Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

L’objectif global de cette procédure de microdissection laser est de développer une méthode robuste et reproductible pour l’isolement d’un réseau trabéculaire hautement enrichi à partir d’yeux de souris à l’aide de la microscopie à capture laser pour l’isolement ultérieur de l’ARN et l’analyse de l’expression en aval. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie, telles que quels sont les gènes importants et les voies de signalisation qui, lorsqu’ils sont mal régulés, peuvent conduire à des maladies oculaires. Le principal avantage de cette technique est que l’ARN de haute qualité provenant du réseau trabéculaire des yeux de souris peut être isolé de manière reproductible pour l’analyse de l’expression génique.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la microdissection au laser est une technique puissante qui implique diverses étapes de dépannage tout au long du protocole. Commencez cette procédure par un prélèvement optimal de tissus pour la microdissection au laser, comme décrit dans le protocole textuel. Vaporisez la solution de décontamination RNase sur la brosse, la pince, les bocaux d’accouplement et le mandrin de montage.

Après avoir soigneusement essuyé, rincez l’appareil à l’eau sans nucléase et séchez-le. Essuyez le cryostat avec de l’éthanol à 100 % pour éviter la contamination croisée. Pressez une petite quantité d’O.C.T. sur le mandrin de montage, puis retirez le bloc de tissu du moule et placez soigneusement le bloc sur le mandrin de montage.

Une fois que le bloc de tissu sur le mandrin de montage est solidement congelé, insérez-le dans le porte-échantillon du cryostat. Ensuite, ajustez le cryostat pour couper des sections de huit microns et coupez soigneusement à travers le bloc O.C.T. pour atteindre l’échantillon de tissu. Une fois le tissu observé, arrêtez la section.

Coupez les blocs gelés de tous les côtés à l’aide d’une lame de rasoir propre et laissez trois à quatre millimètres d’O.C.T. entourer le mouchoir pour permettre la manipulation avec le pinceau. Section à travers l’œil, en agissant rapidement. Teignez toutes les trois sections en inondant la lame d’une teinture H&E rapide en une seule étape pendant 60 secondes.

Rincez la section à l’eau du robinet et séchez-la à l’air. Après avoir nettoyé la section avec un agent nettoyant, montez la section sur une lame de verre chargée avec une lamelle, examinez au microscope. Continuez à sectionner jusqu’à ce que le TM devienne évident dans les sections tachées.

Une fois que le TM commence à apparaître, coupez deux sections et montez-les sur une lame de verre chargée pour une coloration H&E de routine afin de former une carte pour la découpe avec microdissection par capture laser. Après la première diapositive de la carte H&E, découpez et alignez six sections en série de huit microns d’épaisseur dans le cryostat et montez-les simultanément sur la lame de membrane PET. Collez le tissu en glissant brièvement un pouce ganté le long de l’arrière de la membrane.

Après le montage, placez immédiatement la glissière à membrane PET dans une boîte à glissières sur de la glace sèche. Continuez à sectionner l’œil. Après avoir obtenu toutes les deux lames de membrane PET de six sections chacune, prélevez deux sections sur une lame de verre chargée pour créer une autre diapositive cartographique pour la coloration H&E.

Continuez à sectionner environ 100 sections en série de huit microns d’épaisseur jusqu’à ce que le TM ne soit plus visible. Confirmez l’absence de TM en colorant rapidement une section sur une lame de verre chargée. Après avoir effectué la coloration des lames H&E Map comme décrit dans le protocole textuel, examinez visuellement les lames H&E à l’aide d’un microscope.

Identifiez les diapositives de carte avec TM clairement visible et accessible pour la découpe. Utilisez les diapositives à membrane PET entre ces diapositives de carte pour LCM. Retirez la boîte de diapositives contenant des sections de tissus congelés du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-la sur de la glace sèche.

Traitez les lames une par une. Fixez les sections en plaçant immédiatement la lame dans de l’éthanol froid à 75 % contenant des inhibiteurs de la RNase pendant 30 secondes. Trempez doucement la lame dans de l’eau sans nucléase pendant 10 à 15 secondes pour dissoudre l’O.C.T. sans interférer avec les sections de tissus.

Pipetez soigneusement 300 microlitres de solution d’acétate de violet de crésyle à 1,5 % directement sur les sections et incubez pendant 45 secondes à température ambiante. Ensuite, lavez une fois les sections en les plaçant dans un bain à 75 % d’éthanol pendant 30 secondes. Pipetez 200 microlitres de solution d’éosine Y sur les sections et incubez pendant trois à cinq secondes.

Déshydratez le tissu en plaçant les lames dans 75 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, et enfin un bain 100 % éthanol pendant 30 secondes chacune. Épongez l’extrémité de la lame avec une lingette en tissu entre chaque pas pour éliminer l’excès de liquide. Laissez le toboggan sécher complètement à l’air libre sous le capot pendant cinq minutes.

Une fois sec, effectuez le LCM immédiatement après. Évitez d’utiliser du xylène pour la dernière étape de nettoyage. Le traitement au xylène entraînera un montage inadéquat de la section de tissu sur la lame de membrane.

Le xylène réduira également l’efficacité de la capture tissulaire par le LCM. Placez la lame de membrane PET avec le côté du tissu coloré vers le bas directement sur le dessus d’une nouvelle lame de verre qui a été chargée sur la platine du microscope. Assurez-vous que la membrane et la lame de verre sont bien appariées sur la platine du microscope.

Démarrez LCM en définissant d’abord les limites de diapositives. Choisissez le grossissement 4X le plus bas dans le panneau Objectif, puis définissez la zone de travail de la lame de membrane en déplaçant la platine XY du microscope jusqu’à ce que le coin supérieur gauche, où le métal et la membrane se rencontrent, soit visible dans le flux vidéo en direct. À ce stade, appuyez sur le bouton Limiter 1 et un rectangle rouge apparaîtra sur la carte routière.

Ensuite, déplacez l’étape XY dans le coin opposé et appuyez sur le bouton Limit 2. Appuyez sur le bouton Scanner pour créer une image de carte routière de la membrane et des tissus entre les limites définies. Double-cliquez près de la TM de l’une des sections d’œil de la carte routière.

Le TM peut être localisé près de l’apex de l’angle iridocornéen. Une fois que le TM a été identifié, augmentez le grossissement à 10X et faites la mise au point manuellement sur le TM. Répétez l’opération avec des objectifs 20X et 40X. Lorsque le TM est mis au point avec l’objectif 40X, naviguez dans une zone vide, sélectionnez l’outil de dessin à main levée et tracez une longue ligne sur une zone vierge de tissu.

Réglez les paramètres laser de sorte que la vitesse de coupe soit de 34 %, la mise au point est de 58 % et la puissance est de 70 %, puis appuyez sur le bouton Cut. Effectuez des réglages laser précis sur les paramètres de vitesse, de mise au point et de puissance jusqu’à ce qu’une ligne de coupe claire et fine soit observée. Pour une coupe précise, assurez-vous que l’action de coupe suit la ligne tracée.

Ensuite, chargez le couvercle du tube d’isolement dans le porte-capuchon et ouvrez le tube. Fixez le porte-capuchon à l’élévateur de capuchon et assurez-vous que le tube est inversé. Assurez-vous également que le matériau du capuchon adhésif dépasse de l’extrémité du capuchon pour garantir que le tissu souhaité est correctement capturé.

Il est essentiel de s’assurer visuellement que le réseau trabéculaire est ramassé et fixé au capuchon d’isolation. Sélectionnez le mode Dissection manuelle sur le panneau du logiciel. Vérifiez soigneusement que le TM se trouve directement sous le tube d’isolement.

Réglez la balance des blancs et ajustez la luminosité pour obtenir une qualité d’image optimale. Pour commencer à couper, ajustez manuellement la mise au point et tracez une ligne à l’aide de l’outil à main levée. Assurez-vous que le capuchon de collecte reste en position haute, sans encore toucher la membrane.

Dessinez des cercles partiels près de l’endroit où le TM rencontre la sclérotique et appuyez sur Cut. Une fois les premières coupes effectuées, positionnez le capuchon en position basse et réajustez la mise au point, puis tracez deux lignes dans l’espace ouvert ou libre pour relier les deux cercles partiels, complétant le cercle autour du TM. Appuyez ensuite sur Couper et prélevez du tissu de la section. Assurez-vous que le TM a été capté par le capuchon de microdissection.

Remettez le capuchon en position haute et répétez l’opération sur les sections restantes. Ajustez légèrement la position du capuchon afin que tous les échantillons isolés s’adaptent au capuchon et ne se chevauchent pas. Pour la membrane PET suivante, insérez un nouveau tube d’isolation et répétez cette section.

Pour effectuer la lyse du tissu de la MT microdisséquée, pipetez soigneusement 10 microlitres de tampon de lyse sur le couvercle du tube de collecte, en vous assurant que le tampon de lyse recouvre complètement la TM microdisséquée. Fermez doucement le capuchon adhésif et incubez le tube de prélèvement à l’envers à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, centrifuger à 800 g pendant deux minutes et placer le lysat sur de la glace sèche. Conservez les lysats à moins 80 degrés Celsius pour une purification et une analyse ultérieures.

La dégradation rapide de l’ARN peut avoir un impact sur l’analyse de l’ARN en aval. La qualité de l’ARN doit être mesurée et quantifiée à l’aide d’une plateforme basée sur la microfluidique. Les résultats représentatifs de l’analyse de l’expression génique de l’ARN total de haute qualité purifié à partir du réseau trabéculaire sont présentés ici.

Le gel numérique pour l’ARN total restant du tissu oculaire après la microdissection laser présente un nombre élevé d’intégrité de l’ARN, ce qui est nécessaire pour l’analyse ultérieure de l’ARN en aval. Une fois qu’un ARN de qualité est extrait du tissu, des analyses en aval telles que les microréseaux, le RNA-Seq et la qPCR peuvent être effectuées. Ici, l’analyse quantitative par PCR numérique a été utilisée pour analyser l’expression des gènes associés au réseau trabéculaire, la myociline et l’ACTA2 à partir de l’ARN collecté par LCM.

La carte thermique générée à partir des données obtenues par l’analyse des microréseaux montre que cette technique peut être utilisée pour comprendre les changements d’expression génique dans le réseau trabéculaire des souris de type sauvage et des souris knock-out avec un phénotype IOP élevé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu qu’une journée par animal biologique si elle est effectuée correctement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de microdissection laser sont difficiles à apprendre en raison de la difficulté de visualisation des cellules d’intérêt et de l’absence de normes pour ces échantillons uniques.

Il est essentiel de s’appuyer sur un opérateur qualifié. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ARN dans de petites quantités de tissu peut être rapidement dégradé. Des précautions telles que la décontamination de l’équipement de la RNase, la minimisation de l’exposition à l’air et le maintien des tissus au froid doivent être prises.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des effets de l’augmentation de la pression intraoculaire sur l’expression génique spécifique du réseau trabéculaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que l’évaluation des changements dans l’expression des gènes dans la rétine causés par l’augmentation de la pression intraoculaire. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le RNA-Seq ou les micro-réseaux peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les voies de signalisation modifiées dans le réseau trabéculaire des souris ayant une pression intraoculaire élevée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier plus efficacement les changements d’expression génique dans le réseau trabéculaire dans des modèles murins.