Name: Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Apprenez à produire des souris transgéniques par injection de vecteurs lentiviraux dans l'espace périvitellin. Cette méthode simple atteint plus de 70% d'intégration réussie chez les nouveau-nés.

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Nous remercions Magali Dumont et Rolando Meloni pour une lecture critique du manuscrit iVector et carottes ICM Phenoparc d’assistance technique dans la production vecteur lentiviral et respectivement au logement des animaux. Ce travail a été soutenu par l’Institut hospitalo-universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d’avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. a reçu de financement pour l’Association de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFÉDIAM) et un mixte FRDJ / INSERM grant.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
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<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX dans les ovocytes fécondés décrites ici a entraîné la production d’embryons transgéniques qui ont rapporté plus de 70 % d’embryons transgéniques par rapport au nombre total d’embryons collectés. Ce résultat est conforme aux précédents rapports et illustre la spécificité de la procédure2,7,10,11,12. En compara...

Le travail de pionnier de Gordon et coll. en 1980 ont montré qu’après l’implantation chez des souris pseudopregnant, l’injection d’ADN de plasmide dans pronucléus mâle d’ovocytes fécondés peut produire la production d’animaux transgéniques qui intègre la l’ADN de plasmide1. La démonstration que les mammifères transgéniques peuvent être générés a eu un impact énorme sur les sciences de la vie mondiales, ouvrant la voie aux nouveaux champs de recherche pour les sciences fondamentales et sciences biomédicales translationnelles. Au cours des quatre dernières décennies, la microinjection de DNA est devenu une pratique courante. Bien qu’un grand nombre de souris transgéniques ont été produit, la méthode standard n’est pas parfaitement utilisable pour toutes les souches de souris et fonctionne avec votre temps rétrocroisements2,3. Son application à d’autres espèces reste difficile4 et le rendement global de l’intégration des transgènes est limité à quelques pourcentage d’animaux né5. En outre, l’efficacité de l’intégration du transgène représente le facteur limitant qui explique le faible rendement global de pronucléaire injection d’ADN. À cet égard, les vecteurs viraux intégratives sont les outils les plus efficaces pour la marchandise et intègrent des transgènes et ainsi pourraient fournir de nouveaux moyens d’augmenter sensiblement le rendement de l’intégration, la seule limite étant que la taille du transgène qui ne doit pas dépasser 10Ko6 .
Les vecteurs LENTIVIRAUX Pseudo-aléatoire typés avec la protéine de l’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sont des outils de transfert de gène Pantropes et hautement intégrative et peuvent être utilisés pour transmettre des ovocytes fécondés7. La zone pellucide entourant les ovocytes est une barrière naturelle virus et doit être transmis pour permettre la transduction avec les vecteurs LENTIVIRAUX. Animaux transgéniques ont été générés par transduction ovocytes fécondés après forage au micro ou de la suppression de la zone pellucide8,9. Cependant, injection sous la zone pellucide dans l’espace périvitellin semble être la méthode la plus simple pour transmettre les œufs fécondés initialement décrite par les Lois et les collègues7.
L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX permet des rendements élevés dans la production d’animaux transgéniques qui sont plus de 70 % des animaux nés. Ce rendement est de plus de 10 fois plus élevée que le meilleur rendement possible qui peut être réalisé à l’aide de standard pronucléus ADN injection7,10,11. Dans ce contexte, une seule séance d’injections va générer au moins 50 fondateurs transgéniques (F0). Le grand nombre des fondateurs est, par conséquent, compatible avec phénotypage de l’effet de transgene directement effectuée sur des souris F0 sans la nécessité de produire des lignées de souris transgéniques. Cet avantage permet un dépistage rapide de l’effet du transgène et est spécifiquement adapté pour effectuer en vivo gain et perte de fonction dans les semaines. En outre, éléments régulateurs de l’ADN peuvent également être projetés rapidement pour mapper des exhausteurs et des motifs d’ADN liés par des facteurs de transcription11,12. Pour les injections pronucléaire, transgènes intègrent généralement en plusieurs copies dans un locus unique. Avec les vecteurs LENTIVIRAUX, intégration se produit dans plusieurs loci en un seul exemplaire par locus10,13. Par conséquent, la multiplicité des loci intégrée est probablement associée à la pénétrance de très haute expression observée chez les fondateurs transgéniques, qui rend le nouveau modèle généré plus robustes.
Ce qui est important, lorsque vous utilisez pronucléaire injection d’ADN, visualisation des pronucléi au cours de la procédure est absolument nécessaire. Cette limitation technique empêche l’utilisation d’ovocytes fécondés provenant d’une grande variété de souches de souris. Par conséquent, la production d’un modèle transgénique dans un spécifique de la souche pour laquelle pronucléus sont invisibles exige la production d’animaux dans une souche permissive suivie d’au moins 10 rétrocroisements successifs de transférer du transgène chez la souris désiré souche. Avec les injections de vecteur lentiviral, espace périvitellin est toujours visible, et l’injection ne nécessite pas de compétences très spécifiques. À titre d’exemple, les souris transgéniques NOD/SCID qui ne conviennent pas pour injection pronucléus ont été obtenus avec le vecteur viral injections14.
Un protocole complet est présenté ici, afin de permettre la simple production de souris transgéniques à l’aide d’injections de vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un embryon de scène une seule cellule. Transgene expression contrôlée soit omniprésente ou promoteurs spécifiques de la cellule est décrite en détail.
L’épine dorsale des gènes de pTrip ΔU3 a été utilisé dans cette étude de15. Ce vecteur permet de produire des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux de réplication dans lequel la séquence U3 a été partiellement supprimée pour supprimer l’activité du promoteur U3 et générer une inactivation automatique vector (SIN)16. Les stocks de vecteur lentiviral ont été produits par transfection transitoire des cellules HEK-293 t avec le p8.91 encapsulation plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, le pHCMV-G codant pour la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G17et le ΔU3 pTRIP vecteur recombinant. La procédure de production détaillé est fournie en tant que méthodes supplémentaires.
Production de stocks de vecteur lentiviral titre élevé est réalisée dans des conditions de biosécurité de niveau II (BSL-2). Cela est vrai pour la plupart des transgènes à l’exception des oncogènes qui doivent être produits au niveau de biosécurité 3. Par conséquent, la production dans des conditions de BSL-2 pour la plupart des cas est suffisante. En outre, l’utilisation et la production sont souvent déconnectés pour la plupart des organismes réglementaires nationales portant sur les organismes génétiquement modifiés (OGM). Une quantité limitée de réplication incompétent SIN vecteurs LENTIVIRAUX (en dessous de 2 µg de protéines de capside p24) peut être utilisée dans des conditions de BSL-1 tel que décrit par l’Office Français OGM en accord avec les recommandations de l’Union européenne.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de Pétri</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 puits Nunc Dish</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>Plat IVF</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 et micro ; m Filtre à seringue</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Enzyme 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td> testé sur <td>l’embryon de souris Insuline</td></tr><tr><td></td><td>sérum VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td> Moria <td>MC26</td><td></td>Ensembles de <td>tubes d’aspirateur</td></tr><tr><td>pour pipettes microcapillaires calibrées</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté Appareil</td> de <td>Harvard</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette horizontal</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Un éclairage de contraste à modulation Hoffman est nécessaire</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>Controler de maintien de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>testé sur l’embryon de souris</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Peut être utilisé pour injecter de l’ADN ou des vecteurs viraux</td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>pince Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas micro ciseaux</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100 % 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedine 120ml</td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Chlorhydrate de Trizma</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>poudre</td></tr><tr><td>protéinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bande de 8 tube PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur 96 puits</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque multipuits 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>instrument qPCR 384 puits</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

production de souris transgéniques par des gènes : une méthode simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Depuis près de 40 ans, injection d’ADN pronucléaire représente la méthode standard pour générer des souris transgéniques avec intégration aléatoire des transgènes. Une telle procédure systématique est largement utilisée dans le monde entier et sa principale limitation réside dans l’efficacité médiocre de l’intégration de transgene, ce qui entraîne un faible rendement des animaux fondateurs. Seulement quelques pour cent des animaux nés après l’implantation des ovocytes fécondés injectés ont intégré le transgène. En revanche, les vecteurs LENTIVIRAUX sont des outils puissants pour le transfert de gène intégrative et leur utilisation pour transmettre les ovocytes fécondés permet une production très efficace du fondateur de souris transgéniques avec un rendement moyen supérieur à 70 %. En outre, toute souche de souris peut être utilisé pour produire des animaux transgénique et la pénétrance d’expression du transgène est extrêmement élevée, supérieur à 80 % avec des gènes transgénèse médiée par rapport à la microinjection de DNA. La taille du fragment ADN qui peut être des marchandises par le vecteur lentiviral est limitée à 10 Ko et représente la limitation majeure de cette méthode. À l’aide d’un simple et facile à exécuter la procédure d’injection sous la zone pellucide des ovocytes fécondés, plus de 50 animaux fondateurs peut être produites en une seule séance de microinjection. Une telle méthode est très adaptée pour effectuer, directement aux animaux fondateurs, gain rapide et perte de fonction ou de régions d’ADN génomiques écran pour leur capacité à contrôler et réglementer gene expression in vivo.

Animaux transgéniques ont été générés en utilisant le protocole présenté ici. Représentant les résultats tant omniprésents et expression de transgene spécifiques de type de cellule sont illustrées.
Expression constitutive de transgènes
Promoteurs omniprésents sont des outils de recherche fondamentale pour exprimer des transgènes de façon soutenue et ef...

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Cette méthode permet un dépistage in vivo rapide chez la souris, de l’effet d’un transgène, et est spécifiquement adaptée pour effectuer des études de gain ou de perte de fonction, ainsi qu’une cartographie des motifs de réponse et d’ADN. Le principal avantage de cette technique, est que l’utilisation de prédiction des animaux transgéniques sont au-dessus de 70% du nouveau-né et peuvent être appliquées à toutes les souches de souris, y compris les animaux transgéniques. Après avoir euthanasié les souris, recueillir les oviductes.Pour commencer la chirurgie, utilisez des ciseaux pour faire une grande incision horizontale dans la cavité abdominale. Ensuite, localiser l’oviducte entre l’utérus et l’ovaire. Ensuite, utilisez des forceps incurvés pour enlever le mésometrium et la membrane avec les vaisseaux sanguins proéminents.Ensuite, séparez l’oviducte de l’ovaire et disséquez l’oviducte de l’ovaire. Puis, tirez sur l’oviducte et coupez loin de l’utérus. Transférer tous les oviductes collectés au milieu M2 à température ambiante.Lors de la manipulation des oviductes, veillez à éviter de toucher l’ampulla gonflée chargée d’œufs fécondés. Ensuite, ajoutez une goutte de 100 microlitres

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Génération induites pluripotentes (cellules souches iPSC) lignes produit des lignes de différentes potentiel de développement, même quand ils passent des tests standard pour la pluripotence. Nous décrivons ici un protocole de produire des souris provenant entièrement de iPSCs, qui définit les lignes iPSC comme possédant la pluripotence...

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Source : Zhang, Y., et al., Reprogrammation directe de fibroblastes de souris en mélanocytes. J. Vis. Exp. (2021)Ce vidéo montre la production et la concentration de lentivirus recombinants dans des cellules de mammifères, permettant une livraison efficace de gènes de facteurs de transcription ou d'autres éléments génétiques pour des applications telles que le reprogrammation cellulaire, des études fonctionnelles et des recherches thérapeutiques potentielles.

Génération de lentivirus recombinants dans des cellules mammaliennes

Source : Chiarella, A. M. et. al., Répression de la transcription génique en redirigeant le mécanisme cellulaire à l’aide de modificateurs épigénétiques chimiques. J. Vis. Exp. (2018)Ce vidéo montre la génération de cellules souches embryonnaires de souris génétiquement modifiées par transduction lentivirale. Les particules lentivirales délivrent un marqueur de résistance aux antibiotiques, permettant l'intégration génomique stable et la sélection des cellules transduites.

Génération de cellules souches embryonnaires de souris infectées par un lentivirus

Cette vidéo décrit l’injection pronucléaire de vecteurs lentiviraux dans l’espace périvitellin d’un embryon de souris fécondé. Le lentivirus contient le transgène, qui est incorporé dans le génome de l’embryon fécondé, donnant finalement naissance à des souris transgéniques.

Injection de périvitelline à base de vecteur lentiviral : une méthode pour transduire le gène d’intérêt dans des ovocytes de souris monocellulaires fécondés

Cette vidéo démontre le marquage viral et la transplantation de cellules d’éminence ganglionnaire médiale (MGE) pour des études in vivo. Il décrit les étapes impliquées dans la transduction des cellules MGE avec un rapporteur viral, la transplantation de ces cellules transduites dans le cortex d’un bébé souris et la possibilité de l’expression du rapporteur dans des sous-types spécifiques d’interneurones.

Marquage et transplantation à médiation virale de cellules d’éminence ganglionnaire médiale pour des études in vivo

Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d'un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer...

Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l&#39;évaluation du résultat comportemental

Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.

Oeufs fécondés de livraison assistée par laser des gènes gène aux souris

Cet article vise à fournir la méthodologie pour la transgenèse lentivirale chez les embryons de rats à l’aide d’injections multiples d’une suspension de virus dans l’espace périvitelline zygote. Les rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est employée pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.

Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Apprenez à produire des souris transgéniques par injection de vecteurs lentiviraux dans l'espace périvitellin. Cette méthode simple atteint plus de 70% d'intégration réussie chez les nouveau-nés.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

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