Name: Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez la RT-PCR multiplex monocellulaire après patch-clamp pour analyser l'expression génique dans des neurones pyramidaux de couche cinq. Cette méthode permet d'étudier la diversité moléculaire et les fonctions neuronales.

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Nous remercions le Dr Alexandre Mourot pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003 ; ANR-15-CE16-0010 et ANR-17-CE37-0010-03), BLG est pris en charge par la bourse de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Nous remercions l’animalerie de le couples (Paris, France).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Single cell RT-PCR multiplex après que patch clamp peut sonder, simultanément et de manière fiable, l’expression de plus de 30 gènes dans les cellules identifiées rhinophore5. Analyse de l’expression des gènes au niveau de la cellule unique nécessite des amorces PCR hautement efficaces. Une des étapes plus limitants est la collection de contenu de la cellule. Son efficacité dépend du diamètre de l’embout de la pipette de patch, qui doit être aussi large que possible tout en correspondant à la tail...

Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules impliquées dans divers processus physiologiques. Leur identification et leur caractérisation, une condition préalable à la compréhension de leurs fonctions spécifiques, peuvent être très difficiles étant donné la grande diversité morphologique, physiologique et moléculaire qui caractérise les cellules corticales types1 ,2,3,4.
Single-cell RT-PCR multiplex repose sur la combinaison de patch clamp et techniques de RT-PCR. Il peut sonder simultanément l’expression de plus de 30 gènes prédéfinis dans les cellules identifiées rhinophore5. L’inclusion d’un traceur neuronale dans la pipette d’enregistrement supplémentaires permet la caractérisation morphologique des cellules enregistrés après la révélation histochimiques6,7,8,9, 10. c’est une technique très utile pour la classification des types neurones basée sur une analyse multivariée de leurs caractères phénotypiques5,9,10,11,12 ,13,14. Monocellulaire de RT-PCR multiplex est également adapté à la caractérisation des cellules non neuronales comme les astrocytes15,16,17et peut être appliqué de manière pratiquement à chaque cerveau structure18, 19,20,21,22,23 et cellule de type, en supposant qu’ils peuvent être enregistrés dans la configuration de la cellule entière.
Cette technique est très pratique pour l’identification des sources cellulaires ou cibles de transmission systèmes7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, surtout quand les anticorps spécifiques font défaut. Il s’appuie sur des enregistrements de patch clamp de cellules identifiées visuellement29et donc permet également le ciblage des cellules dans un environnement cellulaire spécifique8,15,16. En outre puisque la cytoarchitecture du tissu cérébral est conservé dans des tranches de cerveau, cette approche permet également l’étude des relations anatomiques des cellules caractérisés avec éléments neuronaux et non neuronales7,8 , 18.
Puisque cette technique est limitée par la quantité de cytoplasme récolté et de l’efficacité de la RT, la détection des ARNm exprimée au nombre de copies basse peut être difficile. Bien que les autres approches basées sur la technologie RNaseq permettent d’analyser le transcriptome entière de cellules individuelles3,4,30,31, dont ils ont besoin les coûteux séquenceurs haut débit pas nécessairement disponible pour chaque laboratoire. Étant donné que la technique de RT-PCR multiplexe unicellulaire utilise PCR point final, il suffit de thermocycleurs largement disponibles. Il peut être facilement développé dans des laboratoires équipés avec des configurations électrophysiologiques et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il peut fournir, dans la journée, une analyse qualitative de l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes. Ainsi, cette approche offre un accès facile à la caractérisation moléculaire des cellules individuelles d’une manière rapide.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Alignement multiple pour la conception d’amorces</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td></td></tr><tr><td>RT Amorces aléatoires</td><td>Sigma-Aldrich (Merck</td><td>)11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT et PCR</td></tr><tr><td>RNasin Inhibiteurs de ribonucléase</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase inverse</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq ADN polymérase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Amorces PCR</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / dessalées et diluées à 200 &micro ; Tubes M</td></tr><tr><td>, 0,5 mL, bouchon plat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT et PCR</td></tr><tr><td>BT10 Series - 10 & micro ; L Filtre Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT et PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 & micro ; L Pointe de filtre</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT et PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 & micro ; L Pointe Filtrante</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT et PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 & micro ; L Filtre Tip</td><td>Neptune</td><td>Scientific BT1000.96</td><td>RT et PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Tampon Tris-Borate-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td> Life <td>Technologies</td><td>16500-500</td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr> <tr><td>et Phi ; X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>d’agarose EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Électrophorèse Alimentation EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Unité d’électrophorèse horizontale Midi Modèle SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Électrophorèse</td></tr> <tr><td>sur gel d’agarosePapier lisse à l’aspect satiné</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patch clamp solution interne</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Patch clamp solution interne</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Patch clamp solution interne</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch clamp solution interne</td></tr><tr><td>D-gluconate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Solution interne patch clamp</td></tr><tr><td>Solution de chlorure</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Solution interne patch clamp</td></tr><tr><td>5500 Osmomètre à pression de vapeur</td><td>Wescor</td><td></td><td>Solution interne</td></tr><tr><td>patch clamp Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Patch clamp solution interne</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Solution de chlorure</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Préparation</td></tr> <tr>des tranches<td>Acide kynurénique</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Préparation des tranches</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Préparation</td></tr><tr><td>des tranches Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Nettoyage de la configuration des pinces Capillaires</td></tr> en <tr><td>verre à paroi mince avec filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch</td></tr><tr><td>Clamp Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp BX51WI Microscope droit</td><td>Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD N/B CAMÉRA VIDÉO</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplificateur</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 suite logicielle</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL seringue</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series avec corps droit (support)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expulser</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Révélation histochimique</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Révélation histochimique</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Révélation histochimique</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Révélation histochimique</td></tr><tr><td>Gélatine de peau</td> <td>de poisson d’eau froideSigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Révélation histochimique</td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Révélation histochimique</td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Révélation histochimique</td></tr></tbody></table>

monocellulaire multiplex reverse transcription polymerase chain reaction après patch-clamp

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules présentant des caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires différents. Cette diversité entrave faciliter l’identification et la caractérisation de ces types de cellules, prérequis pour étudier leurs fonctions spécifiques. Cet article décrit le Protocole multiplex unicellulaire transcription réverse polymérase PCR (RT-PCR), qui permet de détecter simultanément l’expression de plusieurs dizaines de gènes dans une seule cellule, après enregistrement en tranches, patch clamp. Cette méthode simple peut être implémentée avec caractérisation morphologique et est largement applicable pour déterminer les caractéristiques phénotypiques de divers types de cellules et de leur environnement cellulaire particulière, comme dans les environs de vaisseaux sanguins. Le principe de ce protocole est d’enregistrer une cellule avec la technique de patch clamp, de récolter et d’inverser transcrire son contenu cytoplasmique, et de déceler qualitativement l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes par multiplex PCR. Elle nécessite une conception soignée des amorces de PCR et intracellulaire patch-clamp de la solution compatible avec la RT-PCR. Afin d’assurer une transcription sélective et fiable detection, cette technique requiert également des contrôles appropriés de cytoplasme récolte aux étapes de l’amplification. Bien que nous discutées des précautions doivent être strictement respectées, pratiquement n’importe quel laboratoire électrophysiologique peut utiliser la cellule technique RT-PCR multiplexe.

Une validation représentative de RT-PCR multiplex est illustrée à la Figure 3. Le protocole a été conçu pour sonder simultanément l’expression des gènes différents 12. Le vGluT1 du transporteur vésiculaire glutamate a été pris comme un témoin positif de neurones glutamatergiques42. Le GABA de synthèse des enzymes (GAD65 et GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) et la somatostatine (SOM) ont été utilisés comme marqueurs de GABAergique interneuro...

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche en neurosciences, telles que la caractérisation de la population neurologique ou l’identification des sources et des cibles des systèmes de transmission. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déterminer rapidement et facilement le profil d’expression d’un ensemble présélectionné de gènes à partir d’une seule cellule. Cette méthode peut donc fournir un aperçu de la souris à diversité aléatoire.Il peut également être appliqué à d’autres types de cellules, tels que les astrocytes et dans de nombreux modèles animaux. Cette démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes d’arrêt et d’aspiration peuvent être difficiles à apprendre car les données nécessitent une quantité de cytoplasme à analyser. Avant de sectionner, préparez un kit de dissection contenant des ciseaux chirurgicaux, des ciseaux à iris fins, deux spatules, une pince, un disque de filtre en papier et de la colle cyanoacrylate.Saturez ensuite la solution de coupe glacée avec du carbogyn et refroidissez la chambre de coupe à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, retirez le cuir chevelu de l’animal et ouvrez le crâne.

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Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

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