Name: A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Apprenez à préparer des oligomères Aβ et à évaluer leurs quantités par analyse dot blot. Cette méthode simple et reproductible est essentielle pour la recherche neuropharmacologique sur les maladies neurodégénératives.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Natural Science Fondation nationale de Chine (U1503223, 81673407, 21475131), le projet de recherche appliquée sur la technologie sans but lucratif de la Province de Zhejiang (2016C 37110), Ningbo International des sciences et technologie Projet de coopération (2014D 10019), l’équipe d’Innovation municipale de Ningbo de sciences de la vie et de la santé (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech Project for Common Wealth (2017C 50042), la somme de Li Dak Yip Yio Chin Kenneth Li Marine fonds de développement de la biopharmaceutique, et le Fonds de K. C. Wong Magna à l’Université de Ningbo.

1. préparation de la solution
Remarque : Consultez la Table des matières pour les sources de réactif.
<ol><li>Préparer une solution de 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) en ajoutant 5 g de BSA à 100 mL d’eau bidistillée. Mélangez-les complètement au vortex eux. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	<li>Préparer une solution de A11 des anticorps anti-oligomère (1:1, 000) en ajoutant 10 µL de solution d’anticorps à 10 mL de la solution de BSA de 5 %. Mélangez-les complètement au vortex eux. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	<li>Préparer une solution de 6E10 d’anticorps anti-bêta-amyloïdes (1:1, 000) en ajoutant 10 µL de solution d’anticorps à 10 mL de solution de BSA de 5 %. Mélangez-les complètement au vortex. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	<li>Préparer une solution OC d’anticorps anti-fibrillaire oligomère (1:1, 000) en ajoutant 10 µL de solution d’anticorps à 10 mL de solution de BSA de 5 %. Mélangez-les complètement au vortex. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	<li>Préparer une Tris-buffered saline (SCT) solution en ajoutant 24 g de base Tris et 88 g de NaCl à 1 000 mL d’eau bidistillée. Ajuster le pH à 7,4. Conserver la solution à 4 ° C pendant 3 mois.</li>
	<li>Préparer une solution de Tween-20 (TBST) et un tampon Tris salin en ajoutant 1 mL de Tween-20 à 100 mL du SCT stock solution et 900 mL d’eau bidistillée.</li>
	<li>Préparer une solution d’anticorps secondaire en ajoutant 10 µL de raifort peroxydase de raifort (HRP) chèvre anti-lapin IgG (H + L) à 10 mL de solution TBST. Mélangez-les complètement au vortex eux. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	<li>Dissoudre 3,68 g de curcumine dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour former une solution stock de curcumine de 10 mM.</li>
	<li>Dissoudre 5 mg de synthétique Aβ1-42 dans 2 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour former une solution de monomère de bêta-amyloïdes de 2,5 mg/mL. Mettre à température ambiante (25 ° C) pendant 20 min. faire 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C jusqu'à 6 mois. Remarque : Cette procédure doit être exécutée aussi vite que possible. Il faut couper les pointes de pipette pour s’assurer de pipetage précis.</li>
	<li>Préparer le liquide par électrochimiluminescence (ECL) en mélangeant ECL fluide A et B avec un rapport de volume de 1:1. Cette solution doit être préparée juste avant utilisation.</li>
</ol>2. préparation de l’échantillon
Remarque : Effectuez la préparation de l’échantillon 2 jours avant le dot blot analyse.
<ol><li>Ajouter 900 µL d’eau bidistillée à un tube de solution de monomère Aβ1-42 ; la concentration de bêta-amyloïdes1-42 soit 0,25 mg/mL. Placer le mélange à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Faire évaporer la solution à l’azote de haute pureté jusqu'à ce que son volume est d’environ 850 µL. La concentration de la solution de1-42 Aβ sera environ 0,29 mg/mL. Remarque : La solution doit être secouée de temps en temps pour assurer que le HFIP est complètement évaporé. Normalement, après 30 min d’évaporation, le volume de la solution résiduelle est environ 850 µL.</li>
	<li>Diluer la solution mère de curcumine à une solution de travail de curcumine (0,2 à 2 µM) avec de l’eau bidistillée. Mélanger la solution1-42Aβ et curcumine solution avec un rapport 1:1 volume de travail. Les concentrations finales de curcumine sera de 0,1 à 1 µM. NOTE : Les inhibiteurs potentiels d’oligomère peuvent être mélangés avec la solution1-42 de bêta-amyloïdes dans n’importe quel rapport si nécessaire.</li>
	<li>Agiter la solution en permanence dans un agitateur magnétique (voir Table des matières).<ol>
<li>Fixer un boîtier séparateur en plastique à l’agitateur magnétique. Place 2 magnétique remuer des barres à 2 coins de la boîte et placer les tubes à échantillon au centre de la boîte.</li>
		<li>Secouer la boîte à température ambiante (25 ° C) pendant 48 h. Remarque : La vitesse de l’agitateur magnétique est environ 60 t/mn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger les tubes pendant 15 min à 4 ° C et 18 000 x g. récupérer le surnageant.</li>
</ol>3. dot blot Analysis
Remarque : Tous les incubations sont effectuées sur un agitateur horizontal.
<ol><li>Couper une membrane de nitrocellulose en bandes larges de 1 cm. NOTE : La largeur de la membrane de nitrocellulose peut être ajustée selon les besoins expérimentaux.</li>
	<li>Placer 2 µL échantillons uniformément sur 2 bandes (bande 1 et 2) avec chaque intervalle de point à 0,5 cm.</li>
	<li>Placer les bandes à température ambiante pendant 5 min jusqu'à ce que la goutte sur la bande est sec.</li>
	<li>Incuber les bandes avec une solution de BSA de 5 % pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les bandes avec une solution TBST pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer la solution TBST. Pendant 1 h à température ambiante, incuber 1 la bande avec un anticorps anti-oligomère solution A11 et bande 2 avec une solution de 6E10 d’anticorps anti-bêta-amyloïdes.</li>
	<li>Rincer les bandes avec une solution TBST trois fois, chaque fois pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer la solution TBST. Incuber les bandes avec une solution d’anticorps secondaire pendant 40 min à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les bandes avec une solution TBST trois fois, chaque fois pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Appliquer uniformément le fluide ECL mixte à la surface des bandes. Exposer les bandes dans une système d’imagerie de la chimiluminescence automatique (voir Table des matières). Remarque : Normalement, 300 µL de liquide ECL est suffisant pour une des membranes. La membrane doit être maintenue humide pendant l’exposition. Le temps d’exposition est calculé automatiquement par le système d’imagerie.</li>
	<li>Faites une analyse de niveaux de gris en utilisant ImageJ (National Institutes of Health) ou un autre logiciel de traitement d’image pour obtenir des résultats semi-quantitatifs.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous avons rapporté une méthode pour préparer les échantillons contenant des oligomères Aβ1-42 et analyser les montants de l’oligomère1-42 Aβ A11-positif par une dot blot analyse. Bien que nos méthodes pour la préparation des échantillons de riche en oligomères bêta-amyloïdes1-42 sont assez simples, fiables et reproductibles, il y a encore quelques points pour être remarqué. Tout d’abord, HFIP est utilisée pour dissoudre synthétique peptide Aβ1-42 . Un peptid...

La maladie d’Alzheimer (ma) est l’une des plus importantes maladies neurodégénératives touchant les personnes âgées dans le monde1. Il est largement admis que l’agrégation anormale de la protéine β-amyloïde (Aß) peut être le principal facteur pathologique d’AD. Agrégats de bêta-amyloïdes sont les principaux composants des plaques séniles, un des marqueurs biologiques dans le cerveau des patients atteints de ma. En outre, agrégats de bêta-amyloïdes, notamment les oligomères provoquent une neurotoxicité puissante, qui pourrait être la cause de la mort neuronale au fur et AD. Par conséquent, l’inhibition de la formation d’oligomères bêta-amyloïdes pourrait empêcher la neurodégénérescence et inhibiteurs d’oligomères bêta-amyloïdes pourraient être développés comme modificateurs traitements d’AD. De nombreuses études ont utilisé un peptide Aβ synthétique pour former des oligomères in vitro, explorer des morphologies et des structures artificielles oligomères bêta-amyloïdes et enquêter sur les inhibiteurs de l’oligomère Aβ utilisant in vitro modèles2,3 , 4. Toutefois, différentes en vitro protocoles de formation d’oligomères bêta-amyloïdes pourraient entraîner oligomère présentant des caractéristiques morphologiques différentes, qui peut entraîner des résultats incomparables entre les différents groupes de recherche. Par conséquent, un protocole standard de formation d’oligomères bêta-amyloïdes est absolument nécessaire.
Jusqu'à présent, pas beaucoup de méthodes ont été signalés à détecter directement les oligomères bêta-amyloïdes. Microscopie électronique à transmission (TEM), non-dénaturisation électrophorèse sur gel, immuno enzymatique (ELISA) et dot blot analyse permet d’examiner la quantité et/ou la morphologie des oligomères bêta-amyloïdes in vitro5, 6. par exemple, la morphologie et la structure de l’oligomère Aβ peuvent être observées en TEM. Les quantités relatives et la taille moléculaire des agrégations d’Aβ pouvaient être mesurés par électrophorèse sur gel non dénaturant. ELISA peut servir à déterminer des oligomères bêta-amyloïdes dans le sérum, le plasma et des extraits de tissus cérébraux. Enfin, dot blot analyse, une technique utilisée pour la détection, analyse et identification des protéines, pourrait servir à évaluer la concentration relative des oligomères bêta-amyloïdes dans différents échantillons à l’aide d’anticorps spécifiques Aβ et oligomère. En outre, une dot blot assay offre gain de temps considérable, comme l’électrophorèse sur gel et les procédures de transfert pour les gels ne sont pas nécessaires. Par conséquent, cette analyse permet normalement d’écran Aβ oligomère des inhibiteurs potentiels. L’objectif général du présent protocole est de décrire une méthode relativement simple, fiable et reproductible pour préparer un échantillon de la riche en oligomères bêta-amyloïdes1-42 , pour analyser les montants de l’oligomère1-42 Aβ par dot blot analyse et oligomère Aβ écran inhibiteurs à l’aide des résultats expérimentaux semi-quantitative.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb aux oligomères amyloïdes)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (bêta-amyloïde lapin Ab)</td><td>Cellule&nbsp ; Technologie de signalisation</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anticorps anti-fibrilles amyloïdes OC)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de la peroxydase de raifort (HRP) Chèvre anti lapin IgG (H+L)&nbsp ;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&beta ; 1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumine</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumine Bovine V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Diméthylsulfoxyde Solarbio</td><td></td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5& fois ; gel non dénaturant PAGE Marqueur protéique</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Membrane buvard en nitrocellulose pure</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Gamme super basse&nbsp ; Marqueur protéique</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Membranes de transfert</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Solution de coloration rapide</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>Tous - système d’imagerie automatique par chimiluminescence</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Instituts de santé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’images</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de dot blot analysis

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β-amyloïde (Aß) est un peptide hydrophobe avec une tendance intrinsèque de s’auto-assembler en agrégats. Parmi les divers agrégats, oligomères bêta-amyloïdes est largement reconnue comme la neurotoxine de premier plan dans la progression de la maladie d’Alzheimer (ma) et est considéré comme l’événement crucial dans la pathogenèse de la ma. Par conséquent, Aβ oligomère inhibiteurs pourraient empêcher la neurodégénérescence et ont le potentiel d’être développé comme modificateurs traitements d’AD. Cependant, protocoles différents formation d’oligomères bêta-amyloïdes pourraient conduire à des oligomères présentant des caractéristiques différentes. En outre, il n’y a pas beaucoup de méthodes pour efficacement écran Aβ1-42 oligomère inhibiteurs. Un anticorps A11 peut réagir avec un sous-ensemble de l’oligomère de1-42 Aß toxique avec des structures de feuillet β antiparallèle. Dans ce protocole, nous décrivons comment préparer un échantillon de riche en oligomères Aβ A11-positif1-42 d’un synthétique Aβ1-42 peptide de vitro et d’évaluer les quantités relatives de l’oligomère1-42 Aβ A11-positives dans les échantillons en une dot-blot analyse à l’aide de l’A11 et Aβ1-42-anticorps 6E10 spécifiques. Utilisant ce protocole, inhibiteurs de l’oligomère1-42 Aβ A11-positif peuvent également projetés de résultats expérimentaux semi-quantitative.

Afin de vérifier si un monomère1-42 de bêta-amyloïdes peut former un oligomère de1-42 Aβ après préparation, analyse TEM a été utilisée. Aucun agrégat visibles ont été observées dans l’échantillon de monomère Aβ HFIP-dissous1-42 (Figure 1A). En outre, les agrégats principalement globulaires avec un diamètre de près de 10 à 80 nm ont été observées dans l’échantillon de1-42 Aβ après 48 h de secouer, su...

Ce protocole décrit comment préparer des oligomères bêta-amyloïdes d’un peptide synthétique in vitro et d’évaluer les quantités relatives des oligomères bêta-amyloïdes par une dot blot analyse.

A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuropharmacologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, fiable et reproductible pour former un oligomère bêta-amyloïde. Nous montrons que la démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation du bêta-oligomère sont difficiles à apprendre.Tout d’abord, ajustez la concentration de la solution de monomère A-bêta à 0,25 milligramme par millilitre en ajoutant 900 microlitres d’eau doublement distillée dans le tube. Continuez ensuite à évaporer la solution de monomère avec de l’azote gazeux de haute pureté jusqu’à ce que le volume atteigne environ 850 microlitres avec une concentration d’environ 0,29 milligramme par millilitre. La présence de HR5P affecte la formation de l’oligomère A-bêta.Par conséquent, l’évaporation autant que possible est une étape critique de cette procédure. Ensuite, utilisez de l’eau doublement distillée pour diluer la solution mère de curcumine afin de préparer une solution de travail de 0,2 et deux micromolaires. Maintenez un rapport de un à un et mélangez la solution A-bêta avec de la curcumine pour obtenir la concentration finale de curcumine à 0,1 et une micromolaire.Ensuite, laissez la solution sur un agitateur magnétique. Fixez une boîte de séparation en plastique à l’agitateur magnétique. Positionnez deux barres d’agitation magnétiques aux deux coins de la boîte, puis placez les tubes contenant les échantillons au centre de la boîte.Continuez à agiter la boîte à température ambiante pendant 48 heures à 60 tours par minute, puis centrifugez le tube à 18 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, récupérez le surnageant. Pour l’analyse par transfert de points, prenez une membrane de nitrocellulose et coupez-la en bandes d’un centimètre de large, puis placez deux microlitres de l’échantillon uniformément sur les bandes un et deux avec chaque intervalle de points à 0,5 centimètre.Lors de l’injection de l’échantillon sur la membrane, il est nécessaire de l’étaler uniformément et les différentes gouttelettes sont contrôlées afin que les différents échantillons ne soient pas liés entre eux. Ensuite, incubez les bandes à température ambiante pendant cinq minutes pour que les gouttelettes sèchent. Après cinq minutes, incubez les bandelettes avec 5 % d’albumine sérique bovine pendant 30 minutes à température ambiante.Une fois l’incubation terminée, lavez les bandelettes avec un tampon TBST pendant cinq minutes. Aspirez le tampon une fois le lavage terminé, puis incubez la bandelette une avec l’anticorps anti-oligomère A11 et la bandelette deux avec la solution d’anticorps anti-A-bêta 6E10 pendant une heure. Au bout d’une heure, lavez les bandelettes avec du TBST pendant cinq minutes chacune trois fois, puis aspirez le tampon et incubez les bandelettes avec une solution d’anticorps secondaire pendant 40 minutes.Après l’incubation secondaire de l’anticorps, lavez à nouveau les bandelettes avec du TBST pendant cinq minutes toutes les trois fois. Ensuite, ajoutez environ 300 microlitres de liquide ECL mélangé à la surface des bandes humides, puis exposez les bandes dans un système d’imagerie par chimiluminescence automatique. Les études TEM montrent l’absence d’agrégats visibles dans la solution de monomères A-bêta dissous par HFIP, mais après 48 heures d’incubation, les mêmes monomères forment des oligomères, qui sont principalement des agrégats globulaires d’un diamètre de 10 à 80 nanomètres.En soumettant les échantillons de monomères A-bêta et riches en oligomères à l’analyse par transfert de points, on montre la présence d’oligomères A-bêta positifs A11 dans des échantillons riches en oligomères A-bêta. Il est intéressant de noter que les peptides A-bêta positifs A-bêta 6E10 sont présents à la fois dans le monomère A-bêta et dans les échantillons riches en oligomères. Ensuite, une analyse semi-quantitative est également effectuée pour exprimer les échantillons spécifiques de monomère A-bêta positif et d’oligomères positifs en pourcentage du contrôle.Les peptides A-bêta positifs A11 sont significativement plus élevés dans les échantillons riches en oligomères A-bêta par rapport aux monomères. Au contraire, le peptide A-bêta positif A-bêta 6E10 est présent à la fois dans les échantillons riches en monomères et en oligomères. En fait, les oligomères A-bêta sont également co-incubés avec la curcumine et l’inhibiteur d’oligomères A-bêta.La curcumine entraîne une réduction significative de la quantité relative d’oligomères A-bêta positifs A11 avec une diminution de la coloration A11 dans les échantillons d’oligomères A-bêta co-incubés de curcumine. Cependant, des concentrations variables de curcumine n’affectent pas le nombre de peptides A-bêta dans les échantillons positifs 6E10 monomères et riches en oligomères par rapport aux échantillons A11 positifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est bien exécutée.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer des candidats médicaments pour des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de l’oligomère A-bêta et de l’évaluation de sa quantité.

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Sélection d&#39;aptamères pour amyloïde β-protéine, l&#39;agent causal de la maladie d&#39;Alzheimer

Cette vidéo montre la séparation par électrophorèse des fibres amyloïdes basée sur l’électrophorèse du gel d’agarose semi-dénaturant bidimensionnelle. La technique sépare les agrégats amyloïdes polymorphes en fonction de leur taille hétérogène.

Électrophorèse bidimensionnelle semi-dénaturante sur gel d’agarose : une technique pour séparer les fibres amyloïdes polymorphes en fonction de l’hétérogénéité de taille

Les protéines peuvent soit adopter une structure native, soit se replier en amyloïde insoluble. Les conditions qui favorisent la voie de mauvais repliement conduisent à la formation de différents types de fibrilles amyloïdes. Les méthodes décrites ici permettent une conversion rapide des protéines natives en amyloïde in vitro.

Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro

En utilisant la microscopie à force atomique en combinaison avec la technologie de biopanning, nous avons créé un système de biopanning négatif et positif pour acquérir des anticorps contre les variantes de protéines spécifiques à la maladie présentes dans n’importe quel matériel biologique, même à de faibles concentrations.  Nous avons réussi à obtenir des anticorps dirigés contre des variantes de la protéine TDP-43 impliquées dans la sclérose latérale amyotrophique.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Méthodes simples sont décrits pour démontrer la production des cytotoxiques amyloïdes suite à une infection de l’endothélium pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa.

Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Un protocole détaillé pour la purification et l'analyse suivante d'un anticorps monoclonal du fluide de culture cellulaire récolté (HCCF) des microbioréacteurs automatisés a été décrit. L'utilisation de l'analyse pour déterminer les attributs de qualité critiques (CqA) et la maximisation du volume limité de l'échantillon pour extraire des informations vitales sont également présentées.

Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

Apprenez à préparer des oligomères Aβ et à évaluer leurs quantités par analyse dot blot. Cette méthode simple et reproductible est essentielle pour la recherche neuropharmacologique sur les maladies neurodégénératives.

A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis

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