Analyse moléculaire de Transition endothéliales-mésenchymateuses induite par le Transforming Growth Factor-β de signalisation

Un protocole pour in vitro induction de transition endothéliales-mésenchymateuse (EndMT), qui est utile pour étudier les voies de signalisation cellulaires impliqués dans EndMT, est décrite. Dans ce modèle expérimental, EndMT est induite par le traitement avec le TGF-β dans les cellules endothéliales MS-1.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie vasculaire et du cancer, telles que les mécanismes de plasticité endothéliale dans diverses conditions pathologiques, y compris le cancer. Le principal avantage de cette technique est que l’induction robuste de l’EndMT in vitro est réalisée par un traitement avec du TGF-dans les cellules endothéliales MS-1. Cultivez d’abord les cellules MS-1 dans des conditions de culture standard et évitez que la culture ne soit confluente.

Ensuite, sur une parabole de 10 cm, lavez les cellules MS-1 avec 1 solution saline tamponnée au phosphate. Ajoutez ensuite 1 ml de trypsine dans la plaque et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 9 mL de milieu de culture dans les cellules trypsinisées pour le détachement.

Recueillir ensuite la suspension cellulaire trypsinisée dans un tube de 15 mL. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 à 400 x G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez un compteur de cellules automatique pour compter le nombre de cellules viables.

Ensuite, plaquez les cellules MS-1 sur des plaques de culture standard non revêtues pour une culture à long terme. Après 24 heures, stimulez les cellules endothéliales avec une concentration finale de 1 ng par millilitre de TGF-2. Ensuite, incubez la plaque de culture à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 48 heures de traitement, remplacez le milieu par un milieu de culture frais, préchauffé contenant du TGF-2. Pour l’analyse en aval, placez les cellules MS-1 sur une lame de chambre de culture à 8 puits pré-recouverte de gélatine. Après 24 heures, ajoutez 10 M d’inhibiteur de ROCK à la culture cellulaire. Après une heure, stimulez les cellules endothéliales avec une concentration finale de 1 ng par millilitre de TGF-2.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius. Pour une culture de 72 heures, remplacez l’ancien milieu par un milieu frais contenant du TGF-2 après 48 heures. Après une journée entière de traitement au TGF, retirez le milieu.

Fixez ensuite les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % et une solution saline tamponnée au phosphate pendant 20 minutes à température ambiante. Une fois la période de fixation terminée, rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, incubez les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 pendant cinq minutes à température ambiante.

Après cinq minutes, rincez à nouveau les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate trois fois. Après trois lavages, incubez les cellules avec de la phallotoxine fluorescente diluée contenant un tampon bloquant pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, laver les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate, trois fois.

Ensuite, colorez les noyaux cellulaires à l’aide d’un colorant de liaison à l’acide nucléique cyanine pendant cinq minutes à température ambiante. Au bout de cinq minutes, rincez la diapositive et montez une lamelle sur la diapositive à l’aide d’un support de montage de diapositive. Observez les cellules au microscope confocal.

Les cellules montrent une réorganisation des fibres de stress épaisses lors du traitement au TGF-2. Cela indique la puissance du TGF-2 dans l’induction de EndMT dans les cellules endothéliales. Après 72 heures de traitement au TGF-2, jetez le milieu et fixez les cellules avec 0,5 à 1 ml de méthanol froid à 50 % et d’acétone à 50 % pendant cinq minutes.

Rincez ensuite les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate, trois fois. Une fois les trois lavages terminés, incubez les cellules avec les anticorps primaires dans un tampon de blocage pendant la nuit à 4 degrés Celsius, dans l’obscurité. Le lendemain, lavez à nouveau les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate, trois fois.

Ensuite, incubez les cellules avec un anticorps secondaire conjugué à un colorant vert contre la VE-cadhérine dans un tampon de blocage, pendant une heure dans l’obscurité. Lavez à nouveau les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate, trois fois. Ensuite, colorez les noyaux cellulaires à l’aide d’un colorant de liaison à l’acide nucléique cyanine pendant cinq minutes à température ambiante.

Au bout de cinq minutes, rincez la diapositive et montez une lamelle sur la diapositive à l’aide d’un support de montage de diapositive. Observez ensuite les cellules au microscope confocal. Les cellules montrent une diminution de l’expression de la VE-cadhérine et une augmentation de l’expression de l’actine des muscles lisses lors du traitement par TGF-2 pendant 48 à 72 heures.

Avant le test de contraction du gel de collagène, cultivez les cellules MS-1 en présence et en absence de TGF-2 pendant 72 heures. Préparez ensuite le gel de collagène de type 1 sur glace. Mélangez ensuite 800 ml de la solution de gel de collagène avec 200 ml de cellules endothéliales de contrôle ou traitées au TGF-2.

Ensuite, ajoutez 1 ml de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de culture à 12 puits. Laissez le gel se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après la solidification du gel, ajoutez 1 ml de MEM Alpha, contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 50 unités par millilitre de pénicilline et 50 g par millilitre de streptomycine, pour faire flotter le gel.

Ensuite, détachez le gel de la paroi du puits et incubez le gel flottant à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Après 48 heures d’incubation, scannez les images du gel depuis le bas de la plaque à l’aide d’un scanner. Des changements morphologiques distincts sont visibles, transformant les cellules du pavé à l’architecture en forme de fuseau mésenchymateux en raison de l’exposition au traitement au TGF-2 pendant 72 heures.

Il est intéressant de noter que le traitement au TGF bêta-2 pendant 48 à 72 heures montre une augmentation des niveaux d’expression de l’ARNm et des protéines de l’actine musculaire lisse dans les cellules MS-1. Le test de contraction du gel montre également qu’après le traitement au TGF-2, le gel de collagène de type 1 se contracte de manière significative. Il est intéressant de noter que la privation de TGF-2 diminue l’actine du muscle lisse au niveau basal et que les cellules reprennent la morphologie des pavés, indiquant que EndMT est un processus dynamique.

En fait, l’inhibition du microARN 31 par l’inhibiteur du microARN LNA à l’aide des cellules MS-1, atténue l’induction de marqueurs mésenchymateux. Cependant, l’inhibiteur n’affecte pas l’induction des gènes cibles du TGF tels que la fibronectine 1, le PAI-1 et le Smad 7. Suivre cette procédure comme une méthode telle que l’expression génique, l’inactivation ou la modulation de microarray, peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la fonction spécifique d’un gène et d’un microARN dans EndMT.