Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade

Contamination pendant le séquençage génomique des organismes microscopiques demeure un grand problème. Ici, nous montrons une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade un seul spécimen avec aussi peu que 50 pg d’ADN génomique sans amplification du génome entier pour minimiser le risque de contamination.

L’objectif de ce protocole est de séquencer le génome d’un organisme microscopique appelé tardigrades. Nous avons mis au point une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade, Hypsibius dujardini, à partir d’un seul spécimen avec aussi peu que 50 picogrammes d’ADN génomique avec une application du génome entier. Après avoir isolé un seul tardigrade, nous minimisons la contamination bactérienne en utilisant des antibiotiques et une inspection visuelle.

Nous avons également utilisé deux méthodes d’homogénéisation. D’abord, et le plus souvent utilisé chez C. elegans à l’aide de cycles de congélation et de décongélation, et deuxièmement, un broyage manuel du tardigrade avec une pointe de pipette. L’ADN est ensuite utilisé pour construire une banque de séquençage, puis est séquencé dans un instrument MiSeq.

Un résumé général du protocole. Après l’isolement d’un seul individu, il est soumis à trois cycles de congélation et de décongélation pour l’homogénéisation. L’ADN génomique est extrait et purifié et est fragmenté par sonication.

Ensuite, une bibliothèque de séquençage est construite, et après validation de la distribution de la taille de la bibliothèque, elle est séquencée avec un instrument de séquençage. Préparez un gel d’agarose à 2 % en utilisant de l’eau distillée comme solvant dans une boîte de culture en plastique de 90 millimètres, et 10 millimètres de streptomycine à 1 % de pénicilline avec de l’eau distillée. Le gel peut être conservé pendant deux à trois semaines dans un incubateur réglé à 18 degrés.

Prélevez un seul tardigrade et placez-le sur la plaque de gélose préparée, puis lavez-le à l’eau distillée deux à trois fois pour éliminer les particules restantes. Placez le tardigrade unique dans des antibiotiques à base de pénicilline streptomycine pendant deux à six heures pour éliminer la contamination bactérienne, et placez l’animal décontaminé sur une lame de verre propre à l’aide d’une pipette P10. Observez le tardigrade au microscope à un grossissement de 500 fois et confirmez qu’il n’y a pas de bactéries restantes.

Prélever l’individu à l’aide d’une pipette P10 avec un maximum de cinq microlitres de liquide, et le placer dans un tube PCR à faible liaison, et retirer l’excès de liquide autant que possible. Homogénéisation et extraction d’ADN. Homogénéiser l’animal pour obtenir de l’ADN génomique avec l’une des méthodes suivantes.

Homogénéisation avec cycles de congélation et de décongélation. Immédiatement après l’étape 2.5, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse dans le tube PCR contenant le tardigrade. Placez le tube PCR dans de l’azote liquide pendant 10 minutes et déplacez-le vers un bloc de chaleur, chaud à 37 degrés pendant 10 minutes.

Répétez cette étape trois fois. Broyage manuel. Sous un stéréomicroscope, écrasez l’individu avec une pointe de pipette P10 en appuyant l’animal contre la paroi du tube PCR, et ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon de lyse.

Incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour que la lyse se produise. Transférez le volume complet du mélange de lyse dans un microtube propre de 1,5 millilitre à faible liaison. Ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse dans le tube PCR à faible liaison, qui est utilisé pour l’homogénéisation et est maintenant vide.

Et après le pipetage, transférez le mélange dans 1,5 microtube à faible liaison. Répétez cette étape deux fois. Ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse dans un tube PCR à faible liaison, et après le pipetage, déplacez le mélange dans un microtube à faible liaison de 1,5 millilitre.

Ajouter le total de 600 microlitres de mélange de lyse dans la colonne de centrifugation placée dans le tube de collecte et centrifuger à 10 000 G pendant une minute. Réappliquez le débit dans la colonne et centrifugez à 10 000 G pendant une minute. Cette étape est essentielle pour s’assurer que la majeure partie de l’ADN génomique est liée à la colonne.

Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage dans la colonne d’essorage et centrifugez à 10 000 G pendant une minute. Transférez la colonne de centrifugation dans un microtube propre de 1,5 millilitre. Appliquez 20 microlitres de 10 millimolaires de premier LCA sur la colonne de centrifugation et attendez cinq minutes à température ambiante.

Centrifuger à 10 000 G pendant une minute. Le tampon de dilution ne doit pas contenir d’EDTA, car il interfère avec les enzymes de préparation en laboratoire. Réappliquez le flux dans la colonne de spinning, et après cinq minutes d’incubation à température ambiante, centrifugez pendant une minute à 10 000 G. Construction de la bibliothèque de séquençage.

Fragmentation de l’ADN. Transférez 15 microlitres d’éluée d’ADN génomique dans un microtube de 15 microlitres pour la fragmentation de l’ADN, et centrifugez pendant une minute à l’aide d’une centrifugeuse de table. Fragmentez l’ADN génomique en 550 paires de bases.

Après le pipetage, transférez 10 microlitres de mélange d’ADN fragmenté dans un tube PCR propre et à faible liaison. L’expérience peut être arrêtée ici. Préservez l’ADN à quatre ou moins 20 degrés.

Construction de bibliothèques de séquençage. Il est absolument essentiel d’utiliser le kit spécifié dans les procédures suivantes, en raison de la faible teneur en ADN d’entrée. Préparez les réactifs requis, en suivant le protocole du fabricant, et construisez la bibliothèque de séquençage sans aucune modification.

Après avoir appliqué un mélange d’amplification de banque à un mélange de synthèse de bibliothèque, effectuez une réaction PCR dans un thermocycleur. La réaction PCR a été réalisée comme indiqué. Purification de la réaction PCR.

Ajoutez 50 microlitres de billes magnétiques et pipetez 10 fois, puis centrifugez brièvement avec une micro-centrifugeuse de table. Incuber pendant deux minutes à température ambiante. Incuber sur support magnétique pendant cinq minutes, ou jusqu’à ce que la solution devienne complètement claire, et retirer le surnageant.

Suivez le protocole du fabricant. Transférez le surnageant sans déranger la pastille dans un nouveau tube PCR à faible liaison. Contrôle de la qualité et quantification de l’ADN, et séquençage.

Validation de la distribution de la taille des banques d’ADN. Ajoutez trois microlitres d’échantillon d’eau avec un microlitre de bibliothèque de séquençage, et mélangez soigneusement pendant une minute avec un vortex, et centrifugez brièvement avec une centrifugeuse de table. Effectuer l’électrophorèse et valider la distribution de la taille de la bibliothèque avec le logiciel associé.

Le pic de fragment principal devrait se situer entre 300 et 1 000 paires de bases. Quantification de l’ADN. Ajoutez 796 microlitres de tampon de solution et quatre microlitres de réactif de fluorescence et mélangez soigneusement.

Distribuez 190 microlitres de la solution de travail dans deux tubes de dosage et 197 microlitres dans un tube de test. Ajouter 10 microlitres d’étalons avec des concentrations connues d’ADN dans chaque tube d’essai contenant 190 microlitres de solution de travail, et trois microlitres de la bibliothèque préparée dans un tube d’essai contenant 197 microlitres de solution de travail. Vortex brièvement, et centrifuger sur la centrifugeuse de table.

Quantifiez l’ADN à l’aide d’un fluorimètre avec trois réglages de microlitres. Séquençage de la banque d’ADN. Préparez la bibliothèque de séquençage en fonction du protocole du fabricant.

Placez la cassette de réactifs et la cellule d’écoulement dans l’instrument de séquençage, puis entrez les informations de déroulement du séquençage, en suivant le protocole du fabricant. Exécuter le séquençage. Résultats représentés.

L’exposition des contaminants dans l’extraction d’ADN de haute qualité reste le point critique de notre protocole. Pour examiner visuellement s’ils sont contaminants, nous avons incubé le tardigrade dans des antibiotiques, qui sont la pénicilline et la streptomycine, et nous avons également examiné l’individu au microscope 500 fois. Comme indiqué ici, les microbes visibles autour des tardigrades sont complètement éclairés.

Après une homogénéisation, une extraction d’ADN, une fragmentation et une préparation de banque efficaces. La distribution de taille de la bibliothèque est validée à l’aide d’une électrophorèse à haute sensibilité pour le contrôle de la qualité. Les lignes violettes et vertes indiquent les marqueurs supérieurs et inférieurs à 1, 500 et 25 paires de bases respectivement.

Le couloir L est un marqueur d’échelle, le couloir S et le couloir N1 à N4 sont cinq répliques de la même expérience, tous partant d’un seul spécimen de tardigrade. Comme on peut le voir à partir de l’uniforme large et de la distribution entre 200 et 1 000 paires de bases, notre protocole est hautement reproductible, même avec une entrée ultra-faible. Voici le résultat d’un contrôle qualité rapide, pour des lectures synchronisées obtenues à partir d’une seule exécution de séquençage.

Les lectures sont obtenues en tant qu’extrémités de rechange de 300 paires de bases, où les lectures avant et arrière sont indiquées en haut et en bas, respectivement. La distribution illustrée ici est typique des lectures de fin de 300 paires, avec des appels de base de très haute qualité au-dessus de Q30 pour les 200 premières paires de bases, et diminuant progressivement jusqu’à la fin. Cette méthode n’utilise donc qu’un seul individu pour un échantillon.

Il n’y a pas d’exigences pour des quantités massives d’animaux, comme celles requises dans les précédents projets de séquençage du génome des tardigrades. Les méthodes d’élevage de la plupart des tardigrades n’ont pas encore été établies. Par conséquent, permettre le séquençage génomique d’un seul individu, comme ceux qui proviennent directement du travail de terrain, aura un impact important sur la biologie moléculaire des tardigrades, et peut-être pour d’autres petits animaux.

Nos méthodes de séquençage de l’ADN permettent d’analyser de nombreux autres organismes microscopiques qui n’ont pas encore été séquencés, tels que des espèces rares de berce du Caucase, des nématodes, des sapins d’eau et d’autres options, en reliant la partie des zones et une zone publique plus large, favorisant ainsi le cadre où divers mécanismes biologiques peuvent être possibles.