Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sensorielle, telles que la nociception périphérique. Le principal avantage de cette technique est que l’étude du mécanisme cellulaire des neurones sensoriels avec le modèle qui simule le plus à l’état physiologique. Recueillir les ganglions de racines dorsales lombaires dans le tronc d’un rat de deux à trois semaines.

Commencez par faire deux coupures le long des côtés de la colonne vertébrale et une coupe latérale pour marquer l’étendue rostrale de la colonne lombaire. Ensuite, utilisez des forceps de coupe osseuse pour enlever les muscles dorsal de la colonne vertébrale. Ensuite, retirez la partie dorsale des vertèbres et exposez la moelle épinière.

Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection et des forceps pour enlever la moelle épinière. Identifiez le DRG lombaire en comptant les vertèbres de la dernière côte. Ce diagramme montre les positions des vertèbres.

Utilisez des micro ciseaux pour recueillir les 12 DRG lombaires bilatéraux de L1 à L6. Enlevez toutes les fibres neuronales attachées pour améliorer la pureté de la culture. Transférer chaque DRG lombaire dans un plat de culture de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu sans sérum glacé. Transférer le plat de 35 millimètres contenant du DRG dans une hotte laminaire et laver le DRG avec un milieu sans sérum trois fois par pipette.

Utilisez des pinces stériles pour déplacer les DRGs vers un nouveau plat de culture de 35 millimètres contenant deux millilitres de collagène stérile de type 1A. Placez le tissu dans la solution de collagène dans l’incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour commencer la dissociation des cellules. Après l’incubation, retirez la solution de collagène et lavez le DRG trois fois en deux millilitres de la solution de sel équilibrée de Hank.

Ensuite, ajouter deux millilitres de trypsine préchaurée 0,05% EDTA au plat, et digérer le DRG dans l’incubateur pendant 30 minutes comme avant. Après la digestion, utilisez une pipette en verre pour transférer les deux millilitres de solution contenant du DRG à un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Le DRG pourrait s’en tenir à la pipette en verre de sorte que cette étape doit être effectuée avec soin.

La perte réelle peut être évitée en gardant la solution contenant du DRG dans l’extrémité effilée de la pipette en verre, et en transférant la solution dans le tube de centrifugeuse lentement mais sans pause. Ensuite, centrifuger la solution à 290 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugage, retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de milieu sans sérum pour résuspendre le DRG.

Répétez le lavage deux fois, à l’aide de deux millilitres de milieu de culture préchauré pour résuspendre le tissu après la centrifugation finale. Utilisez la pipette polie stérile à flamme précédemment préparée pour triturer manuellement le DRG environ 60 fois. Ensuite, retirez une plaque de puits recouverte de poly-L-lysine contenant un millilitre de milieu de culture par puits de l’incubateur de CO2.

Aspirer le milieu de culture incubé du plat. Ensemencer les cellules DRG d’un rat dans quatre des puits. Ça donne une densité d’ensemencement d’environ 500 000 cellules par puits.

Le lendemain, remplacez le milieu de culture par un milieu complété par 10 micromolaires AraC et 100 nanogrammes par millilitre de NGF. Le troisième jour après le placage cellulaire, changer le milieu à 0,5 millilitres de milieu sans sérum préchauré, et incuber pendant une heure. Pendant l’incubation, ajouter 50 millimolaires d’ARN dans un microlitre d’eau sans RNase à 12,5 microlitres de milieu sans sérum par transfection.

Puis pipette 2,5 microlitres de réaccélération transfection en 10 microlitres de milieu sans sérum pour chaque transfection. Mélanger les deux solutions par pipette et incuber cette solution de transfection mixte pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, ajouter la solution de transfection dans les puits de la plaque de puits contenant 24 DRG et mélanger en secouant doucement.

Après une incubation de six heures, ajouter 0,5 millilitres de milieu de culture avec 20% de FBS, 10 micromolaires AraC, et 100 nanogrammes par millilitre de NGF dans chaque puits de cellules. Enfin, incubez le DRG dans un incubateur de CO2 de 37 degrés Celsius pendant encore 66 heures. Le sixième jour après placage, et 72 heures après la transfection de siRNA, changez le milieu de culture à 200 microlitres du milieu sérique-libre.

Après une incubation de 30 minutes, ajouter un microlitre du produit chimique de stimulation et mélanger délicatement par pipetting. L’agoniste NPFFR2, le dNPA et le véhicule correspondant sont utilisés ici. Après l’incubation pendant la période requise, recueillir le milieu de culture du plat de culture, et centrifugeuse à 5000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les impuretés suspendues.

Recueillir le supernatant de la centrifugation et diluer avec de la solution saline tamponnée de phosphate au besoin. Analysez les niveaux de neurotransmetteurs avec des kits d’immunoassay enzymatiques disponibles dans le commerce. Le premier jour, le corps cellulaire d’un seul neurone indiqué par la flèche était fixé au fond d’un plat.

Une cellule gliale indiquée par une pointe de flèche est également présente. Les cellules gliales ont dupliqué et étendu les processus pour entourer le corps cellulaire du neurone sensoriel le deuxième jour, un processus qui était encore plus important le troisième jour. Dans une autre culture, la protéine CGRP a été tachée pour révéler la forme des neurones.

La coloration protéique CGRP apparaît dans le cytoplasme et les axones des neurones sensoriels. Les morphologies nucléaires des neurones et des cellules gliales sont distinctes lorsqu’elles sont tachées de DAPI. Les neurones ont un noyau plus grand et plus arrondi que les cellules gliales.

En comparaison, les noyaux de glial sont de forme plus ovale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer et de culture le ganglion de racines dorsales, et l’utiliser comme un outil pour étudier les fonctions physiologiques sous-jacentes.

N’oubliez pas que travailler avec les cellules primaires peut être beaucoup plus difficile que de travailler avec des lignées cellulaires régulières, et être doux est toujours la meilleure façon d’effectuer ces procédures.