Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

L’objectif global de ce protocole est de fournir un accès aux yeux de poulet embryonnaires dans un cadre in vitro afin de permettre une étude approfondie des voies de développement complexes dans l’embryon. Chez le poulet embryonnaire, l’étude de l’œil est souvent difficile, en raison du développement des paupières, du mouvement de l’embryon et de la croissance de tissus embryonnaires supplémentaires. Des composés tels que les médicaments et les inhibiteurs peuvent également avoir des effets létaux sur l’embryon, ce qui rend difficile l’utilisation de ces composés pour moduler les voies génétiques.

Les progrès de la culture tissulaire in vitro ont permis aux scientifiques d’isoler ces tissus et d’éliminer bon nombre de ces barrières susmentionnées. Notre protocole est avantageux en ce sens qu’il nous permet d’étudier l’œil dans son ensemble, y compris tous les tissus qui ont le potentiel d’interagir au cours du développement, tels que la rétine neurale et l’épithélium pigmenté rétinien. Commencez par autoclaver les matériaux pour vous assurer que toutes les solutions et tous les équipements sont stériles avant la procédure.

Pour ce faire, autoclavez deux litres d’eau distillée et un litre de sérum physiologique pour poussins, ainsi qu’une boîte de mouchoirs, du papier filtre semi-poreux, un treillis métallique, des récipients d’eau et des pipettes en verre jetables. Stérilisez soigneusement les étagères et la porte de l’incubateur avec de l’éthanol à 70 %, puis remplissez les récipients avec de l’eau distillée autoclavée et préchauffez l’incubateur à 37 degrés Celsius. Préchauffez le milieu nutritif, ainsi qu’un tube de l’antibiotique pénicilline streptomycine dans l’incubateur.

Posez une serviette en papier sur l’espace de travail et stérilisez avec de l’éthanol à 70 %. Stérilisez toutes les pinces et les ciseaux. Avec la tête de poulet dans une solution saline de poussin autoclave, coupez la tête de poussin en deux sur la ligne médiane, en laissant un peu de tissu intact autour de chaque œil.

Le tissu supplémentaire aidera l’œil à maintenir une certaine tension dans la culture, tout en aidant à l’absorption des nutriments dans tout l’œil et en empêchant l’œil de glisser du papier filtre. Ces tissus servent également de repères lors de l’orientation de l’œil lors d’une analyse ultérieure. Laissez le tissu disséqué dans une solution saline de poussin à température ambiante pendant la préparation de la culture.

Préparez le plat de culture. Placez deux boîtes de Pétri de 35 millimètres dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Placez un étage de treillis métallique dans chaque petit plat.

Placez la demi-tête avec l’œil sur un morceau de papier filtre, en l’inclinant légèrement pour éviter que l’œil ne glisse sur le papier. Transférez le mouchoir et le papier filtre dans la petite boîte de Pétri au-dessus de l’étage du treillis métallique. Répétez l’opération avec l’autre demi-tête du même embryon.

Ajoutez du milieu de culture dans chacune des deux petites boîtes de Pétri. Amenez le support au niveau du papier de soie. Ne plongez pas le tissu dans le milieu.

Ajoutez 50 microlitres de la solution mère d’antibiotique pénicilline streptomycine au milieu nutritif de chaque plat afin de prévenir l’infection bactérienne. Placez un morceau de tissu mince plié sur le bord intérieur de la boîte de Pétri plus grande et humidifiez-le avec de l’eau distillée. Incuber la culture dans l’incubateur sombre à 37 degrés Celsius pendant quatre jours maximum.

Après la culture, retirer le tissu du papier filtre et le fixer dans 4 % de paraformaldéhyde. La première colonne montre un œil HH34, représentant l’œil embryonnaire du poussin au début de la culture. La deuxième colonne montre un œil de poussin embryonnaire cultivé pendant quatre jours, à partir de HH34.

La troisième colonne montre un œil HH38, ce qui correspond à quatre jours de développement in-ovo au-delà de HH34. Les panneaux A à F ne sont pas colorés, tandis que les panneaux G à I sont colorés pour l’enzyme phosphatase alcaline. La rangée du haut, panneaux A à C, montre que l’œil continue à se développer tout au long de la culture, comme en témoignent l’apparition de bourgeons de plumes et la croissance des paupières, indiquée par des flèches dans chaque panneau.

La rangée du milieu, panneaux D à F, montre que les papilles conjonctivales commencent à dégénérer en culture. La rangée du bas, panneaux G à I, montre que le modèle spatio-temporel de l’induction de l’osselet scléral est maintenu en culture, servant d’exemple de voie de développement qui peut être étudiée à l’aide de cette méthode. Ce protocole permet aux tissus de maintenir les principaux aspects spatiaux et temporels du développement tout au long de la culture.

Ce protocole représente une avancée clé dans la culture d’organes sensoriels entiers, fournissant une méthodologie alternative pour étudier les voies de développement complexes impliquées.