A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuropharmacologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, fiable et reproductible pour former un oligomère bêta-amyloïde. Nous montrons que la démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation du bêta-oligomère sont difficiles à apprendre.

Tout d’abord, ajustez la concentration de la solution de monomère A-bêta à 0,25 milligramme par millilitre en ajoutant 900 microlitres d’eau doublement distillée dans le tube. Continuez ensuite à évaporer la solution de monomère avec de l’azote gazeux de haute pureté jusqu’à ce que le volume atteigne environ 850 microlitres avec une concentration d’environ 0,29 milligramme par millilitre. La présence de HR5P affecte la formation de l’oligomère A-bêta.

Par conséquent, l’évaporation autant que possible est une étape critique de cette procédure. Ensuite, utilisez de l’eau doublement distillée pour diluer la solution mère de curcumine afin de préparer une solution de travail de 0,2 et deux micromolaires. Maintenez un rapport de un à un et mélangez la solution A-bêta avec de la curcumine pour obtenir la concentration finale de curcumine à 0,1 et une micromolaire.

Ensuite, laissez la solution sur un agitateur magnétique. Fixez une boîte de séparation en plastique à l’agitateur magnétique. Positionnez deux barres d’agitation magnétiques aux deux coins de la boîte, puis placez les tubes contenant les échantillons au centre de la boîte.

Continuez à agiter la boîte à température ambiante pendant 48 heures à 60 tours par minute, puis centrifugez le tube à 18 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, récupérez le surnageant. Pour l’analyse par transfert de points, prenez une membrane de nitrocellulose et coupez-la en bandes d’un centimètre de large, puis placez deux microlitres de l’échantillon uniformément sur les bandes un et deux avec chaque intervalle de points à 0,5 centimètre.

Lors de l’injection de l’échantillon sur la membrane, il est nécessaire de l’étaler uniformément et les différentes gouttelettes sont contrôlées afin que les différents échantillons ne soient pas liés entre eux. Ensuite, incubez les bandes à température ambiante pendant cinq minutes pour que les gouttelettes sèchent. Après cinq minutes, incubez les bandelettes avec 5 % d’albumine sérique bovine pendant 30 minutes à température ambiante.

Une fois l’incubation terminée, lavez les bandelettes avec un tampon TBST pendant cinq minutes. Aspirez le tampon une fois le lavage terminé, puis incubez la bandelette une avec l’anticorps anti-oligomère A11 et la bandelette deux avec la solution d’anticorps anti-A-bêta 6E10 pendant une heure. Au bout d’une heure, lavez les bandelettes avec du TBST pendant cinq minutes chacune trois fois, puis aspirez le tampon et incubez les bandelettes avec une solution d’anticorps secondaire pendant 40 minutes.

Après l’incubation secondaire de l’anticorps, lavez à nouveau les bandelettes avec du TBST pendant cinq minutes toutes les trois fois. Ensuite, ajoutez environ 300 microlitres de liquide ECL mélangé à la surface des bandes humides, puis exposez les bandes dans un système d’imagerie par chimiluminescence automatique. Les études TEM montrent l’absence d’agrégats visibles dans la solution de monomères A-bêta dissous par HFIP, mais après 48 heures d’incubation, les mêmes monomères forment des oligomères, qui sont principalement des agrégats globulaires d’un diamètre de 10 à 80 nanomètres.

En soumettant les échantillons de monomères A-bêta et riches en oligomères à l’analyse par transfert de points, on montre la présence d’oligomères A-bêta positifs A11 dans des échantillons riches en oligomères A-bêta. Il est intéressant de noter que les peptides A-bêta positifs A-bêta 6E10 sont présents à la fois dans le monomère A-bêta et dans les échantillons riches en oligomères. Ensuite, une analyse semi-quantitative est également effectuée pour exprimer les échantillons spécifiques de monomère A-bêta positif et d’oligomères positifs en pourcentage du contrôle.

peptides A-bêta positifs A11 sont significativement plus élevés dans les échantillons riches en oligomères A-bêta par rapport aux monomères. Au contraire, le peptide A-bêta positif A-bêta 6E10 est présent à la fois dans les échantillons riches en monomères et en oligomères. En fait, les oligomères A-bêta sont également co-incubés avec la curcumine et l’inhibiteur d’oligomères A-bêta.

La curcumine entraîne une réduction significative de la quantité relative d’oligomères A-bêta positifs A11 avec une diminution de la coloration A11 dans les échantillons d’oligomères A-bêta co-incubés de curcumine. Cependant, des concentrations variables de curcumine n’affectent pas le nombre de peptides A-bêta dans les échantillons positifs 6E10 monomères et riches en oligomères par rapport aux échantillons A11 positifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est bien exécutée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer des candidats médicaments pour des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de l’oligomère A-bêta et de l’évaluation de sa quantité.