Name: Un ciblage GPC3 anticorps bispécifiques, GPC3-S-Fab, avec puissante cytotoxicité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez la production de l'anticorps bispécifique GPC3-S-Fab dans Escherichia coli pour la recherche sur le cancer du foie. Cette méthode permet d'obtenir une cytotoxicité puissante contre les cellules tumorales GPC3+.

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Ce travail a été soutenu financièrement par la R & D Plan de la Province du Guangdong (Chine) (2016A050503028).

Toutes les procédures y compris la collecte de sang humain ont été approuvées par le Comité d’éthique de Sun Yat-Sen University.
1. la GPC3-S-Fab Design stratégie
<ol><li>Conception GPC3-S-Fab en liant un Fab d’anti-GPC3 (CG33 humanisé13) avec un anti-CD16 VHH14 (Figure 1).</li>
	<li>Synthétiser et cloner les VH-CH1-CD16-VHH et VL-CL dans les pET26b et la pET21a des vecteurs comme indiqué précédemment12.</li>
</ol>2. transformation et la Culture
<ol><li>Ajouter 100 ng de pET26b contenant VH-CH1-CD16 (Figure 1 a) et 100 ng de pET21a contenant VL-CL (Figure 1 a) dans 100 µL de compétente BL21 (DE3) cellules. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 30 min. Incuber dans un bain-marie à 42 ° C pendant 45-90 s, transfert et incuber sur glace pendant 3-5 min.</li>
	<li>Ajouter 500 µL de milieu de lysogénie bouillon (LB) dans un tube contenant BL21 (DE3) cellules et puis incuber à 37 ° C, 150 tr/min pendant 45-60 min. propagation 100 µL de BL21 (DE3) cellules sur LB-agar assiettes contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et puis incuber à 37 ° C pendant 12 à 16 h.<ol>
<li>Préparer lysogénie milieu de bouillon (LB) : 1 % wt/vol tryptone, 0,5 % wt/vol extrait de levure, 1 % wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensemencer les cellules d’une seule colonie dans 5 mL de milieu de super bouillon (SB) contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicillineet de culture à 37 ° C, 220 tr/mn, du jour au lendemain. Puis, ensemencer 1 mL de culture dans 100 mL de milieu de SB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et de la culture à 37 ° C, 220 tr/mn pendant 4 h. Ensuite, transférer 10 mL de la culture dans 1 L de milieu de SB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et de la culture à 37 ° C, 220 tr/mn.<ol>
<li>Préparer le bouillon de super : 3,2 % wt/vol tryptone, extrait de levure 2 % wt/vol, 0,5 % wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lorsque l' OD600 atteint 0,6 - 0,8, ajouter isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,2 mM. Culture à 16 ° C, 180 tr/min pendant 36 à 48 heures pour l’expression périplasmique.</li>
</ol>3. la GPC3-S-Fab périplasmique Purification
<ol><li>Préparation de la fraction périplasmique<ol>
<li>Prélever des cellules par centrifugation à 4 000 x g, 4 ° C pendant 30 min, jeter le milieu et peser les cellules.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules soigneusement dans 4 mL de solution de saccharose glacé (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 25 % (wt/vol) de sucrose et d’EDTA 1 mM) par gramme de cellules et incuber sur la glace pendant 15 minutes.</li>
		<li>Centrifuger à 8 500 g (dessus de table centrifugeuse, rotor de l’angle fixe), 4 ° C pour 20 min. Retirez le surnageant (la fraction de saccharose) et l’enregistrer sur la glace.</li>
		<li>Remettre les boulettes dans un mélange glacé 5 mm de MgCl2 et 1 mM de PMSF (4 mL par gramme de cellules). Ajouter 40 µL de l’action du lysozyme (15 mg/mL) par gramme et incuber sur glace pendant 30 min.</li>
		<li>Centrifuger à 8 500 g (centrifugeuse de dessus de table, fixé le rotor de l’angle), 4 ° C pendant 20 min. transfert le surnageant (la fraction périplasmique) et enregistrez-le sur la glace.</li>
		<li>Combiner la fraction de saccharose et de la fraction périplasmique et centrifuger à 30 000 x g, 4 ° C pour 30 min. Retirez le surnageant et enregistrez-le dans un tube conique de 50 mL sur la glace.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purification d’affinité ni-NTA<ol>
<li>Remettre en suspension 1 mL de Ni-NTA agarose en mélangeant bien pour obtenir une suspension homogène, prélever 1 mL de Ni-NTA agarose dans un tube conique frais 15 mL et ajouter 10 volumes (CV) de colonne un tampon d’équilibration (25 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 1 M de NaCl) s’équilibrer.</li>
		<li>Centrifuger à 400 g pendant 5 min et retirer le liquide surnageant avec précaution. Puis, ajoutez l’agarose de Ni-NTA dans le tube de 50 mL contenant la fraction de saccharose et de la fraction périplasmique. Roche à 4 ° C pendant 2 h.</li>
		<li>Centrifuger le mélange à 400 g, 4 ° C pendant 5 min. Retirer délicatement le surnageant dans un autre tube glacé fraîche comme la fraction libre. Transférer l’agarose de Ni-NTA dans une colonne de gravité.</li>
		<li>Ajouter 10 CV de tampon de lavage (25 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 1 M de NaCl ; 20 mM, 30 mM ou 40 mM de l’imidazole) à la colonne et collecter l’élution comme la fraction de lavage. NOTE : Ces solutions devraient être ajoutées par ordre croissant des concentrations d’imidazol.</li>
		<li>Ajouter 3 CV d’élution de la mémoire tampon (25 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 300 mM de NaCl ; 100 mM, 200 mM, 300 mM ou 400 mM de l’imidazole) à la colonne et de recueillir l’élution fraction d’élution 1, 2, 3 et 4. NOTE : Ces solutions devraient être ajoutées par ordre croissant des concentrations d’imidazol.</li>
		<li>Dialyse les fractions éluées dans 2 L de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4, pH 7,4) utilisez un tuyau de dialyse (12,4 kDa) à 4 ° C pendant 2 h. vérifier la présence de GPC3-S-Fab de 12 % SDS-PAGE et ensuite par Une coloration bleu de Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purification d’affinité igG-CH1<ol>
<li>Transférer 1 mL de résine IgG-CH1 dans un tube conique de 50 mL et laver d’abord les perles avec du PBS. Ensuite, ajouter la solution de dialyse contenant GPC3-S-Fab après l’étape 3.2.6. Roche à 4 ° C pendant 2 h.</li>
		<li>Centrifuger à 400 x g pendant 5 min, 4 ° C. Retirer le surnageant dans un autre tube glacé fraîche soigneusement et transférer la résine dans une colonne de gravité.</li>
		<li>Ajouter 10 CV de lavage tampon (PBS) à la colonne et de recueillir l’élution comme la fraction de lavage.</li>
		<li>Préparer les tubes de prélèvement en ajoutant 1 M Tris pH 9,0 (0,1 mL de chacune des fractions éluées par mL). Éluer avec tampon d’élution 3 CV (0,1 M de glycine-HCl, pH 2,7) et recueillir la fraction éluée ; répéter 3 fois.</li>
		<li>Dialyse les fractions éluées dans 2 L de PBS à l’aide de tubes de dialyse (12,4 kDa) à 4 ° C pendant 2 h. répéter deux fois.</li>
		<li>Déterminer la concentration de protéine par ultramicrospectrophotometer (coefficient d’extinction molaire : 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-PAGE et analyse Western-Blot
<ol><li>Prendre un 10 µL de l’échantillon en 5 x tampon de charge SDS et bien mélanger. Faire bouillir le mélange de protéine à 100 ° C pendant 5 min.<ol>
<li>Préparer 5 x tampon de charge SDS : 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 % wt/vol SDS, 0,5 % wt/vol bleu de bromophénol, 50 % vol/vol glycérol, 5 % vol/vol bêta-mercaptoéthanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un gel SDS-PAGE, avec un chargement gel (5 %) et le gel de séparation (12 %) comme décrit précédemment26,27,28.</li>
	<li>Charger 10 µL du mélange de protéines bouillies et marqueur de protéine et exécuter le SDS-PAGE.</li>
	<li>Souillez le gel en agitant pendant 20 min avec solution bleue de Coomassie brillant et procédez de décoloration.</li>
	<li>Pour éponger occidental, après le transfert sur une membrane de PVDF, bloquer la membrane avec un mélange TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1 % vol/vol Tween 20) + 5 % wt/vol écrémé lait pendant 1 h à température ambiante en agitant.</li>
	<li>Incuber la membrane avec des anticorps primaires (anti-His ou Anti-Flag) dilué 1:2,000 dans un mélange TBST + 5 % de lait écrémé pendant 1 h.</li>
	<li>Laver avec un mélange TBST pendant 5 min à température ambiante et répéter 3 fois.</li>
	<li>Incuber la membrane en 1:2,000 anticorps secondaire (HRP-liée de Fc anticorps anti-souris) dilué dans un mélange TBST + 5 % de lait écrémé pendant 1 h.</li>
	<li>Laver avec un mélange TBST pendant 5 min à température ambiante et répéter 3 fois.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de substrat HPR par film, développer et prendre des photos.</li>
</ol>5. gel Filtration analyse
<ol><li>Utilisez la colonne suivante : volume de la colonne de 24 mL ; Tampon d’équilibration du tampon au phosphate pH 7.4 ; Débit de 0,5 mL/min à la température ambiante ; Volume de l’échantillon de 200 µL.</li>
	<li>Utiliser le volume suivant de protéine et la concentration : 500 µL de 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min et prendre 200 µL à charger.</li>
	<li>Pour la protéine marqueur volume et la concentration, prendre 100 µL du cytochrome C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL d’anhydrase carbonique (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL d’albumine (10 mg/mL, 66 kDa) et 200 µL de l’alcool déshydrogénase (5 mg/mL, 150 kDa) dans un tube. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min et prendre 200 µL à charger.</li>
	<li>Avant chaque course, laver avec au moins 2 CV d’eau distillée à un débit de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Équilibrer la colonne avec au moins 2 CV du tampon d’équilibration (PBS, pH 7,4) à un débit de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Automatiquement injecter l’échantillon à 0,5 mL/min pour charger l’échantillon.</li>
	<li>Éluer avec tampon d’équilibration à 0,5 mL/min et détecter à 280 et 215 nm.</li>
</ol>6. analyse en cytométrie en flux
<ol><li>Culture la HepG2 Hep3B (GPC3 positive), Huh7 (GPC3 positive), (GPC3 positif) et les cellules de la CSMC - 97H (GPC3 négatif) dans les plats en plastique 100 x 20 mm, contenant un milieu DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 µg/mL) et la streptomycine (50 µg/mL) à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Cellules CHO (GPC3 négatif) de la culture et des cellules CHO/GPC3 nourrissait l’ADNc pleine longueur de GPC3 humaine (GPC3 positif) dans des plats en plastique 100 x 20 mm contenant le milieu RPMI 1640 avec 10 % FBS, pénicilline (100 µg/mL) et la streptomycine (50 µg/mL) à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Culture du NK92/CD16 nourrissait l’ADNc pleine longueur de CD16 humaine (CD16 positif) dans le flacon de2 de 25cm contenant le milieu RPMI 1640 avec 10 % FBS, pénicilline (100 µg/mL) et la streptomycine (50 µg/mL) à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Quand les cellules sont jeter confluentes, de 70 à 90 % la moyenne et laver les cellules avec 2 mL de PBS. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2-3 min (ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher de la surface). Ajouter 1 mL de milieu de croissance complète pour neutraliser la trypsine et remettre en suspension les cellules par pipetage doucement verticalement.</li>
	<li>Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer et détecter la viabilité cellulaire par le bleu Trypan.</li>
	<li>Collecter 3 x 106 cellules pour chaque lignée cellulaire. Ajouter 1 mL de PBS + 0,2 % de BSA pour remettre en suspension les cellules. Centrifuger à x 200 g, 4 ° C pendant 5 min. de répéter deux fois.</li>
	<li>Ajouter 0,3 mL de PBS + 0,2 % de BSA pour remettre en suspension les cellules et transférer 100 µL (environ 1 million) dans chaque tube à fond rond 5 mL en polystyrène. Remarque : S’il vous plaît assurez-vous que toutes les mesures d’ici pour les tubes doivent être conservés au froids sur la glace. Lorsque l’anticorps est lier à l’antigène de surface de cellules, le complexe va commencer à assimiler. En le gardant froid, le processus est sensiblement ralenti.</li>
	<li>Ajouter 10 µL d’anticorps primaires (GPC3-S-Fab ou humain IgG1, concentration finale 5 µg/mL) dans chaque tube et incuber sur glace pendant 1 h.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS + 0,2 % de BSA au lavage et centrifuger à x 200 g, 4 ° C pendant 5 min. répéter trois fois.</li>
	<li>Remettre en suspension dans 100 µL de PBS + 0,2 % de BSA, puis ajouter 0,5 µL d’anticorps secondaire (anti-humain IgG(H+L)-488, final concentration de 10 µg/mL) et incuber sur glace pendant 1 h. Remarque : cette étape, s’il vous plaît garder les cellules de la lumière.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS + 0,2 % de BSA au lavage et centrifuger à x 200 g, 4 ° C pendant 5 min. répéter trois fois.</li>
	<li>Analyser les cellules par cytomètre en flux selon le protocole standard29. Acquisition de cellules avec un laser à 488 nm pour l’excitation.</li>
</ol>7. cytotoxiques dosages
<ol><li>Préparer les cellules tumorales.<ol>
<li>La culture HepG2, Hep3B, Huh7, CSMC - 97H et CHO lignées cellulaires comme décrit aux points 6.1 à 6.5.</li>
		<li>Diluer les cellules à 0,5 × 105/ml et plaque 100 µL des cellules (5 000 / puits) sur des plaques de 96 puits. 6-8 h pour permettre à des cellules d’attacher la culture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC).<ol>
<li>Diluer le sang préparé frais avec un volume égal de PBS dans un tube conique de 50 mL. Par exemple, diluer 10 mL de sang avec 10 mL de PBS.</li>
		<li>Prendre 15 mL de milieu de séparation de lymphocytes dans un tube conique frais 50 mL. Transférer le sang dilué sur le milieu de séparation de lymphocytes le long du côté de tube lentement. Remarque : Maintenez le tube vertical. Ne pas casser la surface du milieu de séparation de lymphocytes.</li>
		<li>Centrifuger à 400 g pour 35 min à température ambiante avec le frein.</li>
		<li>Lentement enlever la couche supérieure de plasma et prendre la couche de sang blanc contenant des PBMC à l’interface moyen de séparation plasma-lymphocyte.</li>
		<li>Diluer les PBMC avec un volume double de PBS + 2 % FBS. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois avec du PBS + 2 % FBS. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min. compter le nombre de cellules comme indiqué au point 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les cellules NK.<ol>
<li>Préparer la suspension de PBMC à une concentration de 5 x 107 cellules/mL dans du PBS + 2 % FBS et place dans un tube à fond rond 5 mL en polystyrène.</li>
		<li>Ajouter NK humaine un enrichissement Cocktail à 50 µL/mL de cellules. Bien mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min.</li>
		<li>Remettre les particules magnétiques de la cellule NK kit de l’enrichissement et bien mélanger pour s’assurer qu’ils sont uniformément suspendues en pipettant également, haut et bas vigoureusement plus de 5 fois. Transférer les particules remises en suspension magnétique à 100 µL/mL de la suspension cellulaire. Bien mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Aligner la suspension cellulaire jusqu'à un volume total de 2,5 mL en ajoutant PBS + 2 % FBS. Mélanger les cellules dans le tube de pipetage doucement et descendre de 2 - 3 fois. Placer le tube (sans un bouchon) dans l’aimant. Laisser les billes magnétiques s’installent pour 2,5 min à température ambiante.</li>
		<li>Retirer l’aimant. Dans un mouvement continu, il faut inverser le tube, décanter la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube.</li>
		<li>Compter le nombre de cellules comme indiqué au point 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettre en place la réaction cytotoxique.<ol>
<li>Diluer les cellules NK à 5 × 105 cellules/mL en utilisant le milieu de culture correspondant. Ajouter 100 µL de la suspension de cellules NK les cellules tumorales plaqué sur une plaque à 96 puits.</li>
		<li>Ajouter 10 µL de GPC3-S-Fab à différentes concentrations, avec la dose la plus élevée à une concentration finale de 30 µg/mL, 3 fois dilution, 9 points (trois répétitions).</li>
		<li>Incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 72 h.</li>
		<li>Après 72 h d’incubation, enlever le milieu et ajouter 100 µL de milieu DMEM contenant 10 µL de réactif de CCK8 dans chaque puits en plaques 96 puits et puis incuber à 37 ° C.</li>
		<li>Lire la plaque à 450 nm à 1, 2, 3 et 4 heures après l’ajout du réactif de CCK8.</li>
		<li>Analyser les données. Calculer le taux de survie (DO 450 GPC3-S-Fab + effecteur + tumeur - DO 450 moyen) / (DO 450 tumeur - DO 450 moyen) × 100 % et (DO 450 GPC3-S-Fab + tumeur - DO 450 moyen) / ( tumeur de la DO 450 - DO 450 moyen) × 100 %. Les cellules effectrices sont les cellules NK.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Dans cette étude, nous présentons une stratégie visant à construire un nouveau format de bsAbs, GPC3-S-Fab, qui peut recruter des cellules NK, ciblant les cellules tumorales positif GPC3. Le S-Fab est basé sur la Fab naturel format en ajoutant un anti-CD16 VHH11,12. Par rapport à la région de Fc contenant bsAbs, GPC3-S-Fab peut facilement être produit dans le périplasme des bactéries sur une grande échelle.
À l’aide de la stratégie d’e...

Anticorps monoclonaux sont maintenant largement utilisés pour le traitement de cancer1. En raison de la flexibilité des anticorps, différents formats de base d’anticorps ont été activement explorés. Par rapport aux anticorps monoclonaux, bsAbs présentent deux modules de liaison antigène différent, leur permettant de reconnaître les deux cibles différentes simultanément et efficacement déclenchent le recrutement des cellules effectrices immunitaire afin de cibler et de tuer des cellules de tumeur2.
Les formats actuels de bsAb recombinante peuvent être généralement attribués à deux classes : Fc contenant bsAbs et bsAbs sans une région Fc. Par rapport aux formats contenant des Fc qui sont produites principalement dans les cellules de mammifères, bsAbs sans une région Fc ont les avantages de plus petites tailles, sont plus facilement produits dans des systèmes d’expression micro-organisme et peuvent pénétrer les tissus tumoraux plus efficacement 3.
bsAbs sans une région Fc sont communément formés en reliant les moitiés de liaison individuels, tels que la variables chaîne unique fragments (scFvs) ou Fabs3. Sans les domaines stabilisantes, bsAbs basés sur des fragments de scFv souvent ont compromis la stabilité thermique, faible solubilité ou un risque accru d’agrégation4,5. En revanche, axée sur la Fab bsAbs sont plus stables en raison de l’hétérodimérisation du CH1 et CL dans le fragment Fab natif4,6.
Domaine variable de heavy-chain-seulement anticorps (HHV, aussi appelées anticorps à domaine unique) sont le fragment de liaison de l’antigène actif de chaîne lourde naturels anticorps7. HHV ont les caractéristiques de haute affinité, spécificité des classiques IgG8faible immunogénicité et des rendements élevés en expression bactérienne9. En comparaison avec des fragments de Fv, HHV ont plus élevé de stabilité thermique10. En comparaison avec les fragments Fab, HHV ont des tailles plus petites en raison de l’absence de CH1 et CL. Ainsi, les S-Fab, le format bsAb obtenu en associant la Fab d’un anticorps de domaine unique, VHH, a été conçu et étudié pour ses effets anti-tumoraux11,12.
Dans cette étude, la construction de GPC3-S-Fab en liant la Fab de hGC3313 avec un anti-CD16a VHH14 a été décrite. La GPC3-S-Fab peut être efficacement produit par expression périplasmique chez Escherichia coli (e. coli). Des études fonctionnelles de GPC3-S-Fab a suggéré que la GPC3-S-Fab est une stratégie prometteuse pour le traitement du cancer du foie. Ainsi, les avantages de GPC3-S-Fab sur des techniques alternatives avec références applicables aux études antérieures incluent production facile et purification et bsAbs plus stable.
Systèmes d’expression chez les mammifères et des systèmes d’expression procaryotes ont été utilisés pour exprimer les différents formats de BsAbs. Contrairement aux systèmes d’expression chez les mammifères, e. coli-systèmes d’expression de protéine de base ont beaucoup d’avantages, y compris avec des rendements élevés, faible coûts et allégeant, la facilité des manipulations génétiques et de transformation haute efficacité15. Pour bsAbs expression dans Escherichia coli, il y a deux stratégies de base : expression dans le cytoplasme et l’expression dans le périplasme entre le cytoplasme et la membrane cellulaire externe15. Par rapport à l’environnement réducteur du cytoplasme, le périplasme est un oxydant plus environnement qui favorise le repliement correct et la co-expression de protéines16. Un pliage correct joue un rôle clé dans la solubilité, stabilité et la fonction de génération de bsAbs. Par conséquent, un signal séquence pelB a été ajouté à la N-terminale de la S-Fab pour diriger la sécrétion pour le périplasme des e. coli17. Afin d’assurer bon pliage, solubilité, stabilité thermique et la stabilité conformationnelle, réduisant la complexité et la taille d’un anticorps est fréquemment employé16. Le format S-Fab comprend un Fab et un VHH, qui s’exprime très bien dans les systèmes bactériens probables due à la structure simple et de petite taille.
GPC3 a été choisi dans ce format d’anticorps bispécifiques GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) est un membre de la famille de protéoglycanes héparine sulfate (HS) qui est ancrée à la surface des cellules via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 est surexprimée dans 70 % des cas de hepatocellular carcinoma (HCC), qui représentent la majorité des cancers du foie19,20,21,22. Car GPC3 est rarement exprimée dans les tissus normaux, GPC3 a été proposé comme une cible potentielle pour HCC. Plusieurs souris mAbs ont été produites contre GPC3. Cependant, seulement CG33 présentait l’activité anti-tumorale limitée 22, et il n’a pas à exposer une efficacité clinique chez les patients. Dans cette étude, GPC3-S-Fab s’est avéré être en mesure de recruter les cellules NK pour tuer GPC3 tumeur cellules14.
Pour recruter des cellules NK, anti-CD16 VHH a été utilisé. CD16a est un récepteur de faible affinité IgG, exprimé principalement sur certains sous-types de cellules T, les macrophages, les monocytes et les cellules tueuses naturelles (NK). Il est impliqué dans la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) par NK cellules23. Les cellules NK humains peuvent être classés en deux types, CD56 - CD16 + et CD56 + CD16-. Contrairement aux cellules CD56 + CD16− NK, CD56-cellules NK CD16 + peuvent libérer des niveaux plus élevés de la perforine et granzyme B et donc présenter une forte cytotoxicité24. Des cellules de Kupffer (KCs), exprimant les CD16a, sont les macrophages résidents dans le foie. Des cellules de Kupffer jouent un rôle important dans la répression d’un cancer du foie,25. Ainsi, bsAbs CD16a de ciblage peut être une stratégie plus prometteuse que se livrer à des lymphocytes T contre le cancer du foie.

<table><tbody><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre ultraviolet</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Appareil analytique d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide</td><td>Mini-PROTEAN&reg ; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Appareil Trans-blot</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td> Système d’imagerie Bio-rad <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Chromatogramme liquide</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision lecteur de plaques</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain (H& L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris IgG lié à HRP</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’affinité IgG-CH1</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’enrichissement de cellules NK</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Marqueur standard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Filtration sur gel</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td><td>Produits chimiques VWR</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td> Extrait de levure <td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique anhydre (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium, dibasique, anhydre (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bleu Brillant R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm plat en plastique</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flacon</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 puits grappe de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>la Collection de Culture Type de l’Académie des Sciences de Chine</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>la Collection de Culture de Type de l’Académie des Sciences de Chine</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>la Collection de Culture de Type de l’Académie des Sciences</td><td>de Chine TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>la Collection de Culture de Type de l’Académie des Sciences de Chine</td><td>TCHu182</td><td></td>Hep3B</tr><tr><td></td><td>la collection de culture type de l’Académie chinoise des sciences</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

un ciblage gpc3 anticorps bispécifiques, gpc3-s-fab, avec puissante cytotoxicité

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Ce protocole décrit la construction et des études fonctionnelles d’un anticorps bispécifiques (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs peut reconnaître deux épitopes différents par le biais de leurs deux armes différentes. bsAbs ont été activement étudiées pour leur capacité à recruter directement des cellules immunitaires pour tuer les cellules tumorales. Actuellement, la plupart des bsAbs est produite sous forme de protéines recombinantes, soit comme contenant du Fc bsAbs ou comme petits bsAb dérivées sans la région Fc. Dans cette étude, GPC3-S-Fab, un anticorps bispécifiques base d’anticorps fragment (Fab), a été conçu en associant la Fab d’anticorps anti-GPC3 CG33 avec anticorps anti-CD16 domaine unique. La GPC3-S-Fab peut être exprimé chez Escherichia coli et purifié par chromatographie d’affinité deux. La GPC3-S-Fab purifié peut se lient à spécifiquement et tuent les cellules de cancer du foie positive GPC3 en recrutant des cellules tueuses naturelles, suggérant une application potentielle de GPC3-S-Fab dans le traitement du cancer du foie.

Purification de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab a été purifiée d’e. coli par une purification d’affinité en deux étapes, tout d’abord avec Ni-NTA-agarose, suivie de la purification d’affinité IgG-CH1. Après la purification d’affinité en deux étapes, GPC3-S-Fab a été purifiée jusqu'à homogénéité avec les deux chaînes proche de 1:1 (Figure 2 a). La présence de polypeptides fois VHH VH-...

Nous présentons ici un protocole pour produire un anticorps bispécifiques GPC3-S-Fab dans Escherichia coli. La GPC3-S-Fab purifié a puissante cytotoxicité contre les cellules de cancer du foie positive GPC3.

Un ciblage GPC3 anticorps bispécifiques, GPC3-S-Fab, avec puissante cytotoxicité

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des anticorps bispécifiques, telles que la production d’un anticorps bispécifique chez les bactéries et la détermination de la fonction de l’anticorps purifié. Le principal avantage de cette technique est que GPC3-S-Fab peut être facilement produit et purifié à partir d’E. coli. Pour préparer la fraction périplasmique, centrifugez d’abord la suspension cellulaire à 4 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, expulsez le milieu et pesez les cellules. Après la centrifugation, dissoudre la pastille cellulaire dans quatre millilitres de solution de saccharose glacée pour chaque gramme de cellules. Incuber la suspension cellulaire sur de la glace pendant 15 minutes.Après 15 minutes, centrifugez la suspension cellulaire à 8 500 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, pipetez le surnageant contenant la fraction saccharose et stockez-le sur de la glace. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans un mélange glacé de chlorure de magnésium de cinq millimolaires et de PMSF d’un millimolaire.Ensuite, ajoutez 40 microlitres de 15 milligrammes par millilitre de stock de lysosome dans la suspension cellulaire. Après avoir ajouté le stock de lysosomes, laissez la suspension cellulaire sur de la glace pendant 30 minutes. Une fois la période d’incubation terminée, combinez le saccharose et les fractions périplasmiques.Ensuite, centrifugez la fraction saccharose-périplasmique à 30 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois la centrifugation terminée, transférez le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Ensuite, mélangez et remettez en suspension un millilitre d’agarose nickel-NTA avec le surnageant pour obtenir une suspension homogène, puis un millilitre d’agarose nickel-NTA dans un tube conique frais de 15 millilitres.À l’agarose, ajoutez 10 volumes de colonne de tampon d’équilibration. Ensuite, centrifugez l’agarose à 400 g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirer soigneusement le surnageant et ajouter l’agarose nickel-NTA à la fraction saccharose-périplasmique.Ensuite, balancez le tube contenant une fraction saccharose-périplasmique à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Encore une fois, centrifugez le mélange. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant dans un tube frais et glacé, car il s’agit de la fraction non liée.Une fois le surnageant transféré, ajoutez l’agarose nickel-NTA dans la colonne de gravité. Ensuite, ajoutez trois volumes de colonne de tampon d’élution à la colonne. Ensuite, collectez l’éluat sous forme de fractions d’élution un, deux, trois et quatre, respectivement.Diluez et ensemencez 5 000 cellules dans 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures pour la fixation. Pour préparer les PBMC, diluez d’abord le sang fraîchement préparé avec un volume égal de solution saline tamponnée au phosphate dans un tube conique de 50 millilitres.Pipette 15 millilitres de milieu de séparation des lymphocytes dans un tube conique frais de 50 millilitres. Ensuite, transférez soigneusement le sang dilué le long des parois du tube vers le milieu de séparation des lymphocytes. Centrifugez les cellules à 400 g pendant 35 minutes à température ambiante avec les freins desserrés.Après la centrifugation, retirez soigneusement la couche supérieure de plasma. Diluez ces PBMC obtenus avec le double du volume de solution saline tamponnée au phosphate avec 2 % de sérum bovin fœtal.Ensuite, centrifugez la suspension PBMC. Lavez la pastille cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 2 % de sérum de veau fœtal, puis centrifugez-la à nouveau. Après la centrifugation, comptez le numéro de cellule.Pour préparer les cellules tueuses naturelles, reconstituez les PBMC dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 2 % de solution saline bovine fœtale. Ensuite, transférez le mélange dans un tube à fond rond en polystyrène. Ajoutez 50 microlitres par millilitre de cocktail d’enrichissement en cellules tueuses naturelles au mélange PBMC.Mélangez le contenu et laissez le tube pendant 10 minutes. Ensuite, remettez en suspension et mélangez les particules magnétiques présentes dans le cocktail d’enrichissement en pipetant plusieurs fois, de sorte que les particules soient uniformément en suspension. Ensuite, ajoutez 100 microlitres par millilitre de particules magnétiques à la suspension cellulaire.Mélangez les particules magnétiques en suspension cellulaire et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Après cinq minutes, ajoutez 2,5 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate avec 2 % de sérum bovin fœtal à la suspension cellulaire. Pipetez doucement deux à trois fois pour mélanger les cellules du tube.Placez le tube sur l’aimant et laissez les billes magnétiques se déposer pendant 2,5 minutes à température ambiante. Ensuite, d’un seul coup d’action, retournez le tube et versez la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube. Encore une fois, comptez le nombre de cellules.Une fois le comptage terminé, diluez les cellules tueuses naturelles dans le milieu de culture. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire aux cellules tumorales plaquées dans une plaque à 96 puits. Pour mettre en place les tests de cytotoxicité, ajoutez 10 microlitres de concentrations variables d’anticorps GPC3-S-Fab sur la plaque à 96 puits.Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Après le temps d’incubation désigné, aspirez le milieu. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu DMEM contenant 10 microlitres de réactif CCK dans chaque puits de la plaque à 96 puits.Encore une fois, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, lire la plaque à 450 nanomètres toutes les heures consécutives jusqu’à quatre heures après l’ajout du réactif CCK8. L’anticorps GPC3-S-Fab est purifié à l’aide d’une purification par affinité en deux étapes.Ici, les deux panneaux montrent que l’anticorps est purifié à l’aide de l’agarose nickel-NTA et des colonnes de purification d’affinité IgG-CH1, respectivement. Ensuite, l’affinité de liaison de l’anticorps GPC3-S-Fab est évaluée à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses positives et négatives à GPC3. Le GPC3-S-Fab se lie à toutes les cellules GPC3-positives, telles que Hep3B, Huh7, Hep2G et CHO/GPC3.Il est intéressant de noter qu’aucune liaison ou une liaison minimale n’est observée lorsque des cellules GPC3-négatives, telles que MHCC-97H et CHO, sont utilisées. La cytotoxicité du GPC3-S-Fab est également étudiée en présence des cellules tumorales incubées avec des cellules tueuses naturelles fraîches. L’anticorps GPC3-S-Fab provoque une forte cytotoxicité contre les cellules HepG2, Hep3B et Huh7 de manière dose-dépendante en présence des cellules tueuses naturelles.Cependant, aucune cytotoxicité de ce type n’est observée en l’absence de cellules tueuses naturelles sur les cellules MHCC-97H. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures, si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les marches sur la glace.Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la modélisation de xénogreffes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme dans l’effet tumoral in vivo. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des anticorps bispécifiques pour explorer les effets antitumoraux in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un anticorps bispécifique fonctionnel ciblant les cellules tumorales, en particulier l’isolement des cellules NK.

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Éliminer des cellules spécifiques sans endommager d’autres cellules est extrêmement difficile, en particulier dans les tissus établis, mais il existe un besoin urgent d’une méthode d’élimination cellulaire dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Ici, nous présentons une méthode d’élimination cellulaire spécifique à partir d’une culture cellulaire 3D mixte en utilisant la photoimmunothérapie proche infrarouge (NIR-PIT).

Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

Nous décrivons un système d'essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d'autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.

Un analyse de puissance en temps réel pour les cellules T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules cancéreuses solides et hématologiques

Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation d'un homo-PROTAC bifonctionnel à base de pomalidomide comme une nouvelle approche pour induire l'ubiquitination et la dégradation du cereblon de ligase d'ubiquitine E3 (CRBN), la cible des analogues de la thalidomide.

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Le développement d'une conjugaison bifonctionnelle de peptide antigénique et de mimétique Fc-III (DCAF) est nouveau pour l'élimination des anticorps nocifs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse de la molécule DCAF1, qui peut bloquer sélectivement l'anticorps 4G2 pour éliminer l'effet d'amélioration dépendant des anticorps pendant l'infection de virus de dengue.

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Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Ici, nous décrivons une méthode de transduction des lymphocytes T humains avec de la luciférase pour faciliter le suivi in vivo du trafic de lymphocytes T induit par les anticorps bispécifiques vers les tumeurs dans des études visant à évaluer l’efficacité antitumorale et le mécanisme des anticorps bispécifiques engageant les lymphocytes T.

Suivi du trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques à l’aide de lymphocytes T humains transduits par la luciférase

Ce protocole présente une technique automatisée à haut débit basée sur l’image pour identifier les composés modulant la destruction des cellules cancéreuses du sein médiée par les cellules tueuses naturelles en présence d’un anticorps thérapeutique anti-HER-2.

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Ici, nous présentons une méthode pour identifier les composés qui modulent le mécanisme ADCC, un mécanisme important de destruction des cellules cancéreuses des anticorps antitumoraux. L’effet cytotoxique des cellules NK est mesuré dans les sphéroïdes des cellules cancéreuses du sein en présence de trastuzumab. L’analyse d’images permet d’identifier les cellules tueuses et cibles vivantes et mortes dans les sphéroïdes.

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Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

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Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Découvrez la production de l'anticorps bispécifique GPC3-S-Fab dans Escherichia coli pour la recherche sur le cancer du foie. Cette méthode permet d'obtenir une cytotoxicité puissante contre les cellules tumorales GPC3+.

Un ciblage GPC3 anticorps bispécifiques, GPC3-S-Fab, avec puissante cytotoxicité

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