Name: Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Apprenez à produire des souris transgéniques par injection de vecteurs lentiviraux dans l'espace périvitellin. Cette méthode simple atteint plus de 70% d'intégration réussie chez les nouveau-nés.

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Nous remercions Magali Dumont et Rolando Meloni pour une lecture critique du manuscrit iVector et carottes ICM Phenoparc d’assistance technique dans la production vecteur lentiviral et respectivement au logement des animaux. Ce travail a été soutenu par l’Institut hospitalo-universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d’avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. a reçu de financement pour l’Association de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFÉDIAM) et un mixte FRDJ / INSERM grant.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
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<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX dans les ovocytes fécondés décrites ici a entraîné la production d’embryons transgéniques qui ont rapporté plus de 70 % d’embryons transgéniques par rapport au nombre total d’embryons collectés. Ce résultat est conforme aux précédents rapports et illustre la spécificité de la procédure2,7,10,11,12. En compara...

Le travail de pionnier de Gordon et coll. en 1980 ont montré qu’après l’implantation chez des souris pseudopregnant, l’injection d’ADN de plasmide dans pronucléus mâle d’ovocytes fécondés peut produire la production d’animaux transgéniques qui intègre la l’ADN de plasmide1. La démonstration que les mammifères transgéniques peuvent être générés a eu un impact énorme sur les sciences de la vie mondiales, ouvrant la voie aux nouveaux champs de recherche pour les sciences fondamentales et sciences biomédicales translationnelles. Au cours des quatre dernières décennies, la microinjection de DNA est devenu une pratique courante. Bien qu’un grand nombre de souris transgéniques ont été produit, la méthode standard n’est pas parfaitement utilisable pour toutes les souches de souris et fonctionne avec votre temps rétrocroisements2,3. Son application à d’autres espèces reste difficile4 et le rendement global de l’intégration des transgènes est limité à quelques pourcentage d’animaux né5. En outre, l’efficacité de l’intégration du transgène représente le facteur limitant qui explique le faible rendement global de pronucléaire injection d’ADN. À cet égard, les vecteurs viraux intégratives sont les outils les plus efficaces pour la marchandise et intègrent des transgènes et ainsi pourraient fournir de nouveaux moyens d’augmenter sensiblement le rendement de l’intégration, la seule limite étant que la taille du transgène qui ne doit pas dépasser 10Ko6 .
Les vecteurs LENTIVIRAUX Pseudo-aléatoire typés avec la protéine de l’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sont des outils de transfert de gène Pantropes et hautement intégrative et peuvent être utilisés pour transmettre des ovocytes fécondés7. La zone pellucide entourant les ovocytes est une barrière naturelle virus et doit être transmis pour permettre la transduction avec les vecteurs LENTIVIRAUX. Animaux transgéniques ont été générés par transduction ovocytes fécondés après forage au micro ou de la suppression de la zone pellucide8,9. Cependant, injection sous la zone pellucide dans l’espace périvitellin semble être la méthode la plus simple pour transmettre les œufs fécondés initialement décrite par les Lois et les collègues7.
L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX permet des rendements élevés dans la production d’animaux transgéniques qui sont plus de 70 % des animaux nés. Ce rendement est de plus de 10 fois plus élevée que le meilleur rendement possible qui peut être réalisé à l’aide de standard pronucléus ADN injection7,10,11. Dans ce contexte, une seule séance d’injections va générer au moins 50 fondateurs transgéniques (F0). Le grand nombre des fondateurs est, par conséquent, compatible avec phénotypage de l’effet de transgene directement effectuée sur des souris F0 sans la nécessité de produire des lignées de souris transgéniques. Cet avantage permet un dépistage rapide de l’effet du transgène et est spécifiquement adapté pour effectuer en vivo gain et perte de fonction dans les semaines. En outre, éléments régulateurs de l’ADN peuvent également être projetés rapidement pour mapper des exhausteurs et des motifs d’ADN liés par des facteurs de transcription11,12. Pour les injections pronucléaire, transgènes intègrent généralement en plusieurs copies dans un locus unique. Avec les vecteurs LENTIVIRAUX, intégration se produit dans plusieurs loci en un seul exemplaire par locus10,13. Par conséquent, la multiplicité des loci intégrée est probablement associée à la pénétrance de très haute expression observée chez les fondateurs transgéniques, qui rend le nouveau modèle généré plus robustes.
Ce qui est important, lorsque vous utilisez pronucléaire injection d’ADN, visualisation des pronucléi au cours de la procédure est absolument nécessaire. Cette limitation technique empêche l’utilisation d’ovocytes fécondés provenant d’une grande variété de souches de souris. Par conséquent, la production d’un modèle transgénique dans un spécifique de la souche pour laquelle pronucléus sont invisibles exige la production d’animaux dans une souche permissive suivie d’au moins 10 rétrocroisements successifs de transférer du transgène chez la souris désiré souche. Avec les injections de vecteur lentiviral, espace périvitellin est toujours visible, et l’injection ne nécessite pas de compétences très spécifiques. À titre d’exemple, les souris transgéniques NOD/SCID qui ne conviennent pas pour injection pronucléus ont été obtenus avec le vecteur viral injections14.
Un protocole complet est présenté ici, afin de permettre la simple production de souris transgéniques à l’aide d’injections de vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un embryon de scène une seule cellule. Transgene expression contrôlée soit omniprésente ou promoteurs spécifiques de la cellule est décrite en détail.
L’épine dorsale des gènes de pTrip ΔU3 a été utilisé dans cette étude de15. Ce vecteur permet de produire des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux de réplication dans lequel la séquence U3 a été partiellement supprimée pour supprimer l’activité du promoteur U3 et générer une inactivation automatique vector (SIN)16. Les stocks de vecteur lentiviral ont été produits par transfection transitoire des cellules HEK-293 t avec le p8.91 encapsulation plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, le pHCMV-G codant pour la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G17et le ΔU3 pTRIP vecteur recombinant. La procédure de production détaillé est fournie en tant que méthodes supplémentaires.
Production de stocks de vecteur lentiviral titre élevé est réalisée dans des conditions de biosécurité de niveau II (BSL-2). Cela est vrai pour la plupart des transgènes à l’exception des oncogènes qui doivent être produits au niveau de biosécurité 3. Par conséquent, la production dans des conditions de BSL-2 pour la plupart des cas est suffisante. En outre, l’utilisation et la production sont souvent déconnectés pour la plupart des organismes réglementaires nationales portant sur les organismes génétiquement modifiés (OGM). Une quantité limitée de réplication incompétent SIN vecteurs LENTIVIRAUX (en dessous de 2 µg de protéines de capside p24) peut être utilisée dans des conditions de BSL-1 tel que décrit par l’Office Français OGM en accord avec les recommandations de l’Union européenne.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de Pétri</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 puits Nunc Dish</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>Plat IVF</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 et micro ; m Filtre à seringue</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Enzyme 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td> testé sur <td>l’embryon de souris Insuline</td></tr><tr><td></td><td>sérum VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td> Moria <td>MC26</td><td></td>Ensembles de <td>tubes d’aspirateur</td></tr><tr><td>pour pipettes microcapillaires calibrées</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté Appareil</td> de <td>Harvard</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette horizontal</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Un éclairage de contraste à modulation Hoffman est nécessaire</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>Controler de maintien de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>testé sur l’embryon de souris</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Peut être utilisé pour injecter de l’ADN ou des vecteurs viraux</td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>pince Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas micro ciseaux</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100 % 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedine 120ml</td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Chlorhydrate de Trizma</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>poudre</td></tr><tr><td>protéinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bande de 8 tube PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur 96 puits</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque multipuits 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>instrument qPCR 384 puits</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

production de souris transgéniques par des gènes : une méthode simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Depuis près de 40 ans, injection d’ADN pronucléaire représente la méthode standard pour générer des souris transgéniques avec intégration aléatoire des transgènes. Une telle procédure systématique est largement utilisée dans le monde entier et sa principale limitation réside dans l’efficacité médiocre de l’intégration de transgene, ce qui entraîne un faible rendement des animaux fondateurs. Seulement quelques pour cent des animaux nés après l’implantation des ovocytes fécondés injectés ont intégré le transgène. En revanche, les vecteurs LENTIVIRAUX sont des outils puissants pour le transfert de gène intégrative et leur utilisation pour transmettre les ovocytes fécondés permet une production très efficace du fondateur de souris transgéniques avec un rendement moyen supérieur à 70 %. En outre, toute souche de souris peut être utilisé pour produire des animaux transgénique et la pénétrance d’expression du transgène est extrêmement élevée, supérieur à 80 % avec des gènes transgénèse médiée par rapport à la microinjection de DNA. La taille du fragment ADN qui peut être des marchandises par le vecteur lentiviral est limitée à 10 Ko et représente la limitation majeure de cette méthode. À l’aide d’un simple et facile à exécuter la procédure d’injection sous la zone pellucide des ovocytes fécondés, plus de 50 animaux fondateurs peut être produites en une seule séance de microinjection. Une telle méthode est très adaptée pour effectuer, directement aux animaux fondateurs, gain rapide et perte de fonction ou de régions d’ADN génomiques écran pour leur capacité à contrôler et réglementer gene expression in vivo.

Animaux transgéniques ont été générés en utilisant le protocole présenté ici. Représentant les résultats tant omniprésents et expression de transgene spécifiques de type de cellule sont illustrées.
Expression constitutive de transgènes
Promoteurs omniprésents sont des outils de recherche fondamentale pour exprimer des transgènes de façon soutenue et ef...

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Cette méthode permet un dépistage in vivo rapide chez la souris, de l’effet d’un transgène, et est spécifiquement adaptée pour effectuer des études de gain ou de perte de fonction, ainsi qu’une cartographie des motifs de réponse et d’ADN. Le principal avantage de cette technique, est que l’utilisation de prédiction des animaux transgéniques sont au-dessus de 70% du nouveau-né et peuvent être appliquées à toutes les souches de souris, y compris les animaux transgéniques. Après avoir euthanasié les souris, recueillir les oviductes.Pour commencer la chirurgie, utilisez des ciseaux pour faire une grande incision horizontale dans la cavité abdominale. Ensuite, localiser l’oviducte entre l’utérus et l’ovaire. Ensuite, utilisez des forceps incurvés pour enlever le mésometrium et la membrane avec les vaisseaux sanguins proéminents.Ensuite, séparez l’oviducte de l’ovaire et disséquez l’oviducte de l’ovaire. Puis, tirez sur l’oviducte et coupez loin de l’utérus. Transférer tous les oviductes collectés au milieu M2 à température ambiante.Lors de la manipulation des oviductes, veillez à éviter de toucher l’ampulla gonflée chargée d’œufs fécondés. Ensuite, ajoutez une goutte de 100 microlitres de solution de travail hyaluronidase à un plat de 10 centimètres. Ensuite, transférer les deux oviductes en elle, pour enlever les cellules cumulus des œufs.Sous un stéréomicroscope, utilisez une paire de seringues à insuline pour fixer l’oviducte tout en déchirant l’ampulla et en dispersant les œufs fécondés. Ensuite, utilisez une pipette en verre préparé avec tube et un embout buccal pour aspirer tous les oeufs. À l’aide de cet outil, transférez-les entre six gouttes de milieu M2 pour laver les cellules cumulus environnantes.Ensuite, transférer les œufs lavés dans un puits de 10 millimètres, dans une assiette de quatre puits, remplie de préchauffé avec M16. Ensuite, transférez le plat dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius. En préparation, centrifugeuse la suspension vectorielle lentivirale préparée à 160 g pendant deux minutes, pour granuler les débris souvent présents dans le stock lentiviral.Dans une armoire de sécurité de classe deux, transférez les supernatants dans un nouveau tube de 0,5 millilitre. Ensuite, chargez un microlitre de supernatant, dans une pipette d’injection. Ensuite, fixez la pipette d’injection au micromanipulateur latéral droit.Et fixez la pipette de fixation au micromanipulateur latéral gauche. Maintenant, distribuez huit microlitres de milieu M2 au centre de la glissade de dépression. Et couvrir d’huile de parafin léger pour éviter l’évaporation.Ensuite, placez 20 œufs dans les endroits peu profonds de la goutte sans créer de bulles. Ensuite, assurez-vous que la pointe de la pipette d’injection est ouverte. Sinon, appuyez sur la pipette d’injection avec la pipette de fixation pour l’ouvrir.Ensuite, réglez le microinjecteur pendant 20 secondes. Maintenant, en utilisant la pipette de fixation et la pression manuelle aspirer un ovule fécondé qui contient deux pronucléi et deux corps polaires. Ensuite, à l’aide de la pipette d’injection injecter l’espace périvitelline de l’œuf.Ne touchez pas la membrane plasmatique. Ajustez la pression de sorte que l’espace périvitelline soit rempli de solution. La pression ne doit pas dépasser 600 hecto pascals.Immédiatement après l’injection des 20 œufs, transférer le lot dans un bain de milieu M16 préchauffé. Et les incuber pendant au moins 30 minutes avant de les implanter. 16 heures après l’accouplement des femelles normales aux mâles avec des vasectomies, vérifiez les bouchons de copulation.Utilisez ces femelles pour l’implantation. Ensuite, faire des pipettes d’implantation avec un diamètre interne d’environ 150 microns. Et avec des pointes polies par la flamme qui mesurent environ quatre à cinq millimètres de long.Chargez une pipette avec de l’huile de parafin légère testée à l’embryon juste au-dessus du point d’épaule. Ensuite, aspirez une petite bulle d’air et chargez davantage la pipette avec le milieu M2. Ensuite, aspirez une deuxième bulle d’air.Maintenant, dessinez les embryons dans la pipette l’un derrière l’autre, en minimisant le volume de milieu entre les embryons. Terminer, en aspirant une très petite goutte d’huile de parafin d’un seul embryon de large. La préparation de la pipette de réimplantation est essentielle et nécessite beaucoup de pratique.Les oeufs dans la pipette doivent être alignés avec pratiquement aucun milieu entre eux. Ensuite, après anesthésier la souris et confirmer l’anesthésie avec une pincée d’un pied Raser deux, deux centimètres de bandes de cheveux le long de la moelle épinière au niveau de la dernière côte. Maintenant, placez la souris sur un coussin chauffant sur un champ stérile et drapez-la, laissant une fenêtre à la peau exposée.Ensuite, assainir la peau exposée avec des gommages alternatifs d’iodoprovidone et 70 pour cent d’éthanol. Pour l’implantation, faites d’abord une incision transversale d’un centimètre, puis faites glisser la peau latéralement jusqu’à ce que l’ovaire de couleur orange soit visible à travers la paroi du corps. Ensuite, faites une incision de cinq millimètres avec les ciseaux fins et ramasser la garniture de graisse avec une pince atraumatic bulldog.Une fois la garniture saisie, retirez l’ovaire, l’oviducte et le haut de l’utérus. Ensuite, localisez l’ampulla et faites une hémisection avec ciseaux vannas, sur le segment des oviductes qui relie l’ovaire à l’ampulla. Ensuite, introduire la pipette embryon de transfert et éjecter les œufs.Arrêt à la première bulle d’air après que les oeufs ont été libérés. Préparer les matériaux nécessaires pour répéter la procédure sur le deuxième oviducte. Et une fois terminé, fermez la peau avec des pinces à plaies.Immédiatement après la fermeture de la peau, injecter intraperitonealy analgésique et placer l’animal dans la chambre de récupération avec un élément de chauffage de 39 degrés Celsius. Surveillez jusqu’à ce qu’il soit complètement éveillé. L’animal transgénique ont été générés utilisant la méthode présentée.Un vecteur lentiviral de haut litre a été produit utilisant un exhausteur de base de 2,3 kilos pour neurogenin-3 pour conduire eGFP. Ou comme un contrôle, un fragment de chromosome six pour conduire eGFP. L’intégration dans les embryons a été assez réussie.À partir des embryons, le bourgeon pancréatique a été sectionné et immuno taché pour rechercher l’expression localisée de l’eGFP. Plus de 90 pour cent des vecteurs, avec l’exhausteur neurogenin-3, ont exprimé l’eGFP dans neurog3 exprimant des cellules. Cependant, aucun des vecteurs de lutte intégrés n’a exprimé eGFP dans le bourgeon pancréatique.Les sites d’intégration transgéniques ont été évalués par PCR quantitatif, en utilisant le gène CDX2 comme un contrôle. Le nombre moyen de sites d’intégration était d’environ 20 à l’aide de la construction Neurogenin-3, ou 10 en utilisant la construction de contrôle. Curieusement, le titer de transduction virale utilisé pour la construction Neurogenin-3, était environ le double du vecteur de lutte.Suggérant une relation entre le titer de transduction et le nombre d’intégrations. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un grand nombre d’embryons transgéniques fondateurs en utilisant l’injection périvitelline de vecteurs lentiviraux avec une grande efficacité. Une fois maîtrisée, cette technique peut produire jusqu’à 50 animaux fondateurs en un seul jour de microinjection, si elle est effectuée correctement.Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’injection pronucléaire d’ADN de titer peuvent être exécutées, afin d’établir des lignes transgéniques de souris. N’oubliez pas que le travail avec les vecteurs lentiviraux est soumis à l’autorisation de votre comité local d’OGM. Ces vecteurs peuvent être extrêmement dangereux et des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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