Un modèle In Vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique véhiculée par 5-Acide aminolévulinique sur Staphylococcus aureus Biofilm
16 avril 2018
Ce manuscrit décrit un protocole afin d’étudier l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus . Ce protocole peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms bactériens par PDT à l’avenir.
L’objectif global de cette expérience est d’évaluer l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique médiée par l’acide cinq aminolévuliniques ou l’ALA sur un biofilm de staphylocoque doré. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du biofilm bactérien sur la façon dont la réparation cellulaire photodynamique pourrait être utilisée comme traitement alternatif pour contrôler les infections à biofilm. L’un des avantages de cette procédure est qu’elle peut être utilisée pour d’autres bactéries avec un ajustement minimal.
Pour générer un biofilm dans une plaque de 96 puits, inculquez d’abord un moins 80 degrés Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA trois cents dans trois cultures de souches cliniques formant un biofilm dans des tubes individuels à fond rond de 14 millilitres contenant cinq millilitres de bouillon de tryptone de soja, ou TSB, milieu, dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation pendant la nuit. Lorsque les cultures ont atteint la phase stationnaire, centrifugez les cellules bactériennes et mettez à nouveau en suspension les granulés et le PBS à une concentration de deux fois 10 à la neuvième unité formant une colonie par millilitre. Diluer ces suspensions bactériennes dans un rapport de un à 200 et un milieu TSB complété par du glucose à zéro virgule cinq pour cent et ensemencer 200 microlitres de cellules bactériennes par puits dans trois puits par souche par groupe expérimental dans une microplaque de 96 puits traitée par culture cellulaire de polystyrène pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius, avec de l’oxygène, sans trembler.
Le lendemain, lavez doucement les puits trois fois avec du PBS sans perturber les biofilms. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’ALA fraîchement préparé dans les puits expérimentaux appropriés et placez la plaque à 25 degrés Celsius pendant une heure à l’abri de la lumière. Ensuite, irradiez la plaque avec une diode électroluminescente à une intensité lumineuse de 100 milliwatts par centimètre carré pendant une heure.
Pour compter le nombre de bactéries viables par groupe à la fin du traitement de photothérapie, lavez doucement chaque puits trois fois avec du PBS pour éliminer toutes les cellules non adhérentes. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette, grattez les bactéries adhérentes au fond de chaque puits. Tirez les cellules de chaque groupe dans un tube d’Eppendorf selon les conditions expérimentales et granulez les cellules par centrifugation.
Remettez les granulés en suspension dans un millilitre d’enzyme pancréatine à 0,25 % et de PBS pour une incubation de 90 minutes à 37 degrés Celsius, suivie d’une autre centrifugation. Remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS et effectuez une à 10 dilutions en série de chaque groupe, en ajoutant cinq microlitres d’échantillon dilué en série sur des plaques individuelles de gélose tryptone soja. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures et comptez le nombre de colonies bactériennes par groupe.
Évaluer les biofilms par microscopie confocale à balayage laser, générer et irradier les biofilms comme démontré. Lavez les biofilms irradiés avec du PBS et colorez les cellules vivantes et mortes avec un millilitre d’un colorant perméable à la membrane des cellules nucléaires et procaryotes fluorescentes vertes et un millilitre d’iodure de propidium micromolaire, respectivement. Après 20 minutes, retirez l’excès de coloration et imagez les biofilms par microscopie confocale à balayage laser sous une lentille d’objectif à immersion dans l’huile 63 fois 1,4 NA.
La viabilité des bactéries du biofilm diminue après un double traitement par photothérapie ALA par rapport à la viabilité bactérienne du biofilm témoin simple ou non traité et aux quatre souches testées. La visualisation des biofilms par microscopie confocale à balayage laser confirme cette constatation, la plupart des cellules positives pour l’iodure de propidium étant observées dans le groupe de photothérapie double ALA. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ensemble de la manipulation des bactéries traitées à l’ALA doit être effectuée dans l’obscurité et que le biofilm du matériau doit être manipulé en douceur pour éviter de perturber le biofilm formé.
Ce message peut être appliqué pour explorer l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique sur le biofilm bactérien in vitro par les chercheurs dans le domaine de l’infection bactérienne.
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Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant d'étudier l'effet antimicrobien de la thérapie photodynamique médiée par l'acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus. Cette méthode peut répondre à des questions essentielles dans le domaine des biofilms bactériens concernant des traitements alternatifs pour le contrôle des infections à biofilm.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Thérapie photodynamique
- Recherche sur les biofilms
Contexte
- Staphylococcus aureus est un agent pathogène courant associé aux infections à biofilm.
- La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement qui utilise des composés activés par la lumière pour tuer les bactéries.
- L'acide 5-aminolévulinique (ALA) est un précurseur dans la synthèse des photosensibilisateurs utilisés en PDT.
- Cette étude vise à développer un modèle in vitro pour tester l'ALA-PDT sur les biofilms bactériens.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'effet antimicrobien de la photothérapie dynamique (PDT) médiée par l'ALA sur les biofilms de Staphylococcus aureus.
- Explorer le potentiel de la PDT comme traitement alternatif des infections à biofilms.
- Établir un protocole pouvant être adapté à d'autres souches bactériennes.
Méthodes utilisées
- Inoculation de Staphylococcus aureus dans du bouillon tryptone soja (TSB) pour former des biofilms.
- Incubation des cultures à 37 degrés Celsius jusqu'à la phase stationnaire.
- Centrifugation et resuspension des cellules bactériennes dans du PBS.
- Ensemencement des cellules bactériennes dans une microplaque de 96 puits pour le traitement par thérapie photodynamique (PDT).
Résultats principaux
- Le protocole génère avec succès des biofilms adaptés aux tests de PDT-ALA.
- La PDT-ALA a démontré des effets antimicrobiens potentiels contre les biofilms de Staphylococcus aureus.
- La méthode peut être adaptée à d'autres souches bactériennes avec des ajustements minimes.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour optimiser les conditions de traitement.
Conclusions
- La PDT-ALA est une approche prometteuse pour le traitement des biofilms bactériens.
- Cette étude fournit une base pour les recherches futures en thérapie photodynamique.
- La compréhension des mécanismes de la PDT peut conduire à des stratégies thérapeutiques améliorées pour les infections liées aux biofilms.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Ce modèle in vitro permet une évaluation mécanistique de la thérapie photodynamique (PDT) pour les infections associées aux biofilms, un défi croissant dans le développement d'agents antimicrobiens. En quantifiant les unités formant des colonies et en visualisant la viabilité par microscopie confocale, le test fournit des résultats reproductibles et quantitatifs permettant de réduire les risques liés aux candidats PDT dès les premières étapes de la découverte. La plateforme soutient la validation des cibles et l'identification de composés leaders pour les stratégies anti-biofilm, particulièrement pertinentes pour Staphylococcus aureus et d'autres pathogènes formant des biofilms.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Évalue l'hypothèse thérapeutique de l'efficacité de la photothérapie dynamique à base d'ALA contre les biofilms de S. aureus par réduction du nombre d'UFC et coloration de viabilité.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles en reliant l'activation du photosensibilisateur aux mécanismes de destruction bactérienne dans un modèle de biofilm contrôlé.
- Valeur prédictive : Soutient les décisions précliniques de poursuite ou d'abandon en démontrant des effets antimicrobiens dépendants de la dose et du temps dans des conditions standardisées.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi pour test : Génère des biofilms matures et reproductibles de S. aureus en format 96 puits, adaptés au criblage haut débit de composés en PDT.
- Données quantitatives : Fournit des décomptes d’UFC et des données de microscopie confocale comme lectures indépendantes pour évaluer la puissance des composés et leur capacité de pénétration dans le biofilm.
- Réutilisation de la plateforme : Adaptable à d'autres souches bactériennes et photosensibilisateurs avec des ajustements minimes du protocole, permettant des applications étendues de criblage anti-infectieux.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence clinique : Modélise des infections à biofilm de S. aureus cliniquement pertinentes, reliant les résultats in vitro à la validation préclinique d'agents anti-infectieux basés sur la thérapie photodynamique.
- Réduction des incertitudes mécanistiques : Clarifie le mécanisme de la thérapie photodynamique au moyen de colorations viabilité/non viabilité, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant les voies d'éradication du biofilm.
- Continuité translationnelle : Soutient les décisions de développement en fournissant des données reproductibles sur l'inhibition du biofilm, obtenues avec plusieurs souches et répétitions expérimentales.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité de la découverte d'agents antibactériens, depuis la validation de la cible jusqu'à l'optimisation du composé précurseur et les essais d'efficacité préclinique, en particulier pour les modalités ciblant les biofilms.
- Biologie de la découverte : Teste des hypothèses mécanistiques concernant la perturbation des biofilms induite par la thérapie photodynamique et la perte de viabilité bactérienne dans un modèle physiologiquement pertinent.
- Évaluation : Permet une évaluation standardisée des photosensibilisateurs et des paramètres de dose lumineuse en vue d'une activité anti-biofilm.
- Analytique : Fournit des mesures de réduction des UFC et de viabilité basées sur la fluorescence afin de comparer les conditions de traitement et d'orienter les relations structure-activité.
- Recherche translationnelle : Relie l'inhibition des biofilms in vitro à des modèles d'efficacité préclinique au moyen de critères d'évaluation quantifiables et reproductibles.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme modulaire de thérapie photodynamique anti-biofilm applicable à plusieurs cibles pathogènes et chimiotypes de photosensibilisateurs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les interactions PDT-biofilm grâce à la visualisation directe et à la quantification de la destruction bactérienne.
- Valeur opérationnelle : Offre un protocole standardisé et protégé de la lumière, comprenant des étapes définies d'incubation, d'irradiation et de lecture, assurant une reproductibilité interlaboratoires.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions de poursuite ou d'abandon des candidats PDT en fournissant des données d'efficacité précoce dans un modèle de biofilm cliniquement pertinent.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des programmes PDT ajustée au risque en identifiant les composés dotés d'une pénétration avérée dans les biofilms et d'une activité antimicrobienne démontrable.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques microbiologiques, en culture de biofilms et en protocoles de sécurité photobiologique.
- Dépend d'un équipement permettant une exposition contrôlée à la lumière (par exemple, un luxmètre à LED) ainsi que d'une microscopie à fluorescence ou d'un lecteur de plaques pour les mesures de CFU et les analyses d'images.
- Exige une standardisation de la préparation de l'ALA, du temps d'incubation et de l'administration de la lumière entre les différents groupes expérimentaux afin d'assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à d'autres souches bactériennes peut nécessiter une optimisation des conditions de formation du biofilm et de l'efficacité d'absorption du photosensibilisateur.
- Limite pratique : la sensibilité du biofilm peut varier selon la phase de croissance et la composition de la matrice, ce qui impose des contrôles rigoureux pour les études comparatives.
