétique pendant deux minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire pour séparer les billes de la solution. Gardez le tube dans le support, aspirez soigneusement le surnageant transparent sans toucher les billes magnétiques et jetez-le.

Laissez le tube dans le support, ajoutez 300 microlitres d’éthanol à 70 % dans le tube et incubez les billes à température ambiante pendant 30 secondes. Aspirez l’éthanol et jetez-le. Répétez ce processus et retirez tout l’éthanol après le deuxième lavage.

Retirez le tube du support magnétique et faites sécher le contenu à l’air libre pendant cinq minutes. Ajoutez 30 microlitres d’eau de qualité moléculaire aux billes séchées et mélangez en pipetant 10 fois. Incuber à température ambiante pendant deux minutes.

Remettez le tube sur le support magnétique pendant une minute pour séparer les billes de la solution. Transférez l’éluat dans un nouveau tube. Mesurez la concentration finale de l’ADN nettoyé et regroupé à l’aide d’un fluorimètre de paillasse.

Diluer une aliquote à 10 nanomolaires dans un volume final de 30 microlitres ou à la concentration et au volume souhaités par l’installation de séquençage. Suite à l’étape d’amplification, un séquençage a été effectué pour déterminer la composition de la communauté bactérienne de chaque échantillon. L’alignement de la séquence PNA sur chaque chloroplaste et gène de l’ARN ribosomique mitochondrial 16S pour la plante hôte étudiée ne devrait pas révéler de mésappariements.

Une seule discordance avec la séquence PNA de 13 paires de bases peut réduire considérablement l’efficacité, comme dans le cas de la séquence PNA du chloroplaste fournie et du gène de l’ARN ribosomique du chloroplaste 16S de Lactuca sativa, ou laitue. Étant donné qu’une quantité égale d’ADN amplifié a été regroupée par échantillon, un nombre pair de lectures, qui correspondent à des taxons bactériens, a été obtenu par échantillon après séquençage, triées en fonction de leur indice de code-barres. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée pour huit plantes en environ huit heures.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’être cohérent entre les expériences. De petits détails tels que des changements dans la méthode d’extraction de l’ADN et le master mix PCR peuvent introduire un biais. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la métatranscriptomique peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que quels microbes sont actifs et quels gènes expriment-ils ?

N’oubliez pas que travailler avec de l’azote liquide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.