Name: Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez la génération de pancreatoïdes 3D exprimant l'insuline à partir de progéniteurs pancréatiques de souris e10.5. Cette méthode permet d'étudier la formation des cellules endocrines dans un environnement complexe incluant le mésenchyme.

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Nous remercions Jolanta Chmielowiec pour toute question utile concernant le protocole et le manuscrit. Nous remercions également Benjamin Arenkiel d’accès au microscope confocal. Ce travail a été soutenu par les NIH (P30-DK079638 à M.B.) et T32HL092332-13 au M.A.S. et M.B., la Fondation médicale McNair (à M.B.) et le noyau confocal au BCM intellectuelle et Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain).

Toutes les expériences animales décrites dans cette méthode ont été approuvées par le Comité utilisation du Baylor College of Medicine et d’institutionnels animalier.
1. préparation des progéniteurs pancréatiques de souris embryonnaires jour 10,5
Remarque : Ce protocole n’a pas à suivre dans des conditions stériles jusqu'à l’étape 2, mais il est optimal pour stériliser les outils de dissection et pulvériser avec avant l’utilisation d’éthanol à 70 %.
<ol><li>Pour mettre en place pour la dissection, remplissez un seau à glace et placez un récipient de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la glace. Nettoyez les deux pinces à pointe fine et ciseaux de dissection à l’éthanol à 70 %. Situé à proximité de la zone de dissection, un contenant d’au moins trois borosilicaté capillaire tubes, une pipette de la bouche, un briquet et filtrée 1 000 pointes de pipette µL.<ol>
<li>Préparer au moins 1 mL d’a froid de 1,25 mg/mL dilué dans l’eau stérilisée et place dans le deuxième puits d’une plaque 12 bien sur la glace. Mettre des PBS dans la première, troisième et quatrième puits des 12 plaque bien. Placez 1 mL de 0,05 % trypsine dans un 1,5 mL tube sur la glace. Préchauffer un secousse incubateur à 37 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanasier e10.5 souris enceintes chronométré conformément aux lignes directrices IACUC. Vaporiser l’abdomen d’éthanol à 70 % à nettoyer la région avant d’effectuer une incision en forme de V sur les parties génitales de la souris à l’aide de ciseaux et pinces et poursuivre jusqu'à la membrane. NOTE : Apparition d’un bouchon vaginal dans le présent protocole indique jour 0,5. À l’aide de 5 - souris âgés de 6 semaines, un gain de poids de plus de 2 g agit comme une mesure secondaire de fécondation réussie.<ol>
<li>L’accise soigneusement l’utérus en faisant une incision dans les portions latérales supérieures de l’utérus, tirant l’orgue vers le haut de la souris et suite à cette incision vers le bas pour la région génitale avant de répéter de l’autre côté. Placez-le dans une boîte de Pétri avec du PBS de froid de 10 cm. Remarque : Il est possible d’obtenir des organoïdes des cellules e11.5 dissociées, mais contrairement à la pancreatoids de e10.5, ces organoïdes ne sont pas encore caractérisées et donc ne peuvent pas conserver la capacité de se différencier en tous les trois lignées du pancréas majeures.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sous un microscope à dissection léger, placez la boîte de Pétri et ouvrir lentement les tissus utérins en plaçant deux pinces entre chaque embryon et épluchage des tissus de la vésicule vitelline. Transfert d’embryons en saisissant le sac vitellin délicatement avec la pince et le placer dans une boîte de Pétri avec frais, de 10 cm froid PBS. Placez la boîte de Pétri sur glace. NOTE : Il est important d’éliminer heedfully embryons, préférence maintenues dans le sac vitellin, comme suppression forcée peut tirer le cordon ombilical, déchirure des tissus de l’embryon et de compromettre l’intégrité structurale.</li>
	<li>Déposer plusieurs gouttes de PBS sur un couvercle de boîte de Pétri de 10 cm. Ces gouttelettes permet de transférer l’embryon au cours de la dissection comme tissus extra-embryonnaires sont retirées pour assurer la visibilité. Transfert d’un embryon à une baisse de PBS et retirez doucement le sac vitellin avec une pincette, alors que les embryons restants restent dans du PBS sur la glace (Figure 1A). Sortez la tête avant de rejoindre une nouvelle goutte de PBS à l’aide de pinces à évider légèrement l’embryon, à ne pas endommager le tissu (Figure 1B) de l’embryon. NOTE : Le tissu devrez peut-être être transférées plus fréquemment à des gouttelettes de PBS frais que celle décrite ici, selon l’opacité du liquide.<ol>
<li>Une nouvelle chute de PBS, enlever les bourgeons des membres antérieurs avec une pincette (Figure 1B). Placer la pince dans l’ouverture où se trouvait le bourgeon de membre et doucement déchirer seulement le tissu externe plus vers l’avant (Figure 1B). Tourner l’embryon et répéter dans le sens postérieur, s’arrêtant à le œuf du membre postérieur. À ce stade, le tube digestif doit être visible (Figure 1B).</li>
		<li>La région postérieure du tube digestif a une légère courbure (Figure 1F). Insérer pinces derrière ce virage dans l’ouverture entre le tube digestif et de la région de la colonne vertébrale de la paroi du corps. Détacher le tube digestif, travaillant lentement vers le haut jusqu'à ce que la région plus antérieure est atteint lorsque la région cardiaque connecte (Figure 1B-E). FACULTATIF : Retirez le coeur primordial et les bourgeons du foie les régions ventrales du tractus gastro-intestinal, laissant seulement le tube tube digestif continu. Les premières fois ce protocole est réalisé, il pourrait être plus facile de laisser le cœur et le foie comme points de repère ventrales jusqu'à ce que la morphologie de l’appareil gastro-intestinal et le bourgeon du pancréas dorsal sont plus familiers (Figure 1C et D ).</li>
		<li>Transférer le tube digestif à la goutte de PBS frais.</li>
		<li>Prendre la pince et pincer doucement le tissu sous le bourgeon qui dépasse et l’intestin et soulevez légèrement le tissu extérieur au large (Figure 1,D-F). Remarque : Le bourgeon du pancréas dorsal est situé entre l’estomac et l’intestin (Figure 1C-G). Le bourgeon du pancréas sous devrait ressembler à une structure ronde, noueuse (Figure 1G).</li>
		<li>Placez les pinces où le œuf se connecte à l’intestin et le pincement vers le haut pour desserrer le bourgeon (Figure 1G). Laver une seule fois dans une nouvelle bulle de PBS avant de transférer l’oeuf dans le premier puits de la plaque de 12 puits dans du PBS froid sur la glace. Répétez jusqu'à ce que tous les bourgeons sont collectées à partir d’embryons et placés dans le premier puits de la plaque bien 12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer le plat bien 12 sous le microscope à dissection léger. Compter le nombre de bourgeons pancréatiques disséqué avec succès pour ensuite calculer le coefficient de fractionnement.<ol>
<li>Place un filtrée 1 000 µL de pipette dans la pipette de bouche avec un tube capillaire jointe. Flamme stériliser le tube capillaire et créer un coude dans le tube pour la facilité d’utilisation. Le capillaire permet de transférer des bourgeons à la deuxième solution a froid contenant bien pendant 2 min avant de les transférer à la troisième puits avec du PBS propre (Figure 1G). Remarque : Pendant le transfert des bourgeons d’a à PBS, évitez de toucher les tissus jusqu'à l’extrémité du tube capillaire. Si le tissu se coince à l’extrémité du tube, pipette de haut en bas ou secouer dans la solution de PBS propre jusqu'à ce que desserré.</li>
		<li>Pipetter bourgeons de haut en bas et transférer dans le 4e puits avec du PBS propre. Enfin, en utilisant le transfert capillaire périphérique bourgeons au tube de 1,5 mL avec 0.05 % trypsine. Placer le tube dans le shaker de 37 oC préchauffé et agiter à 1 500 tr/min pendant 4 min.</li>
		<li>Vortex pour environ 10 s puis placer immédiatement le tube dans une centrifugeuse et un essorage pendant 5 min à 200 g. retirer tout mais environ 50 µL de solution avec prudence quant à ne pas déranger les cellules centrifugés (Figure 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mise en culture des progéniteurs dissociés pour former Pancreatoids
Remarque : Ce qui suit doit être effectué dans une atmosphère stérile sous une hotte de vitroplants standard, en utilisant des procédures stériles standards.
<ol><li>Pour chaque bourgeon recueillie, ajouter 400 µL organogenèse médias16,17 (tableau 1) pour les cellules centrifugés. Vortex d’impulsion trois fois et plaque 100 µL / puits d’un faible attachement 96 bien plate, fractionnement des bourgeons à un ratio de 1:4 (Figure 1G).</li>
	<li>Vérifier au microscope pour visualiser dissocié de cellules flottant librement (Figure 1H). Posez le plat de la culture dans un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2 sur un rocker à vitesse moyenne.</li>
	<li>Surveiller la progression de pancreatoids tous les jours. Remplacer par 100 µL de supports neufs tous les 3 jours, soigneusement pipetage médias sous contrôle microscopique dans la hotte pour enlever tout en laissant pancreatoid dans le puits. Sinon, frais 100 µL de médias peuvent être ajoutés à un nouveau puits et pancreatoid en utilisant le tube capillaire de borosilicate, attaché à la pipette de la bouche et 1000 µL filtrée de pipette.</li>
</ol>3. le traitement Pancreatoids pour l’imagerie par immunofluorescence
<ol><li>Pour traiter les pancreatoids pour les images par immunofluorescence, tout d’abord préparer 4 % paraformaldéhyde/PBS, solution de pH7.4 (PFA). Déposer 50 µL de 4 % PFA dans les puits d’un 96 bien plate.<ol>
<li>Grâce aux tubes capillaires en verre borosilicaté et la pipette de la bouche avec la pipette filtrée de 1 000 µL, transfert pancreatoids de milieu de culture compte médias aussi peu que possible du puits fraîche avec 4 % PFA. Situé sur la bascule à température ambiante pendant 15 min.</li>
		<li>Transfert pancreatoids de 4 % PFA dans un puits avec 100 µL de PBS frais, rock à température ambiante pendant 5-10 min. Repeat pour un total de trois lavages de PBS frais. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, avec pancreatoids stocké dans 100 µL de PBS à 4 oC pendant une semaine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour l’imagerie wholemount (recommandé si les anticorps sont une approche convenable, alternative à la section 3.3. et microscopie 3.4.), transfert de PBS dans 50 µL de sérum âne 5 % dans du PBS 1 x avec 0,1 % de détergent non ionique (PBST) au bloc. Roche du jour au lendemain à 4 oC ou alternativement pendant 4 h à température ambiante.<ol>
<li>Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant des anticorps primaires dilués dans 50 µL de sérum d’âne de 5 % à 1 x PBST. Idéalement, rock pendant 24 h à 4 oC (au moins 12 h, mais jusqu'à 36 h). Remarque : Les anticorps énumérés dans la Table des matières contre Chga (1/100), s/n (1 : 400), Vim (1 : 400) et Pdx1 (au 1/100) conviennent pour la coloration de wholemount ; autres anticorps peuvent exiger l’optimisation.</li>
		<li>Transfert pancreatoids vers un puits contenant 100 µL de PBST fraîche pour laver et balancer durant 30 min à température ambiante. Répétez cette étape pour un total de trois lavages frais de PBST.</li>
		<li>Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant des anticorps secondaires dilués dans 50 µL de sérum d’âne de 5 % à 1 x PBST. Protéger la plaque de la lumière et placer à 4 oC, bascule de façon optimale 24h (au moins 12 h, mais jusqu'à 36 h). Remarque : Tous les anticorps secondaires répertoriés dans la Table des matières et DAPI contre-colorant nucléaire conviennent pour une coloration wholemount.</li>
		<li>Transfert pancreatoids vers un nouveau puits contenant 100 µL de 1 x PBST et rock à température ambiante pendant 30 min. Repeat pour un total de trois lavages en 1 x PBST. Dans le troisième et dernier lavage, ajouter 300 nM DAPI.</li>
		<li>Enfin, placez dans 100 µL de PBS propre et le magasin à 4 oC à l’abri de la lumière pour jusqu'à une semaine avant l’imagerie par microscopie confocale, bien que les meilleurs résultats proviennent de l’imagerie immédiatement après la coloration. Pour éviter les mouvements de pancreatoids au cours de l’imagerie, mais éviter le dessèchement, placez chaque pancreatoid dans une goutte de 20 µL de PBS. Si pancreatoids ne restent pas toujours, réduire le volume de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les coupes congelées, transfert pancreatoids de PBS dans une solution de saccharose 30 % durant la nuit à 4 oC.<ol>
<li>Ajouter des éléments multimédias encastrement dans une bulle sous un microscope à dissection. À l’aide de forceps sous contrôle microscopique, tremper les pancreatoids en poussant doucement à travers les médias encastrement plusieurs fois pour enlever le saccharose résiduel avant de les transférer à un bloc de tissu avec milieu encastrement gelé.</li>
		<li>Placez le bloc de tissu sur la glace sèche jusqu'à ce que la gelée et la section sur le cryostat à 8 µm. Remarque : Sections peuvent être stockées immédiatement à-80 oC ou immunostained.</li>
		<li>Permettre à des sections de-80 oC pour décongeler à température ambiante pendant environ 5 min à sec. Dessiner une barrière hydrophobe, vous utilisez le stylet de pap hydrophobe autour du tissu et le bloc à l’aide de 5 % de sérum d’âne dilué dans 1 x PBST pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Retirez les supports et les remplacer immédiatement avec des anticorps primaires dilués à 5 % de sérum d’âne dilué dans 1 x PBST nuit à 4 oC.</li>
		<li>Enlever la solution primaire et laver les tissus trois fois avec 1 x PBST pour 10 min chacun. Suite à cela, ajouter la solution d’anticorps secondaire diluée à 5 % de sérum d’âne dilué dans 1 x PBST pendant 1 h à température ambiante et de protéger les lames de la lumière.</li>
		<li>Enlever la solution secondaire et les lames trois fois en 1 x PBST de 10 min chacun. Dans le lavage final, ajouter 300 nM DAPI.</li>
		<li>Retirez les supports et ajouter des supports de montage et un lamelle couvre-objet. Magasin de glisse abri de la lumière à 4 oC jusqu’au moment de l’image.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolement de l’ARN du Pancreatoids pour l’analyse de la transcription
<ol><li>Recueillir des pancreatoids à l’aide de capillaire de borosilicate attaché à une pipette de bouche avec un filtrée 1 000 µL pipette pour stérilité et lieu dans 500 µL de solution de thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium acide dans un tube de 1,5 mL. Conserver à-80 oC ou procéder immédiatement à l’isolement d’ARN.</li>
	<li>Pour les ARN, décongeler les échantillons sur la glace si nécessaire et ajouter 100 µL de chloroforme. Vortex bien et place à 4 oC pendant 15 min. refroidissent préalablement une centrifugeuse à 4 oC.<ol>
<li>Placer les tubes dans la centrifugeuse et un essorage pendant 20 min à 12 000 g à 4 oC.</li>
		<li>Retirer délicatement les tubes pour ne pas déranger la séparation des couches. À l’aide d’une pipette µL 200, collecter la solution aqueuse limpide et placer dans un nouveau tube de 1,5 mL, laissant derrière une petite quantité de mémoire tampon de la couche protéique blanc et rose couche d’ADN. Ne touchez pas l’embout de la pipette à rien dans ce processus et ne pas toucher les parois du tube 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 500 µL d’isopropanol 100 % dans le nouveau tube contenant la phase aqueuse et vortex. Laisser reposer à température ambiante pendant 20 min, plus de temps sur la glace, ou de précipitations maximales laisser une nuit à-20 oC.</li>
		<li>Centrifuger à 12 000 g pendant 15 min à 4 oC pour granuler la RNA. Supprimer l’isopropanol sans déranger le culot. Remarque : Comme pancreatoids sont de petite taille, il est probable que la pastille ne sera pas visible.</li>
		<li>Ajouter froid, 75 % d’éthanol et inverser le tube plusieurs fois. Placer dans la centrifugeuse et essorage à 9 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Retirer l’éthanol et l’essorage pendant 2 min à 9 000 x g.</li>
		<li>Utiliser une pipette de 200 µL d’enlever tout l’éthanol restant dans le tube, sans contact avec la région dans que le culot réside. Laisser le bouchon ouvert sur le tube pendant 5-10 min à température ambiante pour assurer l’évaporation d’éthanol résiduel.</li>
		<li>Resuspendre culot au vortex dans 20 µL d’eau propre et exempte de nucléase. Facultatif : Chaleur l’ARN à 65 oC pendant 3 min et immédiatement retourner sur la glace. ARN peut être conservé à-80 oC ou immédiatement utilisé pour la transcription inverse et qPCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La progression des modèles de culture de cellules est essentielle à l’élaboration d’un modèle correctement, produisent des types de cellules cliniquement pertinents, test de l’efficacité du médicament ou même greffe à des patients. Cependant, récapitulant artificiellement le développement dans un plat est difficile car nous sommes encore loin de comprendre les mécanismes de l’organogénèse et de la physiologie in vivo. In vitro les cellules sont donc générés de façon inefficace, pas entièrement fonctionn...

Délimiter les mécanismes du développement normal et la physiologie est primordiale pour comprendre l’étiologie de la maladie et de cultiver en fin de compte les méthodes de traitement. Alors que la mise en culture et la différenciation des cellules souches permettent une analyse rapide et haut débit de développement, il est limité par l’acquis des connaissances sur les mécanismes de régulation sort de la cellule et récapitule artificiellement le développement dans un relativement un État homogène, deux dimensions1,2. Non seulement en vivo développement touché par des influences extrinsèques, avec différents types de cellules dans la niche et le milieu fournit des signaux paracrines et soutien organisationnel pour guider l’organogenèse, mais la fonction de ces cellules s’appuie également sur leur cadre d’orientation3,4,5. Compte tenu de l’importance de ces facteurs externes, les limitations des protocoles de différenciation et la nature laborieuse des modèles de souris in vivo , nouveaux systèmes sont nécessaires pour étudier expérimentalement physiologie et processus de base du développement.
L’émergence des protocoles pour générer organoïdes Three-Dimensional, complexe fournit un système commode et congruent pour étudier l’organogénèse, la physiologie, l’efficacité du médicament et même pathogenèse. Établissement organoïdes murin pour différents systèmes tels que l' estomac de6 et l’intestin7 ont élargi notre compréhension de l’organogenèse, fournissant un outil pour étudier les complexités du développement avec moins de restrictions que en vivo et les modèles in vitro . En raison de ces avancées dans la murine organoïde formation et l’avènement de pluripotentes humaines découlent cellules, intestinale humaine8, rétinienne9, rénale10,11, et cérébral12 organoïdes ont été produites et ce Répertoire est seulement limitée par les connaissances actuelles concernant les mécanismes de développement.
Un intérêt particulier est la génération de pancréatique organoïdes, comme les types différents de cellules pancréatiques, y compris les cellules acineuses et conduits à l’insuffisance pancréatique exocrine13, cellules acineuses dans la pancréatite14, sévit dans une multitude de maladies et cellules bêta dans le diabète15. Acquérir des connaissances concernant l’évolution de ces différents types de cellules puisse aider à comprendre leur pathologie et peut, aussi, servir de plate-forme pour le dépistage des drogues personnalisée ou de la transplantation. Auparavant, Greggio et coll. a développé une méthode pour créer des murins organoïdes pancréatique récapituler en vivo morphogenèse et de développer des structures organisées, en trois dimensions, complexes composés de toutes les principales cellules épithéliales du pancréas types de16,17. Il s’agit d’une avancée majeure dans le domaine du pancréas, surtout en faisant des cellules in vitro pouvez activer investigation biologique du développement des cellules bêta. Toutefois, la rareté des cellules endocrines formé dans le présent protocole à moins que les organoids ont été transplantés dans les tissus, où la niche pourrait interagir et fournir des repères pédagogiques17. Le mésenchyme constitue la plus grande partie de la niche, très enveloppant l’épithélium en développement depuis le début de l’organogenèse aux stades ultérieurs, y compris la délamination endocrinienne et différenciation3,4, 18. L’interaction entre le mésenchyme et le pancréas en développement est encore un autre exemple de signalisation extrinsèque et l’importance de maintenir in vivo la complexité cellulaires pour étudier l’organogenèse.
Nous décrivons ici comment générer en trois dimensions organoïdes pancréatique, appelé pancreatoids, de e10.5 dissociées des progéniteurs pancréatique murine. Ces pancreatoids conserver mésenchyme natif, s’auto-assembler en conditions flottantes et générer tous les types de grandes cellules pancréatiques, dont quelques cellules endocrines de beta19robuste. Cette approche est plus adaptée pour l’analyse du développement endocrinien, comme les protocoles précédents n’ont pas la différenciation endocrine robuste. Cependant, en utilisant le protocole pour organoïdes pancréatique tel que décrit par Greggio et coll. est mieux adapté pour l’analyse de ramification épithéliales du pancréas et de la morphogenèse, comme ramification est plus limitée en pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Ensembles de tubes d’aspirateur pour pipettes microcapillaires calibrées</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Eau sans nucléase</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires en borosilicate</td><td>Instruments Sutter GB1007515</td><td></td><td>D.E. 1mm, D.I. 0,75mm, longueur</td></tr> <tr><td>1,5cmCaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Répulsif cellulaire 96 puits Microplaque</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td> Centrifugeuse <td>à fond en U</td></tr><tr><td>5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A</td><td>Anticorps Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope compact et modulaire M60</td><td></td> Compteur de cellules automatisé Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Lames de compteur de cellules Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidine-2'-dichlorhydrate de phénylindole)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>DBA anticorps</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Poudre</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0,05 x 0,02 mm ; Titane; Astuce de biologie</td></tr><tr><td>EGF (Facteur de croissance épidermique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Incubateurs CO2 Forma Steri Cycle</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Sel sodique d’héparine de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Anticorps</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>IgG de souris polyclonale</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothésie isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-insuline</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Cochon d’Inde polyclonal</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universel</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE Spectorale Confocale Haute Résolution</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>souris C-Peptide ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Souris Ultrasensible Insuline ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Lames de microtome</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Pdx1</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Souris monoclonale MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Moules d’enrobage jetables</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13- Acétate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protéine LoBind Microcentrifugeuse Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1,5 ml de capacité</td></tr><tr><td>Recombinante humaine FGF-10 Protéine</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Humain FGF-Acide</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Humain R-Spondin I Protéine</td><td>R& D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), no Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>Pour le comptage cellulaire lames</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05 % )</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Rouge phénol</td></tr><tr><td>Fixation ultra-faible Plaque 24 puits</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Attache ultra-faible Plaque sphéroïde 96 puits</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Vimentin</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Polyclonal Poulet IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Chlorhydrate</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Aussi connu sous le nom d’inhibiteur</td></tr><tr><td>de ROCK Zeiss 710 Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique in vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Le pancréas est qu'un organe complexe composé de plusieurs types de cellules différentes qui travaillent ensemble pour réguler la digestion et l’homéostasie du glucose du sang. Ces types de cellules comprennent des cellules acineuses sécrétant des enzymes, un système canalaire arborisé responsable pour le transport des enzymes de l’intestin et productrices de l’hormone des cellules endocrines.
Bêta-cellules endocrines sont le type de cellule unique dans le corps qui produisent l’insuline pour abaisser la glycémie. Le diabète, une maladie caractérisée par une perte ou à la dysfonction des cellules bêta, atteint des proportions épidémiques. Ainsi, il est essentiel d’établir des protocoles afin d’étudier le développement des cellules bêta qui peut être utilisé pour des fins de dépistage pour dériver de la drogue et les thérapies cellulaires. Alors que l’étude expérimentale du développement chez la souris est essentielle, des études in vivo sont laborieux et fastidieux. Les cellules cultivées fournissent une plate-forme plus commode pour le dépistage ; Cependant, ils sont incapables de maintenir la diversité cellulaire, organisation architectonique et interactions cellulaires trouvées in vivo. Ainsi, il est essentiel de développer de nouveaux outils pour étudier la physiologie et l’organogénèse du pancréas.
Les cellules épithéliales du pancréas développent en étroite association avec mésenchyme dès le début de l’organogenèse comme cellules organisent et se différencient en l’organe adulte complexe, physiologiquement compétent. Le mésenchyme pancréatique fournit des signaux importants pour le développement du système endocrinien, dont beaucoup ne sont pas bien compris encore, donc difficile de récapituler au cours de la culture in vitro . Nous décrivons ici un protocole à la culture souris complexes en trois dimensions, cellulaire organoïdes qui conservent le mésenchyme, appelé pancreatoids. Le bourgeon du pancréas murin e10.5 est disséqué, dissocié et cultivé dans un environnement sans échafaudage. Ces cellules de flottants s’auto-assembler avec mésenchyme enveloppant le pancreatoid en développement et quelques robustes de bêta-cellules endocrines, développant ainsi que l’acineuses et les cellules de la gaine. Ce système peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires sort détermination, organisation structurelle et morphogenèse, cellules pendant l’organogenèse, ou pour la drogue, petite molécule ou dépistage génétique.

Une dissection minutieuse des embryons de souris à e10.5 de la corne utérine devrait produire des embryons intacts dans du PBS pour davantage de dissection (Figure 1A). Le tractus gastro-intestinal peut être efficacement retiré de l’embryon (Figure 1B), permettant de discerner le bourgeon du pancréas dorsal à la jonction de l’intestin et l’estomac (Figure 1A-...

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine pancréatique en utilisant ces pancréatoïdes pour comprendre comment les cellules endocrines se forment dans un environnement complexe sur le plan architectural et cellulaire. Le principal avantage de cette technique est que les pancréatoïdes développent des cellules endocrines en raison de l’inclusion du mésenchyme environnant. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le pancréas est très petit à e10,5.Et la dissection est cruciale pour la formation des pancréatoïdes afin d’obtenir suffisamment de tissus non contaminants. Pour vous préparer à la dissection, remplissez un seau à glace et placez un récipient de solution saline tamponnée au phosphate dans la glace. Nettoyez deux pinces à pointe fine et des ciseaux de dissection avec de l’éthanol à 70 %.Près de la zone de dissection, placez un récipient avec au moins trois tubes capillaires en borosilicate, un briquet et des pointes de pipette filtrées de 1000 microlitres. Ensuite, pipetez au moins un millilitre de dispasa froid de 1,25 milligramme par millilitre dilué dans de l’eau stérilisée dans le deuxième puits d’une plaque de 12 puits sur glace. Pipette PBS dans les premier, troisième et quatrième puits de la plaque de 12 puits.De plus, pipetez un millilitre de 0,05 % de trypsine dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace. Après avoir euthanasié des souris enceintes e10.5 chronométrées conformément aux directives de l’IACUC, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % pour nettoyer la région. Ensuite, faites une incision en forme de V au niveau de la zone génitale de la souris à l’aide de ciseaux et de pinces et continuez l’incision jusqu’au diaphragme.Excise soigneusement l’utérus en faisant une incision dans les parties latérales les plus supérieures de l’utérus, en tirant l’organe vers le haut en l’éloignant de la souris et en suivant cette incision jusqu’à la région génitale avant de répéter de l’autre côté. Placez l’utérus excisé dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec le PBS froid. Sous un microscope à dissection optique, placez la boîte de Pétri et ouvrez soigneusement le tissu utérin en plaçant deux pinces entre chaque embryon et en décollant le tissu du sac vitellin.Transférez les embryons en saisissant doucement le sac vitellin à l’aide d’une pince et en les plaçant dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec du PBS frais et froid. Placez la boîte de Pétri sur de la glace. Ensuite, placez plusieurs gouttes PBS sur le couvercle de la boîte de Pétri de 10 centimètres.Utilisez ces gouttelettes pour transférer l’embryon pendant la dissection pendant que les tissus extra-embryonnaires sont retirés pour assurer la visibilité. Transférez un embryon dans une goutte PBS et retirez-le doucement du sac vitellin à l’aide d’une pince pendant que les embryons restants restent dans le PBS sur de la glace. Retirez la tête avant de déplacer l’embryon vers une nouvelle goutte PBS à l’aide d’une pince pour ramasser légèrement l’embryon sans endommager le tissu.Dans une nouvelle goutte PBS, retirez les quatre bourgeons des membres à l’aide d’une pince. Placez la pince dans l’ouverture où le bourgeon du membre était présent et déchirez doucement uniquement le tissu le plus externe vers l’avant. Faites pivoter l’embryon et répétez l’opération dans le sens postérieur, en vous arrêtant au niveau du bourgeon de la patte arrière.À ce stade, le tractus gastro-intestinal devrait être visible. La région postérieure du tractus gastro-intestinal présente une légère courbure ; Insérez une pince derrière ce coude dans l’ouverture entre le tractus gastro-intestinal et la région de la colonne vertébrale au niveau de la paroi corporelle. Détachez le tractus gastro-intestinal, en travaillant lentement vers le haut jusqu’à ce que la région la plus antérieure soit atteinte, où la région cardiaque se connecte.Dans les étapes suivantes, il est essentiel d’éviter les tissus environnants dans la culture, afin de ne pas contaminer les pancréatoïdes avec du tissu non pancréatique. Cependant, si vous ne saisissez pas l’ensemble du bourgeon pancréatique, le nombre et la taille du pancréatoïde seront altérés. Transférez le tractus gastro-intestinal dans la gouttelette fraîche de PBS.Continuez à retirer le tissu externe entourant le tractus gastro-intestinal. Une fois ce tissu externe retiré, le bourgeon pancréatique peut être visualisé à l’arrière des bourgeons hépatiques, entre l’estomac et l’intestin. Ensuite, prenez une pince et pincez doucement le tissu sous le bourgeon saillant dans l’intestin et soulevez légèrement le bourgeon pancréatique.Après avoir pincé la région où le bourgeon se connecte à l’intestin, le bourgeon est séparé. Lavez une fois dans une nouvelle bulle PBS avant de transférer le bourgeon dans le premier puits de la plaque à 12 puits et refroidissez le PBS sur de la glace. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les bourgeons soient prélevés sur les embryons et placés dans le premier puits de la plaque à 12 puits.Ensuite, placez la parabole à 12 puits sous le microscope à dissection de lumière. Comptez le nombre de bourgeons pancréatiques disséqués avec succès pour calculer plus tard le rapport de division. Placez une pointe de pipette filtrée de 1000 microlitres dans la pipette avec le tube capillaire attaché.Stérilisez à la flamme le tube capillaire et créez une courbure dans le tube pour faciliter l’utilisation. Utilisez le capillaire pour transférer les bourgeons dans le deuxième puits contenant une solution de dispase froide pendant deux minutes avant de les transférer dans le troisième puits contenant du PBS propre. Piquez les bourgeons de haut en bas et transférez-les dans le quatrième puits contenant du PBS propre.Enfin, à l’aide du dispositif capillaire, transférez les écouteurs dans le tube de 1,5 millilitre avec 0,05 % de trypsine. Placez le tube dans l’agitateur préchauffé à 37 degrés Celsius et secouez à 1 500 tr/min pendant quatre à cinq minutes. Après avoir tourbillonné pendant environ 10 secondes, placez immédiatement le tube dans la centrifugeuse et faites-le tourner pendant cinq minutes à 200 g.Retirez avec précaution tout ce qui est de solution, à l’exception d’environ 50 microlitres, afin de ne pas déranger les cellules centrifugées. Pour chaque bourgeon collecté à 400 microlitres de milieu d’organogenèse vers les cellules centrifugées, pulsez le vortex trois fois et mettez en plaque 100 microlitres par puits d’une plaque à 96 puits à faible attachement, en divisant les bourgeons dans un rapport de un à quatre. Vérifiez au microscope pour visualiser les cellules dissociées flottant librement.Placez ensuite la boîte de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone sur une bascule à vitesse moyenne. Une dissection soigneuse des embryons de souris à e10.5 de la corne utérine devrait produire des embryons intacts dans le PBS pour une dissection ultérieure. Le tractus gastro-intestinal peut être efficacement retiré de l’embryon, ce qui permet de discerner le bourgeon pancréatique dorsal à la jonction de l’intestin et de l’estomac.Dans les milieux d’organogenèse, ces cellules flottantes sans échafaudage s’auto-assemblent et s’organisent en pancréatoïdes tridimensionnels qui se développent et persistent pendant au moins 10 jours en culture. L’application d’un activateur de la protéine kinase C à des concentrations élevées modifie la morphologie des pancréatoïdes en développement, conduisant à des cellules épithéliales faiblement associées et à une ramification accrue. De plus, l’utilisation d’animaux transgéniques permet de visualiser les cellules au fur et à mesure qu’elles se différencient en temps réel.Pour évaluer l’association du tissu du mésenchyme pancréatique avec les cellules épithéliales pancréatiques, une immunocoloration peut être effectuée pour les marqueurs de chaque tissu. L’immunocoloration d’un marqueur de canal avec un marqueur endocrinien et des noyaux révèle la formation de plusieurs lignées dans les pancréatoïdes. Un marqueur mésenchyme co-coloré avec un marqueur progéniteur pancréatique montre que le mésenchyme enveloppe le pancréatoïde.Le développement des cellules bêta est révélé par la coloration du marqueur épithélial et du marqueur des cellules bêta. À l’aide de l’analyse quantitative par PCR, les transcrits des progéniteurs et des cellules différenciatrices peuvent être évalués, tels que les gènes progéniteurs et les marqueurs différenciés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure, y compris le temps de préparation, si elle est exécutée correctement.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la dissection pour obtenir du tissu pancréatique à partir de 10,5 souris pour générer des pancréatoïdes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de retirer soigneusement le tractus gastro-intestinal des embryons, sinon il sera très difficile de trouver le bourgeon pancréatique. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que GSIS et ELISA peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la quantité d’insuline ou de peptide C produite après la stimulation par glucose.Après son développement, cette technique nous a ouvert la voie à l’exploration des conséquences morphologiques de l’activation de la PKC à l’aide de petites molécules. Une façon de mettre en œuvre davantage ce système pour étudier l’effet du facteur de transcription d’expression et même pour réaliser d’importantes expériences d’épistasie.

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Biologie du développement

Un test en trois dimensions qui permet clonogénique pancréatique comme géniteurs à se différencier en insuline exprimer colonies est décrite. Cette méthode tire parti des milieux semi-solides contenant des facteurs de la méthylcellulose, Matrigel et la croissance, dans lequel seule progéniteurs prolifèrent et se...

Un dosage quantitatif de l&#39;insuline exprimer formant colonie Progéniteurs

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Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Ce protocole démontre l'isolation des îlots murins et le semis sur un échafaud décellularisé. Les îlots soutenus par des échafaudages ont été transplantés dans la pate épididymique des souris diabétiques induites par la streptozotocine (STZ). Les îlots ont survécu au site de transplantation et ont inversé l'état hyperglycémique.

Transplantation soutenue d&#39;échafaudage d&#39;îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Découvrez la génération de pancreatoïdes 3D exprimant l'insuline à partir de progéniteurs pancréatiques de souris e10.5. Cette méthode permet d'étudier la formation des cellules endocrines dans un environnement complexe incluant le mésenchyme.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

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