Name: Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez l'analyse transcriptomique de Bacillus mycoides exposé aux exsudats racinaires de pomme de terre. Cette méthode identifie les gènes bactériens clés impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Jakob Viel pour ses précieux commentaires et suggestions. Nous remercions également Anne de Jong pour son aide dans l’analyse bio-informatique. Yanglei Yi et Li Zhibo sont pris en charge par le Conseil de bourse Chine (CSC). Nous remercions NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pour leur soutien financier à l’OPK.

1. germination des pommes de terre en Conditions stérilisées
<ol><li>Rincer la surface de la pomme de terre à l’eau stérile. Baigner la pomme de terre dans l’éthanol à 70 %, puis à l’hypochlorite de sodium 3 %, de 5 min chacun. Rincer à nouveau à l’eau stérile pour éliminer tout reste d’hypochlorite de sodium.</li>
	<li>Préparer le matériel nécessaire pour la germination et la croissance des tubercules de pomme de terre ; stériliser les pots en plastique, paniers de greffe, vermiculite et arrosez-les à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Remarque : Assurez-vous que tous les matériaux utilisés sont stérilisables en autoclave. Dans le cas contraire, utiliser d’autres méthodes de stérilisation.</li>
	<li>Mettre la pomme de terre stérilisées en surface dans le panier de la greffe et placez-la dans un pot stérilisé contenant de la vermiculite humide.</li>
	<li>Garder le pot dans une chambre climatique à 24 ° C pendant trois semaines. Réglez-le sur les cycles de 16 h de lumière (120 µmol m-2s-1) et 8 h d’obscurité. Pour éviter des contaminations microbiennes, utilisez une boîte de fibre de verre pour couvrir la casserole.</li>
</ol>2. collecte des exsudats racinaires de pommes de terre
<ol><li>Lorsque les pousses pousses, transfert le panier avec les pommes de terre entières dans un bécher stérile plein avec 150 mL d’eau désionisée autoclavé, avec la pomme de terre tubercules placés juste au-dessus de la surface de l’eau et les racines immergées dans l’eau (voir Figure 1). Maintenir le semis dans la chambre climatique et utiliser les mêmes paramètres que précédemment [24 ° C ; cycles de 16 h de lumière (120 µmol m-2s-1), 8 h d’obscurité].</li>
	<li>Depuis le deuxième jour, recueillir l’eau contenant les exsudats et remplir le bécher avec de l’eau désionisée stérile. Effectuer l’échantillonnage chaque jour jusqu’au septième jour après le transfert de la plantule.</li>
	<li>Stocker chaque échantillon séparément à 4 ° C. Pour chaque échantillon, répandre 100 µL sur un Luria-Bertani (LB, 1 % de tryptone, extrait de levure 0,5 %, 0,5 % NaCl) Gélose pour vérifier les contaminations microbiennes. Jeter les échantillons contaminés.</li>
	<li>Combinez les échantillons collectés d’un semis et les concentrer par lyophilisation eux à-40 ° C pour un volume final de 150 mL.</li>
</ol>3. croissance des bactéries
<ol><li>Ensemencer une souche de b. mycoides provenant d’un stock de glycérol de-80 ° C sur une gélose LB et incuber la plaque à 30 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Ensemencer un milieu liquide LB avec une seule colonie de la plaque et développer la culture dans un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant la nuit à 30 ° C.</li>
</ol>4. le traitement et l’échantillonnage des bactéries
<ol><li>Pour comparer la courbe de croissance de la bactérie traités avec les exsudats racinaires à un témoin négatif, préparer une série de fioles contenant 50 mL de milieu liquide LB. Ajouter 0,5 mL de la culture bactérienne pendant la nuit à tous les flacons et ajouter soit 0 %, 5 %, 10 % ou 15 % (v/v) racine exsudat ou eau désionisée stérile au milieu, respectivement.</li>
	<li>Utiliser une culture avec de l’eau désionisée au lieu d’exsudats racinaires comme un contrôle. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) toutes les 1 h par la suite. Générer une courbe de croissance en traçant les valeurs de600 OD par rapport au temps. Remarque : On a vu que 10 % des exsudats racine n’a pas affecté la croissance de b. mycoides (voir Figure 2) ; ce rapport a été utilisé pour des expériences de RNA-seq.</li>
	<li>Diluer une culture de b. mycoides nuitée avec 90 mL de préchauffé milieu LB à l’initiale de OD600 de ~ 0,05 dans un flacon de 300 mL. Ajouter 10 mL d’exsudats racinaires à la culture et il incuber à 30 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Utiliser un traitement de l’eau désionisée stérile 10 mL sous forme de contrôle. Prélever des cellules de la culture par centrifugation à 9 000 x g pendant 2 min à 4 ° C. Éliminer le liquide surnageant et immédiatement geler le culot dans l’azote liquide, puis conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>5. les ARN
Remarque : Avant de commencer l’isolement, préparer le workbench, grilles et pipettes en les nettoyant avec une solution de décontamination de RNase (voir Table des matières). Porter des gants en tout temps et s’assurer que tous les tubes, des conseils et des solutions sont sans RNase. Gardez toujours les échantillons sur la glace lorsque cela est possible.
<ol><li>Ajouter 0,1 % (v/v) de diéthyl pyrocarbonate (DEPC) à eau ultrapure (100 µL de DEPC par 100 mL de solution), mélanger bien et gardez-le à température ambiante pendant la nuit. Autoclave le mélange pour inactiver le CPDE après traitement au jour le jour. Cette eau ultrapure traitée DEPC permet de préparer le tampon TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8) ; 1 mM EDTA] et une solution de SDS (p/v) de 10 %.</li>
	<li>Décongeler les granules cellulaires sur la glace et suspendre chacun à 400 µL de tampon TE (DEPC). Transférer les suspensions dans les tubes de 2 mL bouchon à vis.</li>
	<li>Mélangez 300 µL d’alcool isoamylique-chloroforme (24:1 v/v) et 300 µL de phénol (acide phénol, RNA grade), puis laissez le mélange reposer pendant 5 min. Prendre 500 µL de la phase organique supérieure à ajouter aux cellules remises en suspension. Puis ajouter 50 µL de SDS de 10 % et 0,5 g de perles de verre (0,5 µm) dans le tube.</li>
	<li>Bien fermer le couvercle et placer le tube dans un homogénéisateur de moulin à billes (voir Table des matières). Effectuer une homogénéisation de pulse 3 × 45 s avec un intervalle de 1 min sur glace.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 11 000 x g (4 ° C) et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube.</li>
	<li>Ajouter 500 µL de chloroforme-isoamylique alcool (24:1) à la phase supérieure de l’étape 5.5 et centrifuger le mélange pendant 5 min à 11 000 x g (4 ° C). Remarque : Les étapes suivantes ont été modifiés depuis les instructions du fabricant d’un isolement basées sur le filtre commercial verre fibre nécessaire (voir la Table des matières).</li>
	<li>Transférer 500 µL de la phase supérieure dans un nouveau tube, ajouter 2 volumes (1 mL) d’un tampon de lyse/liaison et mélangez-le en pipettant également de haut en bas.</li>
	<li>Combiner les tubes filtre et collection (à partir du kit d’isolement d’ARN) et déposer le mélange de l’étape 5,7 au tube filtre. Centrifuger les tubes pendant 15 s à 8 000 x g et jeter le cheminement.</li>
	<li>Préparer le 1,5 mL tubes de microcentrifuge avec 100 µL de tampon de DNase, 10 µL de la DNase I et 5 µL d’un inhibiteur de RNase (voir Table des matières). Ajouter le mélange de la solution préparée sur le filtre du tube filtre et il incuber pendant 20-30 min à 15-25 ° C.</li>
	<li>Effectuez les étapes de lavage selon les instructions du fabricant. Utilisez 50 µL d’un tampon d’élution pour Éluer la RNA.</li>
	<li>Enregistrez l’ARN éluée à-80 ° C, puis mettre un film plastique paraffine autour d’elle. Dans le même temps, transférer quelques microlitres de l’échantillon dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour effectuer un contrôle de qualité.</li>
</ol>6. séquençage et contrôle qualité de l’ARN
<ol><li>Vérifier l’ARN avec un spectrophotomètre microvolume. NOTE : Taux d’absorption à 260/280 sera au-dessus de 1,8 et ratios à 260/230 doivent être supérieur au moins 1,8, préférence au-dessus de 2.0.</li>
	<li>Exécuter l’ARN purifié dans un instrument d’électrophorèse automatisée à l’aide de l’analyse de RNA recommander kit (voir Table des matières) ; le nombre d’intégrité RNA (RIN) doit être au moins supérieur à 7 à aller de l’avant.</li>
	<li>Utiliser un montant total de 3 µg d’ARN par exemple pour générer des bibliothèques avec une préparation de bibliothèque de RNA-Seq nécessaire (voir la Table des matières) suite aux recommandations du fabricant. NOTE : Les préparatifs de la bibliothèque ont été séquencés sur une plate-forme de séquençage haut-débit et jumelé-fin lectures ont été générés.</li>
</ol>7. analyse en utilisant le T-REx de Pipeline sur le Web
<ol><li>Effectuer un filtrage de qualité grâce au FASTX-Toolkit version 0.0.13 (scores de qualité de programme REDSP de > 20). Taillez les lectures brutes de RNA-Seq de séquences adaptateur via l’outil Trimmomatic. Remarque : Toutes les analyses en aval étaient fondés sur des données propres de haute qualité.</li>
	<li>Télécharger la base de données du génome de b. mycoides ATCC 6462 NCBI (adhésion NCBI no : CP009692.1) et l’utiliser comme un génome de référence pour la cartographie les lectures propres à l’aide de Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Utilisation HTSeq v0.6.1 pour compter le nombre de lectures mappé à chaque gène et les lectures par kilobases de transcription par million lectures mappés (RPKM) de chaque gène basée sur la longueur du gène et lectures comte mappée à ce gène.</li>
	<li>Pour l’analyse des données par le pipeline de T-REx, utiliser la table RPKM comme entrée, ainsi que trois fichiers descriptifs : (i) un fichier de facteurs pour décrire l’expérience en facteurs, (ii) un fichier de contrastes pour définir quels facteurs seront comparées pour l’expression différentielle des gènes et (iii) un fichier de classe pour décrire des groupes de gènes d’intérêt. Remarque : Les fichiers descriptifs sont au format in.txt. On trouvera des exemples sur la page Web de T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Une instruction détaillée pour l’analyse de données à l’aide de T-REx se trouvent dans une publication précédente de Jong et al. 14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Interactions plantes-microorganismes ont été hypothétiquement être déterminé par un équilibre finement réglé entre les bactéries et les plantes. Ces interactions sont très complexes et difficiles à étudier dans un système naturel, qui comprend diverses espèces microbiennes, potentiellement servir de consortiums. Cet article décrit un protocole simplifié pour étudier la réponse bactérienne d’exsudats racinaires dans des conditions bien contrôlées. Le profil de transcriptome de rhizobactéries, lors de l’exposition d’exsuda...

Les plantes peuvent exsudat jusqu'à 20 % du carbone fixé lors de la photosynthèse par racines dans la rhizosphère1, c'est-à-dire, la zone étroite du sol près des racines. En raison de la plus grande disponibilité des éléments nutritifs, la rhizosphère est un habitat adéquat pour les divers micro-organismes, y compris les bactéries favorisant la croissance des plantes. Les exsudats des racines contiennent une variété de composés inorganiques comme les ions, acides inorganiques, d’oxygène et d’eau. Cependant, la majorité des exsudats racinaires est formée par les matières organiques, qui peuvent être divisés en des composés de faible poids moléculaire et masse moléculaire élevée de composés. Les composés de faible poids moléculaire sont des acides aminés, acides organiques, sucres, composés phénoliques, acides gras et un tableau de métabolites secondaires. Les composés de poids moléculaire élevé sont constitués de mucilage et protéines,2,3. Micro-organismes de la rhizosphère peuvent utiliser certains de ces composés comme source d’énergie pour la croissance et le développement. Les exsudats des racines jouent un rôle important dans le façonnement de la communauté des rhizobactéries puisque les composés de produits végétaux dans les exsudats peuvent influencer le comportement de bactéries associées à la rhizosphère par affecter l’expression de gènes spécifiques.
Comprendre la réaction bactérienne d’exsudats racinaires est une étape clé de décryptage des mécanismes d’interaction plante-microbe. Car la réponse bactérienne aux interactions plantes-microorganismes est le produit de l’expression différentielle des gènes, elle puisse être étudiée par l’analyse du transcriptome. En utilisant cette méthode, des études antérieures identifié plusieurs gènes importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Pseudomonas aeruginosa, gènes impliqués dans le métabolisme, le chimiotactisme et type de sécrétion II étaient divulgués pour répondre à la racine de betterave à sucre exsudats4. Fan et al. 5 a étudié la transcriptomique profilage de b. amyloliquefaciens FZB42 en réponse à des exsudats racinaires de maïs. Leurs résultats montrent que les gènes fortement induites par les exsudats racinaires, plusieurs groupes sont occupent de voies métaboliques liés à l’utilisation des éléments nutritifs, chimiotactisme, motilité et non ribosomale synthèse de peptides antimicrobiens et polyketides.
L’exactitude de ces études repose sur la collecte des exsudats racinaires. Plusieurs méthodes ont décrit la collection d’exsudats racinaires à différentes fins, ils exigent des instruments sophistiqués ou ne sont pas exécutées dans des conditions bien contrôlées6,7,8. Par ailleurs, les micro-organismes inhibant la rhizosphère peuvent influencer racine exsudat composition en affectant la perméabilité de la membrane de cellules végétales et endommager les tissus de la racine, notamment dans le cas de consortiums de micro-organismes9. Lors d’enquêtes sur la réponse microbienne d’exsudats racinaires, il est important d’utiliser des conditions bien définies afin d’éviter l’altération des composés par d’autres microorganismes10. En outre, RNA de haute qualité est obligatoire pour RNA-seq basé des études du transcriptome. Toutefois, lorsqu’il s’agit des souches non modèle-bactérienne, les protocoles standard ou les kits commerciaux ont généralement un faible rendement en raison de facteurs inconnus ou propriétés de croissance spécial.
Le protocole décrit ici a été vérifié à l’aide de b. mycoides, qui est une bactérie Gram positive sporulé du phylum des Firmicute. Il est omniprésent dans la rhizosphère des diverses espèces végétales. Plusieurs propriétés promotion de la croissance végétale ont été signalées pour cette espèce, y compris l’induction de résistance systématique (ISR) dans la betterave à sucre11, inhibition du pathogène fonte Pythium pour concombre12, ainsi que d’azote fixation dans la rhizosphère tournesol13. Cependant, les mécanismes moléculaires de ses interactions avec une plante hôte ne sont pas bien étudiés.
L’objectif des expériences présentées ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère b. mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. En bref, le protocole se compose des étapes suivantes : tout d’abord, recueillir des exsudats racinaires de pommes de terre dans des conditions stériles. Ensuite, extrayez qualité RNA de cellules bactériennes, traités avec les exsudats racinaires. La dernière étape est l’analyse des données avec les webmail T-REx pipeline14. Ce protocole a été utilisé pour identifier les gènes de b. mycoides qui montrent un changement dans les niveaux d’expression au contact des exsudats racinaires et donc pourraient jouer un rôle important dans les interactions plantes-microorganismes.

<table><tbody><tr><td>hypochlorite de sodium</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; CAS : 7681-52-9&nbsp ;</td><td>10-15 % de chlore actif</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) bouillon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr> billes de verre <tr><td>d’azote</td><td></td><td></td><td></td>liquide</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &micro ; Tube m</td></tr><tr><td>de 2,0 ml avec bouchon</td><td></td><td></td> à vis <td>Sans RNase</td></tr><tr><td>Tube</td><td></td><td></td> eppendorf de 1,5 ml et 2,0 ml <td>Sans RNase</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de broyeur à billes</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS : 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS : 151-21-3&nbsp ;</td><td>Solution à 10 % préparée avec de l’eau MQ traitée au DEPC</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris-HCl ; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>phénol</td><td>Sigma</td><td></td><td>ARN grade</td></tr><tr><td>chloroforme-alcool isoamylique&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>préparer 24:1 de chloroforme :alcool isoamylique, conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Kit d’isolement d’ARN hautement pur</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Solution de décontamination RNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Instrument d’électrophorèse automatisé</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyseur</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre de microvolume</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>Kit d’analyse de la qualité de l’ARN <td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit Agilent</td><td>RNA 6000 Nano&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td> Bibliothèque d’ARN directionnelle <td></td></tr><tr><td>Kit de préparation</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>pour Illumina</td></tr></tbody></table>

interactions plantes-microorganismes : réponse transcriptionnelle de bacillus mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Bactéries associées aux plantes jouent un rôle important dans la promotion de la croissance et la prévention des maladies chez les plantes. L’application des rhizobactéries promotrices de la croissance de plantes (PGPR) biofertilisants ou biocontrol agents est devenu une alternative efficace à l’usage des engrais classiques et peut augmenter la productivité des cultures à faible coût. Interactions plantes-microorganismes dépendent des signaux sécrétée à la plante hôte et une réaction sur le connaissement par leurs bactéries associées. Cependant, les mécanismes moléculaires des bactéries bénéfiques comment répondent à leurs associés végétale signaux ne sont pas totalement comprises. Évaluation de la réponse de transcriptomique des bactéries aux exsudats racinaires est une approche puissante pour déterminer l’expression de gène bactérien et règlement conditions rhizosphérique. Une telle connaissance est nécessaire pour comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Cet article décrit un protocole détaillé pour étudier la réponse de transcriptomique de b. mycoides CE18, une souche isolée chez l’endosphère de pommes de terre, d’exsudats racinaires de pommes de terre. Avec l’aide des récentes technologies de séquençage haut débit, ce protocole peut être effectué en plusieurs semaines et les ensembles de données massives de produits. Tout d’abord, nous collectons les exsudats des racines dans des conditions stériles, après quoi ils sont ajoutés à des cultures de b. mycoides . L’ARN de ces cultures est isolé en utilisant une méthode phénol/chloroforme combinée avec une trousse commerciale et soumises à un contrôle de qualité par un instrument automatisé de l’électrophorèse. Après le séquençage, analyse des données est effectuée avec le pipeline de T-REx sur le web et un groupe de gènes différentiellement exprimés est identifié. Cette méthode est un outil utile pour faciliter les nouvelles découvertes sur les gènes bactériens impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.

Associées aux plantes micro-organismes peuvent influencer positivement la croissance des plantes et la santé. Cependant, les mécanismes d’interactions complexes entre les plantes et leurs symbiotes microbiens ne sont pas entièrement compris. Exsudats racinaires jouent un rôle important dans la régulation de l’activité des rhizobactéries et le comportement, et on suppose généralement que la colonisation microbienne des racines initie avec l’attraction des microbes d’exsudats racinaires. Le...

L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.

Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’interaction plantes-microbes. Vous pouvez, par exemple, identifier des gènes importants à partir de souches bactériennes qui ont été isolées de l’endosphère ou de la rhizosphère lors de l’interaction de la bactérie avec la plante. C’est une méthode polyvalente qui peut également être utilisée pour des études sur d’autres bactéries avec des plantes.Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’identifier dans une période relativement courte un grand nombre de gènes de bactéries importants lors des interactions plantes-microbes. Pour commencer cette procédure, rincez la surface de la pomme de terre à l’eau stérile. Baignez la pomme de terre dans de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes, puis dans de l’hypochlorite de sodium à 3 % pendant cinq minutes supplémentaires.Ensuite, rincez-le à nouveau à l’eau stérile pour éliminer tout hypochlorite de sodium restant. Ensuite, préparez le matériel nécessaire à la germination et à la croissance des tubercules de pomme de terre. Stérilisez les pots en plastique, les paniers de greffe, la vermiculite et l’eau en les autocavant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, mettez la pomme de terre stérilisée en surface dans le panier de greffe et placez-la dans un pot autoclavé contenant de la vermiculite humide. Utilisez une grande boîte en fibre de verre pour couvrir le pot afin d’éviter les contaminations microbiennes. Conservez le pot dans une chambre climatique à 24 degrés Celsius pendant trois semaines et réglez-le sur des cycles de 16 heures de lumière et 8 heures d’obscurité.Pour recueillir les exsudats de racine de pomme de terre, lorsque les pousses poussent, transférez le panier avec la pomme de terre entière dans un bécher stérilisé rempli de 150 millilitres d’eau désionisée autoclavée avec les tubercules de pomme de terre placés juste au-dessus de la surface de l’eau et les racines immergées dans l’eau. Gardez le semis dans la chambre climatique et utilisez les mêmes paramètres qu’auparavant. À partir du deuxième jour, récupérez l’eau contenant les exsudats et remplissez le bécher avec de l’eau stérile et déminéralisée.Conservez ensuite chaque échantillon séparément à quatre degrés Celsius. Pour chaque échantillon, étalez 100 microlitres sur une plaque de gélose Luria-Bertani pour vérifier les contaminations microbiennes. Jetez les échantillons contaminés.Combinez les échantillons collectés d’un plantule. Transférez ensuite les exsudats racinaires combinés dans des tubes de 50 millilitres. Congelez les tubes contenant les exsudats racinaires à moins 80 degrés Celsius.Concentrez-les en les lyophilisant à moins 40 degrés Celsius jusqu’à un volume final de 150 millilitres. Pour faire croître les bactéries, faites passer une souche de B. mycoides d’un stock de glycérol de moins 80 degrés Celsius sur une plaque de gélose LB et incubez la plaque à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, inoculez le milieu liquide LB avec une seule colonie de la plaque et cultivez la culture dans un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant la nuit à 30 degrés Celsius.Pour traiter et échantillonner les bactéries, diluez une culture de B. mycoides pendant la nuit avec 90 millilitres de milieu LB préchauffé jusqu’à la DO initiale 600 de zéro virgule zéro cinq dans une fiole de 300 millilitres. Par la suite, ajoutez 10 millilitres d’exsudats racinaires à la culture et utilisez un traitement à l’eau stérile et désionisée de 10 millilitres comme contrôle. Ensuite, incubez-les à 30 degrés Celsius pendant une heure.Au bout d’une heure, transférez la culture dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres. Prélever les cellules de la culture par centrifugation à 9 000 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et congelez immédiatement la pastille dans de l’azote liquide.Ensuite, conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour isoler l’ARN, décongelez les pastilles cellulaires sur de la glace et suspendez chacune d’entre elles dans 400 microlitres de tampon TE. Transférez ensuite les suspensions dans les deux tubes à bouchon à vis d’un millilitre.Ajoutez zéro virgule cinq grammes de perles de verre dans le tube. Ensuite, fermez fermement les bouchons et placez les tubes dans un homogénéisateur de broyeur à billes. Effectuez trois fois une homogénéisation d’impulsions de 45 secondes, avec un intervalle d’une minute sur glace.Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 11 000 fois G, et transférez la phase supérieure de chaque échantillon dans un nouveau tube. Ajoutez 500 microlitres de chloroforme : alcool isoamylique à la phase supérieure et centrifugez le mélange pendant cinq minutes à 11 000 fois G. Transférez ensuite 500 microlitres de la phase supérieure dans un tube frais. Ajoutez un millilitre de tampon de liaison à la lyse et mélangez-le en pipetant de haut en bas.Ensuite, préparez des tubes de microcentrifugation de cinq millilitres avec 100 microlitres de tampon DNase, 10 microlitres de DNase I et cinq microlitres d’un inhibiteur de RNase. Ajoutez le mélange de solution préparé sur le filtre des tubes filtrants et incubez-les pendant 20 à 30 minutes à 15 à 25 degrés Celsius. Par la suite, effectuez les étapes de lavage selon les instructions du fabricant et ajoutez 50 microlitres d’un tampon d’élusion dans le tube.Après centrifugation, éluer l’ARN. Transférez quelques microlitres de l’échantillon dans un tube à microcentrifuger de cinq millilitres pour effectuer un contrôle de qualité. Enfin, couvrez l’ARN éludé d’un film de paraffine plastique et maintenez-le à moins 80 degrés Celsius.Après la collecte, les exsudats racinaires ont été ajoutés à la culture de B. mycoides dans un rapport de 10 %, et l’ARN total bactérien a été isolé. L’ARN a ensuite été soumis à un contrôle de qualité par un instrument d’électrophorèse automatisé. Ces graphiques représentent l’ARN isolé de B. mycoides traités avec les exsudats racinaires, et ces graphiques représentent l’ARN isolé du groupe témoin.Tous les échantillons ont obtenu une valeur RIN supérieure à neuf, avec deux bandes claires correspondant aux sous-unités d’ARN 16S et 23S, démontrant qu’un ARN de haute qualité a été obtenu par ce protocole. Après la préparation de la bibliothèque, des lectures d’extrémité de paire ont été obtenues à l’aide d’une plate-forme de séquençage à haut débit. Les lectures brutes du séquençage de l’ARN ont été coupées des séquences adaptatrices et cartographiées par rapport à la séquence génomique de référence.L’analyse à domicile du transcrit a été réalisée avec le pipeline T-REx, et le graphique de l’intensité du rapport de tous les gènes exprimés de manière différentielle est montré ici. Une fois que le gène potentiellement important a été identifié, d’autres méthodes in vivo telles que la fusion du promoteur GFP, le cue-pews-air et l’hybridation fluorescente in situ peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le temps d’expression réservé de certains gènes lors de l’interaction avec la plante hôte.

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Yi, Y., et al. Interaction plante-microbe : réponse transcriptionnelle de Bacillus mycoides aux exsudats de racine de pomme de terre. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la préparation et le traitement de cultures de Bacillus mycoides pour étudier les interactions plantes-microbes. Il décrit les étapes allant de la strie d’une culture mère et de son incubation dans un milieu liquide à l’exposition des bactéries aux exsudats racinaires des plantes sous agitation. Le processus aboutit...

Traitement de bactéries avec des exsudats racinaires de plantes pour imiter in vitro les interactions plantes-microbes

L’agroinfiltration et l’agroinfection PVX sont des tests fonctionnels de routine pour l’expression ectopique transitoire des gènes dans les plantes. Ces méthodes sont des tests efficaces dans les stratégies effectoromiques (résistance rapide et découverte de gènes avirulence) et cruciales pour la recherche moderne en pathologie moléculaire des plantes. Ils répondent à la demande d’analyses fonctionnelles robustes à haut débit dans les usines.

Agroinfiltration et PVX Agroinfection dans la pomme de terre et Nicotiana benthamiana

Le système de cocultivation hydroponique décrit supporte des plantes intactes avec des écrans en mèches métalliques et les cocultive avec des bactéries. Les tissus végétaux, les bactéries et les molécules sécrétées peuvent ensuite être récoltées séparément pour des analyses en aval, permettant simultanément d'étudier les réponses moléculaires des hôtes de la plante et des microbes ou microbiomes en interaction.

Un système de co-culture hydroponique pour l&#39;analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

Nous présentons ici deux protocoles pour transformer les plantes de pomme de terre. La transformation par Agrobacterium tumefaciens mène à une plante transgénique complète tandis que l' Agrobacterium rhizogenes produit transgéniques racines velues lors d’un shooting de type sauvage pouvant être autonome propagés. Ensuite, nous détectons activité du promoteur par GUS coloration dans les racines transformées.

Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining

La méthode présentée crée des tissus végétaux naturels endommagés par l'herbivore grâce à l'application de larves de sexta de Manduca sur des feuilles détachées de pommes de terre. Le tissu végétal est mis en ligne pour l'expression de six homologs de facteur de transcription impliqués dans les réponses précoces à l'herbivorie d'insecte.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

MicroARN À base de virus de la pomme de terre X Silençage (VbMS) dans la pomme de terre.

Ce protocole présente un résumé détaillé des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. Exemple pour les champignons Verticillium longisporum et Verticillium dahliae, trois systèmes d’infection racinaire différents sont décrits. Les applications potentielles et les analyses en aval possibles sont mises en évidence, et les avantages ou les inconvénients sont discutés pour chaque système.

Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Nous présentons un protocole pour un système expérimental semi-hydroponique à base de verre supportant la croissance d’une variété de plantes phylogénétiquement distinctes avec ou sans microbes. Le système est compatible avec différents milieux de culture et permet un échantillonnage non destructif de l’exsudat racinaire pour une analyse en aval.

Un système de bocal en verre polyvalent pour le profilage de l’exsudat racinaire semi-hydroponique

Le protocole décrit l’infection des racines de Solanum tuberosum par des nématodes parasites des plantes dans des conditions de serre in vivo et des racines transgéniques de la pomme de terre in vitro pour l’analyse histochimique de la structure racinaire par microscopie optique.

Infection in vivo et in vitro des racines de pomme de terre par des nématodes parasites des plantes pour l’évaluation des changements structurels induits

Découvrez l'analyse transcriptomique de Bacillus mycoides exposé aux exsudats racinaires de pomme de terre. Cette méthode identifie les gènes bactériens clés impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.

Interactions plantes-microorganismes : Réponse transcriptionnelle de Bacillus Mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre

Explorer plus de vidéos