Un modèle In Vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique véhiculée par 5-Acide aminolévulinique sur Staphylococcus aureus Biofilm

Ce manuscrit décrit un protocole afin d’étudier l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus . Ce protocole peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms bactériens par PDT à l’avenir.

L’objectif global de cette expérience est d’évaluer l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique médiée par l’acide cinq aminolévuliniques ou l’ALA sur un biofilm de staphylocoque doré. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du biofilm bactérien sur la façon dont la réparation cellulaire photodynamique pourrait être utilisée comme traitement alternatif pour contrôler les infections à biofilm. L’un des avantages de cette procédure est qu’elle peut être utilisée pour d’autres bactéries avec un ajustement minimal.

Pour générer un biofilm dans une plaque de 96 puits, inculquez d’abord un moins 80 degrés Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA trois cents dans trois cultures de souches cliniques formant un biofilm dans des tubes individuels à fond rond de 14 millilitres contenant cinq millilitres de bouillon de tryptone de soja, ou TSB, milieu, dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation pendant la nuit. Lorsque les cultures ont atteint la phase stationnaire, centrifugez les cellules bactériennes et mettez à nouveau en suspension les granulés et le PBS à une concentration de deux fois 10 à la neuvième unité formant une colonie par millilitre. Diluer ces suspensions bactériennes dans un rapport de un à 200 et un milieu TSB complété par du glucose à zéro virgule cinq pour cent et ensemencer 200 microlitres de cellules bactériennes par puits dans trois puits par souche par groupe expérimental dans une microplaque de 96 puits traitée par culture cellulaire de polystyrène pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius, avec de l’oxygène, sans trembler.

Le lendemain, lavez doucement les puits trois fois avec du PBS sans perturber les biofilms. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’ALA fraîchement préparé dans les puits expérimentaux appropriés et placez la plaque à 25 degrés Celsius pendant une heure à l’abri de la lumière. Ensuite, irradiez la plaque avec une diode électroluminescente à une intensité lumineuse de 100 milliwatts par centimètre carré pendant une heure.

Pour compter le nombre de bactéries viables par groupe à la fin du traitement de photothérapie, lavez doucement chaque puits trois fois avec du PBS pour éliminer toutes les cellules non adhérentes. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette, grattez les bactéries adhérentes au fond de chaque puits. Tirez les cellules de chaque groupe dans un tube d’Eppendorf selon les conditions expérimentales et granulez les cellules par centrifugation.

Remettez les granulés en suspension dans un millilitre d’enzyme pancréatine à 0,25 % et de PBS pour une incubation de 90 minutes à 37 degrés Celsius, suivie d’une autre centrifugation. Remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS et effectuez une à 10 dilutions en série de chaque groupe, en ajoutant cinq microlitres d’échantillon dilué en série sur des plaques individuelles de gélose tryptone soja. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures et comptez le nombre de colonies bactériennes par groupe.

Évaluer les biofilms par microscopie confocale à balayage laser, générer et irradier les biofilms comme démontré. Lavez les biofilms irradiés avec du PBS et colorez les cellules vivantes et mortes avec un millilitre d’un colorant perméable à la membrane des cellules nucléaires et procaryotes fluorescentes vertes et un millilitre d’iodure de propidium micromolaire, respectivement. Après 20 minutes, retirez l’excès de coloration et imagez les biofilms par microscopie confocale à balayage laser sous une lentille d’objectif à immersion dans l’huile 63 fois 1,4 NA.

La viabilité des bactéries du biofilm diminue après un double traitement par photothérapie ALA par rapport à la viabilité bactérienne du biofilm témoin simple ou non traité et aux quatre souches testées. La visualisation des biofilms par microscopie confocale à balayage laser confirme cette constatation, la plupart des cellules positives pour l’iodure de propidium étant observées dans le groupe de photothérapie double ALA. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ensemble de la manipulation des bactéries traitées à l’ALA doit être effectuée dans l’obscurité et que le biofilm du matériau doit être manipulé en douceur pour éviter de perturber le biofilm formé.

Ce message peut être appliqué pour explorer l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique sur le biofilm bactérien in vitro par les chercheurs dans le domaine de l’infection bactérienne.