Électrochimique détection de cinétique effet isotopique sur extracellulaire Transport d’électrons dans Shewanella oneidensis MR-1

L’objectif général de ce protocole est d’observer la contribution du transport des protons au taux de transport des électrons extracellulaires bactériens par la détection de l’effet isotopique cinétique du deutérium. Notre méthode révèle l’impact du transport des protons sur la cinétique du transport extracellulaire des électrons, ou EET, des bactéries vers une électrode via des cytochromes de type c de la membrane externe. Notre test reflète la gestion native des protons dans EET car nous avons utilisé des bactéries vivantes plutôt que des enzymes purifiées.

Cependant, notre défi était d’éliminer les bruits d’autres processus cellulaires. L’effet isotopique cinétique du deutérium, appelé KIE, est l’une des meilleures techniques pour examiner la contribution du transport des protons sur le processus de transport des électrons associé. Pour cultiver des cellules Shewanella MR-1, transférez une colonie de cellules cultivées sur une plaque de gélose dans 15 millilitres de milieu LB.

Cultivez les cellules à 30 degrés Celsius pendant 24 heures dans des conditions aérobies avec agitation à 160 tr/min. Centrifugez la suspension cellulaire à 6 000 fois la gravité pendant 10 minutes. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire résultante dans 15 millilitres de Defined Medium, complété par 10 millimolaires de lactate comme source de carbone et 0,5 gramme par litre d’extrait de levure comme oligo-éléments pour les cellules.

Après avoir cultivé la suspension cellulaire de manière aérobie à 30 degrés Celsius pendant 12 heures avec agitation à 160 tr/min, centrifugez-la à nouveau à 6 000 fois la gravité pendant 10 minutes. Laver deux fois la pastille cellulaire résultante avec un milieu DM par centrifugation pendant 10 minutes à 6 000 fois la gravité avant l’expérience électrochimique. Pour construire un réacteur électrochimique à trois électrodes, placez un substrat ITO comme électrode de travail au fond du réacteur.

Par la suite, insérez un cylindre en verre et un couvercle en polytétrafluoroéthylène et insérez un fil de platine comme contre-électrode. Ensuite, insérez une électrode de chlorure d’argent dans le réacteur comme électrode de référence. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de MS complétés par 10 millimolaires de lactate et 0,5 gramme par litre d’extrait de levure dans le réacteur électrochimique.

Après avoir vérifié qu’il n’y a pas de fuite du réacteur électrochimique, faites couler l’azote gazeux dans le réacteur électrochimique pendant 20 minutes pour maintenir des conditions anaérobies à l’intérieur du réacteur électrochimique. Connectez le réacteur électrochimique à un potentiostat et appliquez une tension positive de 0,4 volt à l’électrode ITO, en maintenant la température du réacteur électrochimique à 30 degrés Celsius à l’aide d’un système de circulation d’eau externe. Pour effectuer une culture électrochimique, ajustez d’abord la densité cellulaire de la suspension à une densité optique de 1,43 à 600 nanomètres avec de la DM complétée par 10 millimolaires de lactate et 0,5 gramme par litre d’extrait de levure.

Ajoutez 0,3 millilitre de suspension de cellule dans le réacteur électrochimique par l’orifice d’injection à l’aide d’une seringue. L’OD 600 dans le réacteur passe à 0,1. Poursuivre l’application potentielle à 0,4 volt positif sur l’électrode ITO pendant 25 heures.

Arrêtez l’application potentielle et déconnectez le réacteur électrochimique du potentiostat et du système de circulation d’eau. Versez l’azote gazeux dans une bouteille contenant du MS avec 10 millimolaires de lactate pendant 20 minutes pour éliminer l’oxygène du milieu. Maintenant, extrêmement lentement et doucement, retirez tout le surnageant de l’intérieur du réacteur électrochimique à l’aide d’une seringue sous l’azote gazeux qui s’écoule.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de MS frais contenant 10 millimolaires de lactate à l’aide d’une seringue. Inclinez le réacteur électrochimique pour éliminer tout le surnageant sur la paroi du réacteur. Répétez ces étapes trois fois au total.

Arrêtez le flux de gaz et connectez à nouveau le réacteur électrochimique au potentiostat, en appliquant un point positif de 0,4 volt à l’électrode ITO à 303 Kelvin. Confirmer que la production actuelle d’un biofilm monocouche de Shewanella MR-1 est stable et n’augmente pas rapidement. Si le courant augmente fortement, attendez qu’il se stabilise avec une augmentation de 5 % sur 10 minutes.

Extrêmement lentement et doucement, ajoutez 40 microlitres de D2O anoxique à 50 % en volume dans le réacteur électrochimique à l’aide d’une seringue de sorte que la concentration soit de 0,5 % en volume de D2O dans le réacteur. Pour éviter d’endommager le biofilm par l’ajout de D20, injectez le D2O goutte à goutte. Attendez que le courant se stabilise et ajoutez ensuite le D2O jusqu’à 4,4 % en volume pour obtenir la valeur KIE, qui est le rapport entre la production actuelle et la présence de D2O et de H2O.

Vérifiez l’effet du même volume d’ajout de H2O sur la production en cours. Ici, la ligne continue est le résultat représentatif de la variation du courant microbien induite par l’addition de D2O. L’ajout de D2O a fortement diminué le courant microbien en 10 secondes, tandis que H20 n’a eu presque aucune diminution de courant, comme le montre la ligne pointillée.

Pour confirmer que la diminution de courant observée par D2O est attribuable au transport d’électrons à travers les cytochromes de la membrane externe, un médiateur d’électrons diffuseur a été utilisé. Ici, l’ajout de 100 alpha-AQS micromolaires a augmenté la production actuelle de plus de cinq fois et la production actuelle n’a pas été affectée par l’ajout de D2O. Ces résultats indiquent que la cinétique des réactions métaboliques est suffisamment rapide pour que le processus de transfert d’électrons extracellulaire soit limité à la vitesse.

Une autre méthode pour évaluer cela est l’ajout de la molécule de flavine dans le réacteur électrochimique. Une augmentation instantanée du courant anodique par addition de flavine indique une limitation du taux par le processus de transport d’électrons via les cytochromes de la membrane externe. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’examiner l’effet isotopique cinétique sur le processus de transport d’électrons extracellulaires.

Le point le plus critique pour obtenir avec succès l’effet isotopique cinétique est de clarifier et de confirmer la condition où le transport d’électrons à travers les cytochromes de la membrane externe limite le taux de production de courant. Dans cette vidéo, nous avons présenté deux méthodes pour confirmer cette condition, l’observation du changement de courant par l’ajout de flavine et par l’ajout de médiateurs supplémentaires diffusants, tels que l’alpha-AQS. Une fois la limitation de débit confirmée, ce système peut être utilisé non seulement pour l’expérience sur le deutérium, mais aussi pour la caractérisation biochimique des cytochromes de la membrane externe.

De plus, ce protocole pourrait être applicable à l’examen d’autres microbes électroactifs, tant que le processus de transport extracellulaire des électrons est limité au débit. Notre méthodologie fournit une technique de base et générale pour étudier le processus de transport d’électrons extracellulaires via les cytochromes de la membrane externe in vivo.