Name: Mince Film silicium composites élastomères pour les Applications de la peau et de Culture cellulaire : fabrication et caractérisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Apprenez à fabriquer des films minces composites en PDMS pour la culture cellulaire et les adhésifs cutanés. Cette méthode simple permet une production à grande échelle avec une précision élevée pour les applications biomédicales.

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Martin Danner est reconnu pour son aide dans la préparation des échantillons et la mise en place des procédures de culture cellulaire. Les auteurs tiennent à remercier Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hambourg, Allemagne), en particulier Robert Radsziwill pour un soutien continu et des discussions. La recherche ayant abouti à ces résultats a été financé par le Conseil européen de la recherche au titre septième Programme-cadre (FP/2007-2013) Convention de subvention ERC n. de l’Union européenne 340929.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La conception de structures composites permet l’ajustement simple des propriétés des matériaux, tels que le module de Young ou l’épaisseur des échantillons. Le module de Young du PDMS est effectivement modifiable dans un large éventail en modifiant le rapport de mélange entre les deux composantes ou fabrication de mélanges en utilisant un autre silicone élastomère30,31. Les méthodes décrites ne sont pas limités à de la PDMS utilisé dans l’enquête en cours, mais surtout la performance adhésive dépend fortement du type spécifique utilisé. Une étape cruciale dans le présent protocole est le procédé de fabrication des films composites (Figure 1). Il a été démontré que l’épaisseur des films affecte sensiblement le comportement de l’adhérence des films sur différents substrats, y compris la peau (Figure 5 et Figure 6). Outre l’épaisseur du film, temps et température pendant le processus de durcissement affecte les propriétés matérielles32. Paramètres que l’épaisseur des couches polymères doivent être adaptées et vérifié avec soin.
Analyse des propriétés adhésives des films minces a été réalisée avec les mesures d’adhérence de force normale à l’aide de deux substrats de verre avec une rugosité différente jusqu'à Ra = 0,338 µm (Figure 3). En général, rugosité effets sensiblement l’adhérence des surfaces, en particulier des matériaux élastiques33,,34. La rugosité du verre peut être facilement modifiée par ponçage au papier de verre de tailles différentes aspérités, ce qui permet la fabrication de substrats présentant plus de valeurs de rugosité21. En outre, les autres matériaux, par exemple la résine époxyde utilisable pour la production de substrats15,35. Cela pourrait être une stratégie importante modification du protocole présenté. Par exemple, si les substrats présentant différentes énergies libres de surface sont nécessaires ou spécifiques topographies sont nécessaires. Ici, l’arrachement stress et travail de séparation des films minces fabriqués de PDMS et SSA ont été analysés avec une configuration sur mesure (dispositif de mesure adhérence macroscopique (MAD, Figure 4)). 36 l’alignement optique du substrat et avec pénétrateur est une étape essentielle pour l’analyse des résultats de la mesure. Par conséquent, réglage de l’angle d’inclinaison doit être effectuée avec le goniomètre, aussi précis que possible. C’est possible avec une précision suffisante en mettant manuellement le substrat en contact avec la surface du film jusqu'à l’obtention d’un contact horizontal.
Dans le protocole actuel, le temps d’attente était maintenu constant à une seconde (Figure 5 et Figure 7). Spécialement pour l’enquête sur la performance adhésive d’un film élastique à une surface de substrat rugueux, une prorogation du délai attente fournit des informations supplémentaires. Par exemple, une augmentation de contrainte de traction avec le temps d’attente a été rapporté8. Outre les mesures effectuées dans le protocole actuel, d’autres méthodes, par exemple essais de pelage pourraient exécuter, permettant une enquête plus approfondie d’adhérence performance37.
Les propriétés adhésives des films composites présentant le film différente épaisseurs de la colle de peau molle ont été déterminées (Figure 7). Nos résultats concordent avec les données publiées, montrant qu’une baisse de film épaisseur conduisent à une augmentation de la contrainte de traction comme le confinement, c.-à-d., le rapport entre l’épaisseur de film et le diamètre du substrat, augmentations38,39 . Basé sur ces résultats et les données représentées dans la Figure 7, nous concluons que les films composites avec une épaisseur totale d’environ 100 µm (l’épaisseur de la couche de SSA env. 60 µm, appliqué à un film PDMS avec une épaisseur d’environ 40 µm) pièce adhérence favorable p ropriétés sur des surfaces rugueuses.
Ensuite, les expériences liées à la caractérisation biologique ont été réalisées sur des films composites immaculées et plasma traité films composites (Figure 8). Traitement plasma des élastomères de silicone est une technique souvent appliquée, polyvalente pour augmenter les propriétés hydrophiles des surfaces et la promotion d’attachement cellulaire et cellulaires diffusion40,41. Silicones sont bien connus pour leur faible toxicité et biostabilité haute mais peuvent contenir des monomères résiduels ou catalyseurs susceptibles d’influencer les processus physiologiques, conduisant aussi à la cytotoxicité42,43. Dans les expériences, nous avons observé moins de cytotoxicité de 5 % à l’aide de libération de LDH comme un indicateur et un test d’exclusion bleu Trypan. Dans le protocole présenté, l’ensemble de la population cellulaire, y compris les agrégats cellulaires individuelles forme que la surface a été analysée pour l’analyse de prolifération (Figure 9 b). Une modification du protocole pourrait produire des résultats plus différenciées. Pour chaque échantillon, le surnageant contenant des agrégats cellulaires individuelles pourrait être transféré dans un tube à essais distincts et pas combiné avec les cellules enzymatiquement retirés de la surface du polymère. Cela permet l’évaluation exacte des cellules attachées à la surface et finit par révéler une détermination plus détaillée de l’influence des polymères sur le processus d’adhésion cellulaire. Outre les méthodes immunocytochimiques présentées ici, cellules pourraient être récoltées pour enquête avec des méthodes d’immunoblot, ce qui permet une évaluation quantitative détaillée d’expression de la protéine.
En résumé, nous avons établi des conditions de fabrication pour la production de composites élastomères minces pour des applications dans la recherche de culture cellulaire avancé. En outre, ces films minces possèdent haute capacité d’adaptation à la peau de rugosité, permettant la conception sophistiquée de colles de peau.

Dans le présent protocole, sont présentées des méthodes détaillées pour la fabrication de films minces d’élastomère. La technique de lame docteur largement disponibles a été utilisée pour la production de films minces de composites. La technique de fabrication a été réalisée sur des feuilles de polyethylenterephtalate (PET), permettant la production subséquente de ces films à grande échelle. L’accent du présent protocole est l’évaluation de la reproductibilité, précise de fabrication des différentes couches des films composites et détermination des propriétés biologiques et adhérence du patch composite finale. Le poly-(dimethylsiloxane) d’élastomère de silicone (PDMS) est largement utilisé dans la technologie biomédicale, y compris la production de colles de peau, microfluidique applications et recherches complémentaires champs1,2,3 ,4. Récemment, une autre sous-classe de PDMS, dite douce peau adhésifs (SSAs) ont été introduites, notamment pour la peau douce de liaison et de collage.
Silicone SSAs sont des élastomères de vinyle fonctionnalisé, différant de polymères analogues par l’absence de renforcement silice5. Semblables aux autres PDMS, SSA d’Young peut être adaptée dans une large gamme par modulation réticulant concentration ou polymérisation temps6,7,8. Ce changement de module de Young des élastomères de silicone affecte les propriétés adhésives du matériel considérablement et a également des conséquences profondes sur les cellules procaryotes et eucaryotes cultivés sur la surface9,10 , 11. au niveau biologique cellulaire, il a été démontré, que les cellules eucaryotes répondent au niveau de la transduction de signal à une modulation de l’élasticité de la matrice ou l’épaisseur de la surface9,10,12 ,13,14. Donc, il existe un large intérêt pour applications de culture de cellules de polymères ayant des propriétés mécaniques accordables. Ce qui est important, l’intrinsèquement faible énergie de surface des élastomères à base de silicone ne fournit pas des conditions optimales pour la culture cellulaire des cellules eucaryotes. Traitement au plasma oxygène est une technique largement utilisée pour augmenter le PDMS faible énergie de surface temporairement, conduisant à une amélioration de sa force de traction, a diminué l’adsorption de molécules, alors qu’en parallèle favorisant l’attachement, épandage en surface et prolifération de cellules eucaryotes15,16,17,18.
Outre les propriétés des matériaux, la topographie de surface affecte de manière significative adhésion cellulaire et l’interaction adhésive entre deux matériaux19,20,21,22. Rugosité de surface a plusieurs effets sur la formation de contact entre deux surfaces : réduction de la surface de contact, haute stocké énergie élastique entourant les aspérités ainsi que de l’influence sur la propagation de la fissure peut modifier la force d’adhérence23, 24. Adhérence de films autocollants à la peau humaine est un nouveau domaine d’application, p. ex., pansements, fixation des électrodes ECG ou autres appareils électroniques portables25,26,27, 28. Pour mesurer le rendement adhésif autocollants en ce qui concerne la topographie de la surface, des substrats de verre avec des degrés de rugosité permet l’adhérence normale mesures8,21. Ici, les deux substrats de verre ont été choisis pour étudier les propriétés adhésives des films polymères. Tout d’abord, composites films avec une couche de support du PDMS dans un rapport de 10 contre 1 poids pièces couvertes par PDMS avec rapport de mélange différente ont été caractérisés. Dans un second temps une couche adhésive de la SSA a été réalisée avec des quantités de poids égal des deux composants avec différentes épaisseurs de film sur un support film PDMS.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol, 97 %</td><td>Stockmeier Chemie</td><td>1000452610000</td><td>Isopropanol</td></tr><tr><td>Abrasif diamnod tampon à main</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>Grit : 220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Capricorn Scientific</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>Albumine Fraktion V</td><td>Roth</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A12379</td><td>highly toxique</td></tr><tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>milieu de montage soluble dans l’eau</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE Essai d’intégrité membranaire homogène</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans Ca2+, Mg2+</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal or</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Goniomètre OCA35</td><td>Dataphysics</td><td></td><td>pour la détermination de l’angle de contact statique avec l’eau</td></tr><tr><td>Colorant Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155-100MG</td><td>bisBenzimide H 33342 trichlorhydrate, hautement toxique</td></tr><tr><td>Microscope Axiovert 25</td> Microscope <td>Zeiss</td> utilisé pour la documentation de <td></td><td>la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Microscope Eclipse LV100ND</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope utilisé pour la détermination de l’épaisseur d’un film</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, solution aqueuse 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>RT 15710</td><td>solution de pénicilline et de streptomycine de qualité microscopie</td></tr> électronique <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage Phenom XL (MEB)</td><td>Phenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-(alcool vinylique) 4-88, MW 31000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>Poly-diméthylsiloxanes, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 milieu basal</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>adhésif à peau douce (SSA)</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 Adhésif à peau douce (SSA)</td></tr><tr><td>mélangeur rapide DAC 600.2 VAC-P</td><td>Hauschild</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stylus profilomter</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modèle : SURFCOM 1500SD3</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 pro</td><td>Tecan</td><td></td><td>lecteur de plaques de fluorescence</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>hautement toxique</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA solution</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>0,05 % Trypsine, 0,02 % EDTA dans PBS</td></tr><tr><td>Colle UV</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>viscosité moyenne</td></tr></tbody></table>

mince film silicium composites élastomères pour les applications de la peau et de culture cellulaire : fabrication et caractérisation

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Dans ce protocole, nous présentons des méthodes pour fabriquer des films composites élastomère mince pour des applications de culture cellulaire avancé et pour le développement des adhésifs de la peau. Deux-(dimethyl siloxanes) différentes poly (PDMS et colle de peau douce (SSA)), ont été utilisés pour enquête approfondie des effets biologiques et les caractéristiques de l’adhésifs. Les films composites se composent d’une couche souple et un revêtement adhésif haut de la page. Les deux couches ont été fabriqués par la technique d’application lame docteur. Dans la présente enquête, on a étudié le comportement adhésif des films composites comme une fonction de l’épaisseur de la couche ou une variation de la module d’Young de la couche supérieure. Le module de Young de PDMS a été modifié en faisant varier la base au rapport de mélange de reticulation. En outre, l’épaisseur des films de la SSA a été varié d’environ 16 µm à environ 320 µm. Scanning electron microscope et microscopie optique ont été utilisés pour des mesures d’épaisseur. Les propriétés adhésives des films élastomère dépendent fortement de l’épaisseur du film, le module de Young des polymères et des caractéristiques de surface. Par conséquent, on a étudié adhérence normale de ces films sur des substrats de verre présentant des surfaces lisses et rugueuses. > Pull-off stress et travail de séparation sont dépendants sur le rapport de mélange d’élastomères de silicone.
En outre, l’épaisseur de la colle de peau douce placée au dessus d’une couche de soutien favorable a été modifiée afin de produire des correctifs pour les applications de la peau. La cytotoxicité, la prolifération et adhésion cellulaire des fibroblastes murins L929 sur films PDMS (mélange ratio 10:1) et SSA (mélange ratio 50/50) ont été menées. Nous ont montré ici, pour la première fois, la comparaison côte à côte des couches minces composites fabriqué de deux polymères et présenter l’étude de leurs propriétés biologiques - et adhésif.

Un protocole pour le procédé de fabrication de structures composites polymères minces possédant soit Young différent modules ou épaisseurs est présenté. Films sont produits, études sur la culture cellulaire avancé ou comme adhésifs de la peau.

Mince Film silicium composites élastomères pour les Applications de la peau et de Culture cellulaire : fabrication et caractérisation

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer et de caractériser des structures composites à couche mince polymère pour des études de culture cellulaire avancées ou comme adhésifs cutanés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les composites élastomères peuvent être utilisés pour obtenir une action d’adhérence optimale, même sur des surfaces irrégulières. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’elles sont simples et universellement applicables.Cela permet une fabrication à grande échelle avec une très grande précision. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car les mesures d’adhérence nécessitent une formation et une pratique intensives pour atteindre la précision nécessaire. Angela Rutz, une technicienne de notre laboratoire, fera la démonstration des procédures de culture cellulaire et de l’application du plasma.Pour préparer le PDMS, mélangez et dégazez 1,1 gramme du mélange de prépolymère dans un mélangeur rapide à 2350 tr/min sous vide pendant trois minutes. Pour préparer la couche de support PDMS, utilisez une machine d’application de racle à commande automatique. Placez la racle sur un morceau de feuille PET nettoyé à 100 % isopropanol et utilisez les vis de micropositionnement pour ajuster l’épaisseur de la couche de support.Chargez le PDMS dans une seringue à usage unique de 10 millilitres. Remplissez le réservoir de la racle avec le polymère et démarrez le mouvement de la lame à une vitesse d’environ 2 millimètres par seconde. Lorsque le morceau de film PET a été enduit, transférez-le dans un four à 95 degrés Celsius pendant une heure.Pour préparer la couche supérieure du film composite, utilisez une lame pour retirer les fines bandes des côtés longs de la couche de support. Pour permettre à la racle d’être glissée sur la feuille PET, appliquez la deuxième couche de PDMS comme décrit précédemment. Ensuite, placez le papier d’aluminium dans le four.Pour préparer les échantillons aux mesures d’adhérence, utilisez une lame de rasoir pour couper les films sur la feuille PET en morceaux de quatre centimètres carrés et utilisez de la colle UV pour fixer les morceaux sur une lame de verre. Illuminez les pièces avec une lumière UV pendant trois minutes et montez le premier échantillon polymère sur le porte-échantillon. Utilisez le goniomètre pour ajuster l’angle d’inclinaison, jusqu’à ce que le substrat soit en contact avec le film polymère à un alignement complètement parallèle des deux surfaces, comme le visualisent les images de la caméra.L’alignement optique du substrat sur l’échantillon est très critique pour l’interprétation des résultats de mesure. Par conséquent, le réglage de l’angle d’inclinaison doit être effectué aussi précisément que possible à l’aide de l’inclinomètre. Déplacez le substrat aligné sur la surface du film polymère jusqu’à ce qu’une contrainte de précharge de plus ou moins cinq kilopascals soit atteinte, puis démarrez le progiciel programmé personnalisé écrit dans LabView.Ensuite, réglez les paramètres de mesure requis pour mesurer les propriétés d’adhérence de trois échantillons fabriqués indépendants à six endroits différents sur chaque surface de film. Pour préparer les films pour la microscopie optique, utilisez une lame de rasoir pour couper l’échantillon polymère en morceaux de 0,25 centimètre carré et fixez les morceaux au bord d’une lame de verre. Ensuite, placez la lame dans l’orientation verticale sous un microscope droit et mesurez l’épaisseur de la section transversale du film.Pour préparer une expérience de culture cellulaire, utilisez d’abord un scalpel pour couper des morceaux d’environ cinq millimètres sur cinq de la couche de support en PET, et utilisez une pince à épiler pour transférer les morceaux sur des lamelles de verre individuelles de 12 millimètres. Transférez les lamelles à l’intérieur de la chambre de réaction d’un appareil à plasma et fermez le couvercle de l’appareil. Évacuez la chambre jusqu’à ce qu’une pression de 1,6 fois 10 à moins le millibar soit atteinte, et traitez les films avec du plasma pendant trois minutes.Ensuite, ventilez la chambre de réaction et transférez les échantillons dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Ensuite, lavez une culture cellulaire L929 confluente de 70 à 80 % avec du DPBS sans calcium ni magnésium pendant 30 secondes dans une armoire à flux laminaire. Suivi d’une incubation de cinq minutes avec deux millilitres d’une solution protéolytique et collagénolytique appropriée à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.Lorsque les cellules se sont détachées, ajoutez huit millilitres de milieu supplémenté en sérum et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, après avoir compté, ensemencez 60 000 cellules par millilitre de milieu par puits de la plaque à 24 puits contenant les échantillons polymères, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours avant la capture et la fixation de l’image à contraste de phase. En fonction de l’épaisseur du film supérieur, une diminution de la contrainte d’arrachement est observée avec une épaisseur de film croissante, quelle que soit la texture de la surface du support.Le travail de séparation, cependant, est généralement légèrement inférieur pour les surfaces de substrat rugueuses par rapport aux surfaces lisses. Lorsque le mécanisme de détachement est enregistré, une faible cavitation est observée sur les films les plus minces, tandis que l’apparition de fissures en forme de doigts est observable sur les films plus épais. Des expériences de culture cellulaire révèlent que les cellules ensemencées sur des polymères vierges présentent une mauvaise fixation et un mauvais comportement de propagation cellulaire, tandis que la monocouche confluente est observée pour les cellules cultivées sur des surfaces traitées au plasma.En général, les niveaux de lactate déshydrogiase sont comparables pour les cellules cultivées sur les deux matériaux polymères, avec une cytotoxicité inférieure à 5 %. Une fois maîtrisée, la production des composites de film polymère peut être réalisée en trois heures environ. Bien qu’une analyse ultérieure avec un test d’adhérence normal nécessite une formation, il s’agit d’un outil très puissant pour étudier les propriétés adhésives des films.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de films composites polymères minces et de leur analyse à l’aide de tests d’adhérence spécifiques et d’outils de biologie cellulaire. N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques et des matériaux biologiques peut être extrêmement dangereux. Par conséquent, prenez les précautions appropriées, telles que suivre les procédures de sécurité obligatoires, porter un équipement de protection individuelle et manipuler ces matériaux dans une enceinte de sécurité.

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Mince Film silicium composites élastomères pour les Applications de la peau et de Culture cellulaire : fabrication et caractérisation

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