Gène candidat essais dans des études de cohortes cliniques avec génotypage multiplexé et spectrométrie de masse
21 juin 2018
Identification des variantes génétiques qui contribuent à la maladie humaine complexe permet de repérer les nouveaux mécanismes. Ici, nous démontrons une approche de génotypage multiplex de gènes candidats ou analyse de voie de gène qui maximise la protection à faible coût et peut faire l’objet d’études de cohorte.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du diagnostic clinique et de la génétique, telles que la détection de marqueurs génétiques associés aux résultats de la maladie, y compris le virus du papillome humain. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode de diagnostic ciblée et rapide. Pour commencer cette procédure, reconstituez toutes les amorces lyophilisées commandées avec de l’eau de qualité moléculaire.
Tirez les amorces avant et arrière de chaque test multiplexé dans un mélange d’amorces mère, de sorte qu’il contienne chaque amorce à une concentration de zéro virgule cinq millimolaires. Après cela, préparez un mélange maître pour la PCR comme indiqué dans le protocole texte. Ajoutez quatre microlitres de ce mélange dans chaque puits d’une plaque PCR de 384 puits, ainsi qu’un microlitre d’ADN génomique à une concentration comprise entre cinq et 10 nanogrammes par microlitre.
Couvrez la plaque avec un couvercle de plaque et centrifugez 200 fois G pendant une minute à température ambiante. Exécutez ensuite la PCR comme indiqué dans le protocole texte. Chargez un microlitre de produit PCR avec trois microlitres de tampon de chargement sur un gel d’agarose à 2 %.
Fonctionner à 100 volts pendant 45 minutes pour s’assurer que l’amplification de l’ADN a réussi. Ensuite, préparez un master mix SAP comme indiqué dans le protocole texte. Ajoutez deux microlitres du mélange maître SAP fraîchement préparé dans chaque puits de la plaque PCR précédemment exécutée.
Centrifuger brièvement à 1 000 fois G pendant une minute. Et puis remettez la plaque dans le thermocycleur. Faites fonctionner le thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.
Et puis à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes pour inactiver l’enzyme. Après avoir calculé le facteur de dilution de chaque amorce, combinez les volumes déterminés de chacun pour former une piscine d’amorces. Ajoutez de l’eau si nécessaire pour diluer cette piscine.
Assemblez le mélange maître d’extension pour le test de plex élevé ou le test de plex faible, comme indiqué dans le protocole de texte. Ajoutez deux microlitres du mélange principal d’extension dans chaque puits de la plaque, ce qui porte le volume total dans chaque puits à neuf microlitres. Centrifugez brièvement à 1 000 fois G pendant une minute, puis remettez la plaque dans le thermocycleur.
Après cela, ajoutez 16 microlitres d’eau déminéralisée dans chaque puits, portant le volume total à 25 microlitres par puits. Appliquez six milligrammes de résine uniformément sur une plaque de résine à fossettes entière. Laissez sécher la résine pendant 20 minutes à température ambiante.
Ensuite, appliquez la résine sur la plaque de réaction. À l’aide d’un mélangeur à suspension, faites pivoter la plaque à vitesse lente pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez la plaque à 3 200 fois G pendant cinq minutes pour éviter d’appliquer la résine sur la puce du spectre de masse.
Téléchargez la disposition de l’échantillon de plaque sur l’interface logicielle du système. À l’aide d’un système de distribution, appliquez le mélange d’analytes de génotypage de la plaque sur la puce de génotypage. Chargez la puce dans le système MALDI-TOF pour générer les spectres de masse à partir du mélange d’analytes, et interprétez-les à l’aide de l’interface logicielle de la plateforme.
Dans cette étude, le génotypage multiplex est réalisé à l’aide de la spectrométrie de masse. Des données SNP représentatives sont générées et analysées pour le gène candidat IL13 dans une cohorte clinique de découverte phénotypée pour l’allergie alimentaire. Une variante, rs1295686, est associée à une allergie alimentaire prouvée par le provocation.
Cette association est confirmée dans une cohorte de réplication en utilisant l’approche de génotypage multiplex démontrée dans ce protocole. Une méta-analyse des résultats des deux cohortes fournit des preuves solides de l’association entre l’IL13 et l’AF. Lors de cette procédure, il est important de ne pas contaminer d’échantillons ou de réactifs. Il est également important de préparer un mélange principal supplémentaire de 10 % pour chaque PCR afin de tenir compte de toute erreur de pipetage.
Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR en temps réel peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la corrélation entre l’expression des gènes et les marqueurs génétiques associés à la maladie identifiés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines du diagnostic clinique et de la génétique pour explorer les associations de maladies dans des cohortes de patients. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des réactifs de génotypage et le système MALDI-TOF, cela peut être dangereux, et des précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
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Aperçu
Cette étude présente une approche de génotypage multiplexe pour analyser des gènes candidats liés à des maladies humaines complexes. La méthode est rentable et adaptée aux études basées sur des cohortes, améliorant ainsi la détection de marqueurs génétiques associés aux résultats des maladies.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génétique
- Diagnostic clinique
- Détection des agents pathogènes
Contexte
- L'identification des variants génétiques contribue à la compréhension des mécanismes des maladies.
- Des méthodes rentables sont essentielles pour les études à grande échelle.
- Le génotypage multiplex peut améliorer l'efficacité diagnostique.
- Le virus du papillome humain constitue un exemple de cible pour la détection de marqueurs génétiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de génotypage multiplexe pour l'analyse de gènes candidats.
- Maximiser la couverture tout en minimisant les coûts.
- Faciliter les études basées sur des cohortes en génétique.
Méthodes utilisées
- Réhydratation des amorces lyophilisées avec de l'eau de qualité moléculaire.
- Préparation d'un mélange stock d'amorces à une concentration de 0,5 millimolaire.
- Préparation du mélange maître pour la PCR conformément au protocole décrit.
- Utilisation d'une plaque PCR à 384 puits pour l'analyse d'ADN génomique.
Résultats principaux
- La méthode a démontré une efficacité dans la détection de marqueurs génétiques.
- Le rapport coût-efficacité a été validé par une application pratique.
- Une efficacité temporelle a été observée dans le processus diagnostique.
- Application réussie à la détection du virus du papillome humain.
Conclusions
- L'approche de génotypage multiplex est un outil précieux en génétique.
- Elle fournit un cadre pour les études futures sur les maladies complexes.
- Des recherches supplémentaires pourraient élargir ses applications en diagnostic clinique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le génotypage multiplexé par spectrométrie de masse permet une analyse rentable et à haut débit de variants génétiques dans des cohortes cliniques, soutenant la validation de cibles dans la recherche sur les maladies complexes. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en reliant des locus candidats tels que IL13 à des résultats phénotypiques comme l’allergie alimentaire, grâce à des études d’association statistiquement robustes. Elle établit le dépistage génétique comme un outil de découverte évolutif permettant de réduire les risques associés aux hypothèses thérapeutiques dans les phases précoces des pipelines de recherche et développement.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en testant les associations entre des variants génétiques et des phénotypes de maladie dans des cohortes cliniquement pertinentes.
- Valeur opérationnelle : Permet l'interrogation simultanée de jusqu'à 40 SNP par test, augmentant ainsi l'efficacité dans la validation ciblée au niveau des voies métaboliques.
- Valeur prédictive : Contribue à réduire les risques liés à IL13 en tant que cible thérapeutique grâce à la réplication et à la méta-analyse des associations génotype-phénotype.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Utilise le déséquilibre de liaison pour maximiser la couverture génomique avec un nombre minimal de sélection de SNP, améliorant ainsi l'efficacité de la conception des tests.
- Valeur opérationnelle : La détection par MALDI-TOF fournit des données de génotypage quantitatives et à haute résolution, adaptées aux pipelines d'analyse automatisés.
- Extensibilité : Le format PCR en plaques de 384 puits permet un débit élevé d'échantillons, idéal pour des campagnes de criblage sur cohorte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes génétiques dans des cohortes humaines à des voies de validation fonctionnelle, soutenant une sélection ciblée alignée sur les biomarqueurs.
- Avancement ajusté au risque : La réplication dans des cohortes indépendantes renforce la confiance dans la progression de la découverte à l'investissement préclinique.
- Compréhension mécanistique : Permet des études de suivi (par exemple, corrélation de l'expression génique) afin de clarifier les mécanismes biologiques sous-jacents aux associations génétiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage génétique à l'identification de candidats, en fournissant des cohortes génétiquement stratifiées pour la validation ultérieure des cibles et le criblage de composés.
- Biologie de la découverte : Teste des hypothèses génétiques dans des cohortes cliniques phénotypées afin de clarifier les voies associées aux maladies et de prioriser les cibles.
- Depistage : Génère des données de génotype standardisées et reproductibles, permettant une stratification fiable des échantillons pour les tests fonctionnels.
- Analytique : Produit des appels de génotype à haute confiance avec des seuils de contrôle qualité, facilitant la comparaison statistique entre différentes conditions et cohortes.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes génétiques humaines à la validation préclinique en identifiant les variants présentant une association phénotypique forte.
- Réutilisation institutionnelle : La conception d'essais multiplexes est adaptable à différents gènes et maladies, soutenant un investissement de niveau plateforme dans l'infrastructure de génotypage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles grâce à des associations génétiques étayées statistiquement dans des populations cliniquement pertinentes.
- Valeur opérationnelle : Réduit le coût par échantillon grâce au multiplexage et simplifie le flux de travail par l'intégration de la PCR, de l'extension et de la détection MALDI-TOF.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des preuves génétiques humaines qui réduisent les risques liés au choix des cibles dès les premières étapes du processus.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur la réplication et l'ampleur de l'effet observés dans des études de cohorte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la conception de tests génétiques, l'optimisation de la PCR et l'interprétation des données MALDI-TOF.
- Dépend de l'accès à des systèmes de spectrométrie de masse compatibles avec le multiplexage et à un logiciel de génotypage validé.
- Exige des protocoles standardisés de manipulation des échantillons et de contrôle qualité pour assurer la reproductibilité entre sites ou lots.
- L'adaptation à de nouvelles cibles nécessite une sélection de SNPs basée sur l'équilibre de liaison et des tests de compatibilité des amorces en multiplex.
- Les limites pratiques incluent la sensibilité à la qualité de l'ADN des échantillons et la nécessité d'une manipulation soigneuse des réactifs pour éviter toute contamination.
