Name: Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Apprenez la microdissection par capture laser pour isoler le trabéculum de souris et analyser l'expression génique. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires des maladies oculaires avec une grande précision.

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Le Comité de son utilisation (ACUC) et de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) animalier approuvé toute méthodologie de cette étude sous le NIEHS Animal étudier proposition IIDL 05-46.
1. Collection de tissus optimale pour Microdissection Laser
<ol><li>Obtenir 2 à 3 mois souris C57BL/6 mâles ou femelles. Euthanasier avec CO2 pendant au moins 1 min ou jusqu'à ce que la respiration a cessé. Retirez la cage de l’animal et assurer la mort par dislocation cervicale, décapitation ou thoracotomie.</li>
	<li>Avant la dissection, s’assurer que tous les outils de dissection sont propres et stérilisés. Remarque : Pour la suppression des yeux curved ciseaux et pinces avec extrémité dentelée (préféré pointe taille : 0,5 x 0,4 mm) sera nécessaire.</li>
	<li>Fixer la souris sur une surface plane sur le côté pour que l’oeil est facilement accessible. Saisir sur le canthus (coin de l’oeil) avec la pince pour stabiliser la souris, puis en utilisant les ciseaux courbes, face à la courbe de l’oeil, coupe autour de le œil en utilisant l’orbite comme un guide jusqu'à ce que le globe oculaire peut facilement être prélevé sur la prise (utiliser la courbe de pas le conseils des ciseaux).</li>
	<li>Tirez doucement et, à l’aide des ciseaux courbes, couper le nerf optique, qui libère le œil de la prise de l’orbitale. Retirer délicatement le tissu non oculaires de l’oeil et le rincer dans 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Répétez 1,3-1,4 pour le œil controlatéral.</li>
	<li>Épongez le œil avec une lingette de tissu pour enlever toute trace d’humidité avant l’intégration. Placer le œil dans moule spécimen (25 x 20 x 5 mm3) afin que la lentille et le nerf optique sont parallèles à la paillasse afin d’obtenir des coupes sagittales. Incorporer les yeux en Optimal coupe température (PTOM) composé et placez sur la glace de geler. Une fois congelé, stocker les blocs à-80 ° C.</li>
</ol>2. surgelé préparation de Microdissection Laser
<ol><li>Avant utilisation, incuber en polyéthylène téréphtalate (PET) membrane diapositives de réticulant UV à puissance maximale pendant 45 min.</li>
	<li>Pulvériser la solution de décontamination de RNase sur la brosse, pinces, bocaux de couplage et mandrin de montage. Essuyer soigneusement. Rincer avec de l’eau exempte de nucléase et sécher. Essuyer le cryostat avec 100 % d’éthanol pour éviter la contamination croisée.</li>
	<li>Ajuster le cryostat à-18 ° C. Supprimer un bloc congelé du congélateur-80 ° C à la fois et remettre au cryostat à la glace sèche. Permettre des blocs congelés s’équilibrer avec la température du cryostat pendant au moins 10 min.</li>
	<li>Déposez une petite quantité des PTOM sur le bloc de montage (Figure 1 a) et enlever le bloc de tissu du moule et déposer délicatement le bloc sur le mandrin de montage (Figure 1 b). Une fois le bloc de tissu sur le mandrin de montage est gelé, insérez sur le porte-échantillon du cryostat (Figure 2 a).</li>
	<li>Ajuster le cryostat pour coupes de 8 µm et l’article soigneusement à travers le bloc PTOM pour atteindre l’échantillon de tissu. Une fois que le tissu est observé, arrêter de sectionnement, tailler les blocs congelés sur tous les côtés à l’aide d’une lame de rasoir propre et laisser 3-4 mm des PTOM le tissu environnant pour activer le traitement avec le pinceau (Figure 2 b). Utilisez un nouveau pinceau propre au lieu de la plaque roll entre chaque changement de l’échantillon pour éviter la contamination croisée de l’échantillon.</li>
	<li>Section à travers l’oeil de travailler rapidement. Tache chaque troisième section en inondant la diapositive avec une rapide en une seule étape hématoxyline et à l’éosine (H & E) tache pendant 60 s, rincer à l’eau du robinet, l’air sec, clair en clarifiant et monter sur une lame de verre chargée avec une lamelle. Voir sous le microscope et continuer jusqu'à ce que le TM est évident dans les sections coupées de sectionnement.</li>
	<li>Une fois que le TM commence à apparaître, 2 coupes et monter sur une lame de verre chargée de routine H & E coloration pour former une carte pour la découpe avec LCM. Remarque : Voir la Section 3 pour carte et détails de coloration.</li>
	<li>Après que le premier H & E carte slide, couper et s’alignent 6 coupes série 8 µm d’épaisseur dans le cryostat et en même temps monter sur le toboggan de membrane de PET (Figure 3 a, B). Collez le tissu en poussant brièvement ganté pouce le long du dos de la membrane. Après montage, placez le PET membrane immédiatement dans une boîte de glisser sur la glace sèche. Remarque : Moins de sections peuvent être montées, toutefois, plusieurs sections sur le toboggan de montage à la fois est recommandé pour réduire la dégradation de l’ARN en limitant la durée de que chaque section est exposée à l’air à température ambiante.</li>
	<li>Continuer à la section de le œil, après chaque deux diapositives de membrane de PET avec 6 sections de chaque, recueillir deux sections sur une lame de verre chargée de créer une autre diapositive de la carte pour une coloration H & E. Continuer de sectionnement, environ 100 coupes épaisses série 8 µm, jusqu'à ce que TM n’est plus visible. Confirmer par coloration rapidement une section sur une lame de verre chargée (voir 2.6).</li>
	<li>Stockez toutes les diapositives de membrane de PET à-80 ° C pour une utilisation ultérieure de LCM.</li>
</ol>3. H & E carte Slide souillant le protocole et l’examen morphologique
<ol><li>Pour visualiser et consulter les diapositives de carte sur les lames de verre chargée, fixer le tissu de transférer immédiatement dans un pot de coloration rempli avec 100 mL de la solution de fixation rapide pour 7 s. Rincer la diapositive en plongeant dans l’eau distillée 10 - 20 fois , puis transférer la lame un bocal de couplage à l’eau distillée.</li>
	<li>Retirer la lame de l’eau et épongez les bords secs avec la lingette de tissu. Pipette de 200 µL modifiée filtré Harris hématoxyline sur chaque section et incuber pendant 30 s à température ambiante. Rincez soigneusement la lame sous l’eau courante jusqu'à ce que l’eau soit claire. Épongez la fin de la diapositive avec une lingette de tissu entre chaque étape (blot entre chaque étape de 3,2 à 3,5) pour enlever l’excès de liquide.</li>
	<li>Diapositive place dans du PBS 1 x à température ambiante pendant 30 s. Ensuite, Rincez soigneusement la lame sous l’eau courante pendant 30 s.</li>
	<li>Trempez la diapositive 3 - 4 fois dans le bain d’éthanol 95 %. Appliquer suffisamment éosine Y de solution de colorant pour couvrir le tissu sur la diapositive et incuber pendant 15 s à température ambiante.</li>
	<li>Rincer la lame dans le bain d’éthanol 95 % deux fois avec 10-20 rapides trempettes chaque. Rincer la lame dans le bain d’éthanol 100 % deux fois avec 10-20 rapides trempettes chaque. Ensuite, rincer lame deux fois dans le bain de xylène (10-20 rapides trempettes chaque).</li>
	<li>Monter en appliquant le milieu de montage résineuse au tissu, ajouter la lamelle couvre-objet avec soin pour éviter les bulles d’air et laissez-le sécher dans la hotte du jour au lendemain.</li>
	<li>Examiner les lames H & E visuellement ou à l’aide d’un scanner de diapositives numériques. Identifier les diapositives de carte avec TM clairement visible et accessible pour la coupe. Utiliser le PET diapositives membrane entre ces carte diapositives pour LCM.</li>
</ol>4. le polyéthylène téréphtalate (PET) Membrane glisse protocole de transformation et coloration
<ol><li>Avant suppression diapositives PET congélateur tout d’abord préparer violet de crésyle solution en dissolvant acétate violet de crésyle 0,3 g dans 20 mL d’éthanol 75 % et placez-la sur vibreur pendant 2 h. filtrer la solution avec 0,22 µm filtre stérile et conserver à 4 ° C pour ne plus que 6 Lun THS.</li>
	<li>Préparer la solution alcoolique d’éosine Y avec frais d’éthanol 75 % à un ratio de 1:4. Préparer la fixation (75 % d’éthanol) et des solutions de déshydratation (75 %, 95 % et 100 % éthanol) dans les tubes en polypropylène conique propre, exempte de nucléase, 50 mL sur la glace. Ajouter inhibiteur de RNase à chaque solution.</li>
	<li>Enlever le boîtier de la diapositive contenant des coupes de tissus congelés du congélateur-80 ° C et placez-le sur la glace sèche. Traiter une diapositive à temps. Difficulté des diapositives en plaçant la lame immédiatement en éthanol froid de 75 % pendant 30 s.</li>
	<li>Doucement, tremper la lame dans l’eau sans nucléase pour 10-15 s dissoudre les PTOM sans interférer avec les coupes de tissus.</li>
	<li>Soigneusement distribuer 300 µL de solution d’acétate violet de crésyle 1,5 % directement sur les sections et incuber pendant 45 s à température ambiante. Ensuite, laver une seule fois en le plaçant dans le bain d’éthanol 75 % pour s. solution 30 µL Pipette 200 éosine Y sur les sections et incuber pendant 3-5 s.</li>
	<li>Déshydrater le tissu en plaçant la diapositive par la suite dans 75 % d’éthanol, éthanol à 95 % et enfin, bain d’éthanol 100 % pendant 30 s de chaque. Épongez la fin de la diapositive avec une lingette de tissu entre chaque étape pour enlever l’excès de liquide. Laissez l’air de la lame sécher sous le capot pendant 5 min. Une fois sec, effectuez immédiatement après LCM. Remarque : Il est recommandé d’éviter l’utilisation du xylène pour cette étape, il peut causer des sections de tissu à coller insuffisamment à la diapositive de la membrane et réduit l’efficacité de capture des tissus.</li>
</ol>5. laser Microdissection laser UV
<ol><li>Allumez l’ordinateur et permettent de démarrer. Ouvrir l’alimentation de puissance lumineuse blanche du microscope. Mettez la clé de laser UV et un jaune LED s’allume. Démarrez le logiciel LCM, permettent pour charger entièrement et une vidéo en direct seront affiche. Appuyez sur le bouton du laser sur le boîtier et un voyant vert s’allume.</li>
	<li>Charger une nouvelle lame de verre sur la platine du microscope, puis placez le chariot de membrane de PET avec le côté tissu taché vers le bas, directement sur le dessus de la lame de verre. S’assurer que la membrane et la lame de verre sont couplées étroitement sur la platine du microscope.</li>
	<li>Début LCM en premier définissant les limites de la diapositive. Choisissez le plus bas 4 X grossissement dans le panneau objectif (Figure 4). Définissez ensuite la zone de travail de la diapositive de membrane en déplaçant le microscopes xy-étape jusqu'à ce que le coin supérieur gauche, où se rencontrent le métal et la membrane est visible dans la vidéo en direct d’alimentation, appuyez sur le bouton « Limit 1 » et un rectangle rouge apparaît sur la feuille de route. Ensuite, passer à la phase-xy jusqu’au coin opposé et appuyez sur le bouton « limiter la 2 ». Appuyez sur le bouton « scan » pour créer une image de la feuille de route de la membrane et le tissus entre les limites définies.</li>
	<li>Double-cliquez sur près de la TM d’une des sections yeux dans la feuille de route, le TM peut être situé près du sommet de l’angle iridocornéen (Figure 5 a). Une fois que le TM a été identifié, augmenter le grossissement de 10 X et manuellement mettant l’accent sur le TM. Répéter l’opération avec 20 X et 40 X objectifs. Lorsque le TM est en discussion avec l’objectif de X 40 (Figure 5 b), naviguer dans une zone vide à proximité (accent éventuellement être légèrement modifié), sélectionnez l’outil « dessin à main levée » et tracez une ligne longue sur une zone vide du tissu.</li>
	<li>Définissez les paramètres laser afin que la « vitesse de coupe » est de 34 %, « focus » est de 58 % et « power » est de 70 % (Figure 4), puis appuyez sur le bouton « couper ». Faire des ajustements de laser fine à la vitesse, le focus et paramètres de puissance jusqu'à ce qu’une ligne de coupe claire et fine est observée (voir Figure 5). Pour des coupes précises, s’assurer que l’action de coupe suit la ligne tracée.</li>
	<li>Chargez le couvercle du tube d’isolation dans le porte-bouchon et ouvrir le tube. Fixer le porte-bouchon au cap-lève-patient et s’assurer que le tube est inversé. S’assurer que le matériel adhésif cap fait saillie au-delà de l’extrémité de la PAC pour s’assurer que le tissu désiré est correctement saisis.</li>
	<li>Sélectionnez le mode de dissection « Manuel » dans le panneau de logiciel. Examiner attentivement que le TM (Figure 5 b) située directement sous le tube d’isolation. Régler la balance des blancs et régler la luminosité afin d’acquérir la qualité d’image optimale (Figure 4).</li>
	<li>Pour commencer la coupe, manuellement ajuster la mise au point et tracer une ligne à l’aide de l’outil dessin à main levée, s’assurer que le bouchon de la collection reste en position haute pas encore toucher la membrane. Tirage au sort des cercles partielles près où le TM rencontre la sclère (Figure 5), puis appuyez sur « couper ». Une fois effectuées les premières coupes, placer le bouchon en position basse et ré-ajuster le focus, puis dessinez deux lignes dans l’espace ouvert ou libre pour connecter les deux cercles partielles boucler la boucle autour de la TM, puis appuyez sur « couper » et recueillir des tissus de section , faire en sorte que le TM a été repris par le bouchon de la microdissection (Figure 5 D-F).</li>
	<li>Placer le bouchon arrière en position relevée et répéter (5.2-5.8) sur les autres sections. Ajustez légèrement la position du capot afin que tous les échantillons isolés conviendront sur le capuchon et se chevauchent pas (Figure 5). Par souci de cohérence, la fenêtre de temps pour une diapositive est 20 min. utilisation moins de sections par animal glissent si un délai supplémentaire est nécessaire pour isoler les TM de toutes les sections. Pour la prochaine membrane PET, insérez un nouveau tube d’isolation et répéter la section 5.</li>
</ol>6. Lyse tissu de Microdissected TM
<ol><li>Fraîchement préparer tampon de lyse RNA à lyse tissulaire LCM isolé. Ajouter 10 µL de β-mercaptoéthanol à chaque 1 mL de la mémoire tampon de lyse. Stocker le tampon de lyse avec β-mercaptoéthanol à température ambiante pendant pas plus de 1 mois.</li>
	<li>Retirez le tube d’isolation de porte-bouchon à 20 min du début de la microdissection. Visualiser la surface de la PAC par œil pour s’assurer de la prise de TM.</li>
	<li>Soigneusement Pipeter 10 µL de tampon de lyse sur le couvercle du tube collection assurant le tampon de lyse couvre complètement le microdissected TM. Doucement fermer bouchon adhésif et incuber le tube de prélèvement à l’envers à température ambiante pendant 10 min. Après incubation, centrifuger à 800 g pendant 2 min et placez lysat sur la glace sèche. Stocker des lysats à-80 ° C pour la purification et l’analyse ultérieure.</li>
</ol>7. isolement et analyse de la qualité
<ol><li>Analyser la qualité de RNA de décongeler les échantillons à la température ambiante. Piscine ensemble tous les échantillons prélevés une seule souris dans un tube à centrifuger exempte de RNase 1,5 mL. NOTE : par exemple, pour chaque réplicat biologique, 10-12 tubes avec bouchons microdissected en 10 µL de lysat ont été générés et tous les lysats ont été transférées dans un tube unique pour chaque réplicat biologique (100-120 µL de lysat).</li>
	<li>Ajouter un volume d’éthanol à 70 % fraîchement préparée (faite avec de l’eau exempte de RNase) à chaque solution lysate. Puis, purifier l’ARN total suivant les directives d’utilisateur RNA isolation kit. Assurer l’élimination de l’ADN génomique de chaque échantillon de RNA. Remarque : L’ADN génomique peut interférer avec l’analyse en aval de RNA.</li>
	<li>Mesurer la qualité de l’ARN isolé de la TM en rassemblant des échantillons provenant de chaque souris et en analysant l’intégrité de l’ARN ribosomique (Figure 6 a). Remarque : En raison de l’exiguïté du TM, ARN ribosomique pics peut-être pas observable (Figure 6 b) sur le profil de qualité RNA (deux pics observés entre 1 000-4 000 bp dans la Figure 6 a, C) qui est utilisé pour calculer le nombre d’intégrité RNA (RIN) 47.<ol>
<li>Isoler l’ARN du tissu restant plus abondant sur la diapositive de la membrane pour obtenir une mesure plus précise de l’intégrité de la RNA. Afin d’obtenir un représentant RIN, RNA isolat provenant du tissu oculaire-sur la lame de la membrane par pipetage 10 lyse µL de tampon avec la section d’un tissu et effectuer des ARN. Analyser la qualité de RNA et calculer RIN (Figure 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les applications en aval de RNA, utiliser un kit d’ARN d’entrée faible pour génération de bibliothèque séquençage et ARNC céder reproductible résulte d’aussi peu que 80 sections de LCM isolé TM.</li>
</ol>8. analyse
<ol><li>Pour vérifier que les tissus collectés sont en effet riche en gènes associés à la TM, recueillir plusieurs RNA supplémentaire de microdissected oeil entier, sclera, iris, rétine, cornée et lentille de 3 souris séparées. Utilisation de que cet ARN en combinaison avec LCM recueillies RNA isolé TM et le corps ciliaire prélevé 4 souris séparées.</li>
	<li>Conversion de que l’ARN à partir des échantillons de microdissected était de cDNA utilisant un kit de transcription inverse de cDNA. Amplifier l’ARN provenant d’échantillons de LCM isolé et convertir au cDNA utilisant un faible apport RNA pour trousse de cDNA.</li>
	<li>Analysez tous les ARN pour exprimer de gènes, myocilin (MYOC) et alpha-actine-2 (ACTA2), réseau trabéculaire et normaliser l’utilisation du gène de ménage HSP90a1 par PCR numérique (Figure 7 a-B).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le TM joue un rôle essentiel pour maintenir activement IOP homéostatique et son dysfonctionnement est largement reconnue comme le principal facteur causal pour hypertendus glaucome1,2,19. Un certain nombre de polymorphismes dans plusieurs gènes identifiés par analyse GWAS ont été lié à risque de glaucome accrue et une résistance accrue à la facilité de sortie AH à la TM ; Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui donnent...

Le glaucome est un groupe de maladies caractérisées par une neuropathie optique et rétinopathie qui conduit finalement à une cécité irréversible1,2. On estime qu’en 2020 plus 70 millions de personnes dans le monde vivra avec une certaine forme de la maladie3,4,5,6,7. Glaucome primaire à angle ouvert (GPAO), le plus répandu type de glaucome, se caractérise par une diminution de l’écoulement de l’humeur aqueuse (AH) conduisant à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Gauche IOP non traitée, chroniquement élevé entraîne des dommages progressifs et irréversibles de la rétine et de la tête du nerf optique entraînant la cécité radial1,2,19. Toutes les méthodes actuelles pour ralentir la progression du glaucome portera essentiellement sur réduction IOP, soit en diminuant le taux de production de AH par le corps ciliaire ou en améliorant son écoulement1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. le réseau trabéculaire (TM) joue un rôle essentiel dans la régulation active de la voie de sortie primaire AH et sa fonction incorrecte est un facteur de causalité pour les hypertendus glaucome1,2,19. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la dysfonction TM et comment il régule AH drainage ne sont pas encore bien compris et est actuellement une préoccupation majeure de glaucome recherche1,2,19, 20. bien que plusieurs études d’association pangénomique (GWAS) ont lié à un certain nombre de gènes au glaucome et une résistance accrue à la facilité de sortie AH à la TM, les mécanismes moléculaires exacts qui mènent à la maladie ne sont pas encore pleinement compris21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Des modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances actuelles de la progression de la maladie dans le glaucome (largement revu dans3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,,33). Plusieurs méthodes pionnières ont été développées pour étudier les TM34,35,36 , et ces méthodes ont été largement utilisées pour faire progresser notre compréhension actuelle des tissus normaux et malades. Un domaine qui n’a pas été intensivement exploré est l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’échec de TM. Transgénique knock-in et études sur les souris knock out de gènes TM associé, tels que Myocilin (Myoc)37,38 et39de Cyp1b1, ont été les principaux outils pour étudier les mécanismes moléculaires du TM fonction. Naturellement, la petite taille du TM chez la souris représente un obstacle sérieux qui doit être surmonté afin de commencer à étudier ce tissu. Modèles de souris représentent un outil puissant pour l’étude de la génétique et les mécanismes moléculaires de la maladie, tandis que les percées dans les technologies LCM fournissent les outils nécessaires pour permettre l’étude des tissus plus petits et plus délicats, y compris le TM.
Dans ce rapport, une méthode fiable et reproductible est décrite pour le ppcm de TM fortement enrichi d’yeux de souris avec les ARN et amplification pour l’analyse de l’expression en aval. Des méthodes similaires ont été utilisés avec succès chez des souris pour isoler des autres types d’oculaires tissus40,41,42,43,44, la méthodologie rapportée ici peut être appliquée à d’autres tissus discrètes de le œil pour étudier les ARN, micro-ARN, ADN et protéines. Ce qui est important, cette technique permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mieux comprendre la pathogenèse moléculaire de la déficience de TM dans le glaucome et maladie oculaire3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La capacité d’isoler le TM des yeux de souris par LCM sera une technique utile à obtenir un complément d’éclairage sur les mécanismes moléculaires de plusieurs maladies oculaires.

<table><tbody><tr><td>Amorces ddPCR ACTA2 (dMmuCPE5117282)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td>FAM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946-90004</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>BioRad QX200 Système de PCR numérique à gouttelettes</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petit pinceau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope en verre chargé</td><td>Thermo scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acétate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux incurvés</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y colorant</td><td>Thermo scientific</td><td>71204</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td> à l’éthanol <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Pointe incurvée et dentelée (taille de pointe préférée : 0,5 x 0,4 mm)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HemaCen</td><td>American MasterTech</td><td>STHEM30</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Hsp90a Amorces ddPCR(dMmuCPE5097465)</td><td>BioRad</td><td>10031255</td><td>VEX</td></tr><tr><td>Leica CM1850 Cryostat</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS unité de filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>0.22 &micro; m</td></tr><tr><td>MMI CellCut UV Modèle</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td></td><td>LCM instrumentation</td></tr><tr><td>MMI CellTools Logiciel</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td>50202</td><td>Logiciel LCM</td></tr><tr><td>Tube d’échantillon pour la capture laser Microdisssection</td><td>Produits ASEE</td><td>ST-LMD-M-500</td><td>Tube de capuchon d’isolation/Fabriqué par Microdissect GmBH en Allemagne et disserté par ASEE Produits</td></tr><tr><td>Tube d’échantillon pour la capture laser Microdisssection (Alternative)</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modifiées Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>7211</td><td>FAM</td></tr><tr><td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Memebrane Slides, RNase Free</td><td>ASEE Products</td><td>FS-LMD-M-50r</td><td>Membrane en polyéthylène téréphtalate (PET) / Fabriqué par Microdissect GmBH en Allemagne et disserté par ASEE Produits</td></tr><tr><td>Lames Memebrane, sans RNase (Alternative)</td><td>Machines moléculaires & Industries</td><td>50102</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Fix</td><td>Thermo scientific</td><td>6764212</td><td>H& E staining</td></tr><tr><td>RLT Buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>polisseur de lyse utilisé pour les échantillons LCM</td></tr><tr><td>RNAseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Solution de décontamination RNAse</td></tr><tr><td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7397</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Kit d’isolation d’ARN</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit d’ARN à très faible entrée</td><td>Takara Clontech</td><td>634888</td><td>kit ARN vers ADNc à faible entrée pour échantillons LCM SuperMix</td></tr><tr><td>(sans dUTP)</td><td>BioRad</td><td>1863023</td><td>master mix PCR numérique</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Macron</td><td>8668</td><td></td></tr></tbody></table>

saisie microdissection de trabéculum très pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’expression génique

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Microdissection de saisie de laser (LCM) a permis à analyse d’expression de gène des cellules individuelles et enrichi des populations de cellules dans des sections de tissu. LCM est un excellent outil pour l’étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation cellulaire et le développement et la progression de diverses maladies, notamment un glaucome. Le glaucome, qui comprend une famille de neuropathies optiques progressifs, est la cause la plus fréquente de cécité irréversible dans le monde entier. Augmenté la pression intraoculaire (PIO), qui est un facteur de risque majeur pour le développement de glaucome peuvent entraîner des changements structurels et des dommages dans le réseau trabéculaire (TM). Cependant, les mécanismes moléculaires précis sont encore mal compris. La capacité d’effectuer l’analyse de l’expression génique sera cruciale pour obtenir un complément d’éclairage sur la fonction de ces cellules et son rôle dans la régulation du développement IOP et glaucome. Pour ce faire, une méthode reproductible pour isoler fortement enrichi TM de coupes congelées d’yeux de souris et une méthode pour l’analyse de l’expression génique en aval, tels que la RT-qPCR et RNA-Seq est nécessaire. La méthode décrite ici est développée pour isoler fortement pur TM des yeux de souris pour PCR numérique en aval et l’analyse de microarray. En outre, cette technique peut être facilement adaptée pour l’isolement des autres cellules oculaires hautement enrichis et les compartiments cellulaires qui ont été difficiles à isoler des yeux de souris. La combinaison de l’analyse de LCM et de l’ARN peut contribuer à une compréhension plus approfondie des événements cellulaires qui sous-tendent le glaucome.

LCM prélevés RNA dans le TM et le corps ciliaire de 4 différentes souris a été isolé pour pouvoir analyser l’expression des gènes et de comparer l’expression avec celle dans l’oeil entier, sclera, iris, rétine, cornée et lentille isolés de trois souris séparées. TM exprimant des gènes, MYOC48 et49 de la ACTA2ont été analysés dans tous les tissus prélevés afin de confirmer que les échantillons de TM isolés étaient en effet f...

Nous décrivons ici un protocole pour une microdissection laser reproductible de la saisie (LCM) pour isoler le réseau trabéculaire (TM) pour l’analyse en aval de RNA. La capacité d’analyser les changements dans l’expression des gènes dans le TM aidera à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents des maladies oculaires liées au TM.

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

L’objectif global de cette procédure de microdissection laser est de développer une méthode robuste et reproductible pour l’isolement d’un réseau trabéculaire hautement enrichi à partir d’yeux de souris à l’aide de la microscopie à capture laser pour l’isolement ultérieur de l’ARN et l’analyse de l’expression en aval. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie, telles que quels sont les gènes importants et les voies de signalisation qui, lorsqu’ils sont mal régulés, peuvent conduire à des maladies oculaires. Le principal avantage de cette technique est que l’ARN de haute qualité provenant du réseau trabéculaire des yeux de souris peut être isolé de manière reproductible pour l’analyse de l’expression génique.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la microdissection au laser est une technique puissante qui implique diverses étapes de dépannage tout au long du protocole. Commencez cette procédure par un prélèvement optimal de tissus pour la microdissection au laser, comme décrit dans le protocole textuel. Vaporisez la solution de décontamination RNase sur la brosse, la pince, les bocaux d’accou

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Microdissection laser des tissus de mammifères

Microdissection laser a été appliquée pour analyser les profils d'expression génique dans des compartiments spécifiques de la drosophile aile disque soumis à localisées...

Microdissection laser appliquée au profil d&#39;expression génique de la Sous-ensemble de cellules provenant de la Drosophile Wing disque

Le profilage de l'expression de l'ARN de régions cérébrales murines discrètes nécessite une stratégie de collecte de tissus précise et reproductible. Un protocole utilisant à la fois la section coronale du cerveau et la microdissection assistée par un carottier tissulaire est décrit ici. Le rendement et la qualité de l'ARN total obtenu à partir des échantillons résultants confirment l'utilité de la méthode décrite.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

Nous décrivons comment utiliser la microdissection par capture laser (LCM) pour obtenir des populations enrichies de neurones de l'hippocampe ou des neurones simples de coupes congelées de cerveau de rat blessé pour l'analyse d'expression génique ultérieure à l'aide quantitative PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Dans cet article, nous décrivons les principes de conception et de réalisation d’une expérience de traçage de lignage multicolore à l’aide de souris R26R-Confetti. Nous fournissons un protocole spécifique pour le suivi des cellules épithéliales cornéennes qui peuvent être modifiées pour d’autres tissus d’intérêt.

Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Un protocole de microdissection de capture laser (LCM) a été développé pour obtenir une quantité suffisante d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression génique dans les cellules osseuses. L'étude actuelle se concentre sur les sections de fémur de souris. Cependant, le protocole LCM rapporté ici peut être utilisé pour étudier l'expression des gènes dans les cellules de tout tissu dur.

Un protocole de microdissection de capture de laser qui donne l'ARN de haute qualité des os frais-congelés de souris

Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l'isolement du cartilage et de l'os des sections congelées fraîches de l'embryon de souris. Le cartilage et l'os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.

Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

Cet article présente un protocole pour la microdissection oculaire chez les rongeurs. Le processus implique l’énucléation du globe oculaire avec la membrane nictitante (c’est-à-dire la troisième paupière). Ceci est ensuite suivi par la séparation des cupules postérieures et antérieures.

Microdissection de l’œil de rongeur

Ce protocole détaille la séparation de l’épithélium du cristallin oculaire de la souris et de la masse en vrac des cellules fibreuses, suivie de l’isolement de l’ARN et de l’analyse qPCR. Cette méthode permet de séparer les compartiments cellulaires du cristallin pour une analyse plus détaillée du transcriptome et des processus biologiques dans les cellules épithéliales par rapport aux cellules fibreuses différenciées.

Isolement de l’ARN à partir de l’épithélium du cristallin oculaire de souris et de masses massives de cellules fibreuses

Apprenez la microdissection par capture laser pour isoler le trabéculum de souris et analyser l'expression génique. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires des maladies oculaires avec une grande précision.

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

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