Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine pancréatique en utilisant ces pancréatoïdes pour comprendre comment les cellules endocrines se forment dans un environnement complexe sur le plan architectural et cellulaire. Le principal avantage de cette technique est que les pancréatoïdes développent des cellules endocrines en raison de l’inclusion du mésenchyme environnant. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le pancréas est très petit à e10,5.

Et la dissection est cruciale pour la formation des pancréatoïdes afin d’obtenir suffisamment de tissus non contaminants. Pour vous préparer à la dissection, remplissez un seau à glace et placez un récipient de solution saline tamponnée au phosphate dans la glace. Nettoyez deux pinces à pointe fine et des ciseaux de dissection avec de l’éthanol à 70 %.

Près de la zone de dissection, placez un récipient avec au moins trois tubes capillaires en borosilicate, un briquet et des pointes de pipette filtrées de 1000 microlitres. Ensuite, pipetez au moins un millilitre de dispasa froid de 1,25 milligramme par millilitre dilué dans de l’eau stérilisée dans le deuxième puits d’une plaque de 12 puits sur glace. Pipette PBS dans les premier, troisième et quatrième puits de la plaque de 12 puits.

De plus, pipetez un millilitre de 0,05 % de trypsine dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace. Après avoir euthanasié des souris enceintes e10.5 chronométrées conformément aux directives de l’IACUC, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % pour nettoyer la région. Ensuite, faites une incision en forme de V au niveau de la zone génitale de la souris à l’aide de ciseaux et de pinces et continuez l’incision jusqu’au diaphragme.

Excise soigneusement l’utérus en faisant une incision dans les parties latérales les plus supérieures de l’utérus, en tirant l’organe vers le haut en l’éloignant de la souris et en suivant cette incision jusqu’à la région génitale avant de répéter de l’autre côté. Placez l’utérus excisé dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec le PBS froid. Sous un microscope à dissection optique, placez la boîte de Pétri et ouvrez soigneusement le tissu utérin en plaçant deux pinces entre chaque embryon et en décollant le tissu du sac vitellin.

Transférez les embryons en saisissant doucement le sac vitellin à l’aide d’une pince et en les plaçant dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec du PBS frais et froid. Placez la boîte de Pétri sur de la glace. Ensuite, placez plusieurs gouttes PBS sur le couvercle de la boîte de Pétri de 10 centimètres.

Utilisez ces gouttelettes pour transférer l’embryon pendant la dissection pendant que les tissus extra-embryonnaires sont retirés pour assurer la visibilité. Transférez un embryon dans une goutte PBS et retirez-le doucement du sac vitellin à l’aide d’une pince pendant que les embryons restants restent dans le PBS sur de la glace. Retirez la tête avant de déplacer l’embryon vers une nouvelle goutte PBS à l’aide d’une pince pour ramasser légèrement l’embryon sans endommager le tissu.

Dans une nouvelle goutte PBS, retirez les quatre bourgeons des membres à l’aide d’une pince. Placez la pince dans l’ouverture où le bourgeon du membre était présent et déchirez doucement uniquement le tissu le plus externe vers l’avant. Faites pivoter l’embryon et répétez l’opération dans le sens postérieur, en vous arrêtant au niveau du bourgeon de la patte arrière.

À ce stade, le tractus gastro-intestinal devrait être visible. La région postérieure du tractus gastro-intestinal présente une légère courbure ; Insérez une pince derrière ce coude dans l’ouverture entre le tractus gastro-intestinal et la région de la colonne vertébrale au niveau de la paroi corporelle. Détachez le tractus gastro-intestinal, en travaillant lentement vers le haut jusqu’à ce que la région la plus antérieure soit atteinte, où la région cardiaque se connecte.

Dans les étapes suivantes, il est essentiel d’éviter les tissus environnants dans la culture, afin de ne pas contaminer les pancréatoïdes avec du tissu non pancréatique. Cependant, si vous ne saisissez pas l’ensemble du bourgeon pancréatique, le nombre et la taille du pancréatoïde seront altérés. Transférez le tractus gastro-intestinal dans la gouttelette fraîche de PBS.

Continuez à retirer le tissu externe entourant le tractus gastro-intestinal. Une fois ce tissu externe retiré, le bourgeon pancréatique peut être visualisé à l’arrière des bourgeons hépatiques, entre l’estomac et l’intestin. Ensuite, prenez une pince et pincez doucement le tissu sous le bourgeon saillant dans l’intestin et soulevez légèrement le bourgeon pancréatique.

Après avoir pincé la région où le bourgeon se connecte à l’intestin, le bourgeon est séparé. Lavez une fois dans une nouvelle bulle PBS avant de transférer le bourgeon dans le premier puits de la plaque à 12 puits et refroidissez le PBS sur de la glace. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les bourgeons soient prélevés sur les embryons et placés dans le premier puits de la plaque à 12 puits.

Ensuite, placez la parabole à 12 puits sous le microscope à dissection de lumière. Comptez le nombre de bourgeons pancréatiques disséqués avec succès pour calculer plus tard le rapport de division. Placez une pointe de pipette filtrée de 1000 microlitres dans la pipette avec le tube capillaire attaché.

Stérilisez à la flamme le tube capillaire et créez une courbure dans le tube pour faciliter l’utilisation. Utilisez le capillaire pour transférer les bourgeons dans le deuxième puits contenant une solution de dispase froide pendant deux minutes avant de les transférer dans le troisième puits contenant du PBS propre. Piquez les bourgeons de haut en bas et transférez-les dans le quatrième puits contenant du PBS propre.

Enfin, à l’aide du dispositif capillaire, transférez les écouteurs dans le tube de 1,5 millilitre avec 0,05 % de trypsine. Placez le tube dans l’agitateur préchauffé à 37 degrés Celsius et secouez à 1 500 tr/min pendant quatre à cinq minutes. Après avoir tourbillonné pendant environ 10 secondes, placez immédiatement le tube dans la centrifugeuse et faites-le tourner pendant cinq minutes à 200 g.

Retirez avec précaution tout ce qui est de solution, à l’exception d’environ 50 microlitres, afin de ne pas déranger les cellules centrifugées. Pour chaque bourgeon collecté à 400 microlitres de milieu d’organogenèse vers les cellules centrifugées, pulsez le vortex trois fois et mettez en plaque 100 microlitres par puits d’une plaque à 96 puits à faible attachement, en divisant les bourgeons dans un rapport de un à quatre. Vérifiez au microscope pour visualiser les cellules dissociées flottant librement.

Placez ensuite la boîte de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone sur une bascule à vitesse moyenne. Une dissection soigneuse des embryons de souris à e10.5 de la corne utérine devrait produire des embryons intacts dans le PBS pour une dissection ultérieure. Le tractus gastro-intestinal peut être efficacement retiré de l’embryon, ce qui permet de discerner le bourgeon pancréatique dorsal à la jonction de l’intestin et de l’estomac.

Dans les milieux d’organogenèse, ces cellules flottantes sans échafaudage s’auto-assemblent et s’organisent en pancréatoïdes tridimensionnels qui se développent et persistent pendant au moins 10 jours en culture. L’application d’un activateur de la protéine kinase C à des concentrations élevées modifie la morphologie des pancréatoïdes en développement, conduisant à des cellules épithéliales faiblement associées et à une ramification accrue. De plus, l’utilisation d’animaux transgéniques permet de visualiser les cellules au fur et à mesure qu’elles se différencient en temps réel.

Pour évaluer l’association du tissu du mésenchyme pancréatique avec les cellules épithéliales pancréatiques, une immunocoloration peut être effectuée pour les marqueurs de chaque tissu. L’immunocoloration d’un marqueur de canal avec un marqueur endocrinien et des noyaux révèle la formation de plusieurs lignées dans les pancréatoïdes. Un marqueur mésenchyme co-coloré avec un marqueur progéniteur pancréatique montre que le mésenchyme enveloppe le pancréatoïde.

Le développement des cellules bêta est révélé par la coloration du marqueur épithélial et du marqueur des cellules bêta. À l’aide de l’analyse quantitative par PCR, les transcrits des progéniteurs et des cellules différenciatrices peuvent être évalués, tels que les gènes progéniteurs et les marqueurs différenciés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure, y compris le temps de préparation, si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la dissection pour obtenir du tissu pancréatique à partir de 10,5 souris pour générer des pancréatoïdes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de retirer soigneusement le tractus gastro-intestinal des embryons, sinon il sera très difficile de trouver le bourgeon pancréatique. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que GSIS et ELISA peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la quantité d’insuline ou de peptide C produite après la stimulation par glucose.

Après son développement, cette technique nous a ouvert la voie à l’exploration des conséquences morphologiques de l’activation de la PKC à l’aide de petites molécules. Une façon de mettre en œuvre davantage ce système pour étudier l’effet du facteur de transcription d’expression et même pour réaliser d’importantes expériences d’épistasie.