Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche en neurosciences, telles que la caractérisation de la population neurologique ou l’identification des sources et des cibles des systèmes de transmission. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déterminer rapidement et facilement le profil d’expression d’un ensemble présélectionné de gènes à partir d’une seule cellule. Cette méthode peut donc fournir un aperçu de la souris à diversité aléatoire.

Il peut également être appliqué à d’autres types de cellules, tels que les astrocytes et dans de nombreux modèles animaux. Cette démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes d’arrêt et d’aspiration peuvent être difficiles à apprendre car les données nécessitent une quantité de cytoplasme à analyser. Avant de sectionner, préparez un kit de dissection contenant des ciseaux chirurgicaux, des ciseaux à iris fins, deux spatules, une pince, un disque de filtre en papier et de la colle cyanoacrylate.

Saturez ensuite la solution de coupe glacée avec du carbogyn et refroidissez la chambre de coupe à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, retirez le cuir chevelu de l’animal et ouvrez le crâne. Extrayez soigneusement le cerveau et placez-le dans un petit bécher rempli de solution de découpe à froid de glace carbogénée.

Ensuite, retirez la chambre de coupe à moins 20 degrés Celsius et éliminez l’humidité avec une serviette en papier. Disséquez soigneusement le cerveau pour isoler la région d’intérêt. Collez-le sur la chambre de découpe et ajoutez la solution de découpe carboginée et glacée.

A l’aide d’un vibratone, sectionner des tranches de 300 micromètres d’épaisseur. Transférez les tranches dans une chambre de repos remplie de solution de coupe oxygénée à température ambiante et laissez-les récupérer pendant au moins 30 minutes. Pour la RT-PCR sur cellule unique et la caractérisation cellulaire ciblée, limitez l’enregistrement de cellules entières à 20 minutes maximum afin de préserver l’ARNm.

À la fin de l’enregistrement, préparez un tube PCR de 500 microlitres rempli de deux microlitres de mélange 5xRT et de 0,5 microlitres de 20xDTT. Faites-le tourner et rangez-le sur de la glace. Ensuite, récoltez le cytoplasme de la cellule en appliquant une légère pression négative.

Surveillez et contrôlez le contenu de la cellule pour éviter qu’elle ne pénètre dans la pipette tout en maintenant une fermeture étanche et évitez de collecter le noyau si certains gènes sont pris en compte. Dans le cas d’un gène, il est essentiel d’éviter la collecte du noyau et d’inclure un ensemble d’amorces visant à amplifier l’ADNg pour se préparer à une contamination générale. Si le noyau se rapproche de la pointe de la pipette, relâchez la pression négative et éloignez la pipette.

Assurez-vous que l’étanchéité est préservée et relancez la collecte du cytoplasme au nouvel emplacement de la pipette. Ensuite, retirer délicatement la pipette pour former une plaque extérieure afin de limiter la contamination par les débris extracellulaires et de favoriser la fermeture de la membrane cellulaire pour une analyse histochimique ultérieure. Gardez à l’esprit que les picots, les micro-manipulateurs, le clavier ou la souris d’ordinateur sont des sources de contamination par les RNASE chargées de protons.

S’ils ont été touchés pendant l’enregistrement, changez les gants. Ensuite, fixez la pipette à l’expulseur et expulsez son contenu dans le tube PCR en appliquant une pression positive. Cassez l’extrémité de la pipette dans le tube PCR pour aider à la collecte de son contenu.

Ensuite, centrifugez brièvement le tube, ajoutez 0,5 microlitre d’inhibiteur de RNAse et 0,5 microlitre de RTAse. Mélangez doucement, centrifugez à nouveau et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, faites tourner le tube et conservez-le à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs mois.

Jusqu’à l’analyse PCR et la réalisation de la première étape d’amplication. Pour valider la PCR, mélangez et diluez une paire d’amorces, ajoutez une micromolaire avec la pipette dédiée au RTPCR à cellule unique. Réglez le thermocycleur pendant trois minutes à 95 degrés Celsius, exécutez 40 cycles suivis d’un pas d’allongement final à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour minimiser la formation d’amorces, effectuez un démarrage à chaud en plaçant les tubes PCR dans le thermocycleur préchauffé à 95 degrés Celsius. Après 30 secondes, expulsez rapidement 20 microlitres du mélange d’apprêt sur l’huile. Une fois la paire d’amorces validée, testez-la avec le protocole multiplex.

Mélangez et diluez l’apprêt externe au niveau d’une micromolaire. Conservez le mélange d’amorçage multiplex à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines maximum. Ensuite, préparez un pré-mélange et placez-le sur de la glace.

Agitez le tube PCR et faites-le tourner et ajoutez deux gouttes d’huile minérale. Après trois minutes à 95 degrés Celsius, exécutez 20 cycles de PCR. Effectuez un démarrage à chaud comme décrit avec 20 microlitres d’apprêt multiplex.

Ensuite, préparez un nombre de tubes PCR identique au nombre de gènes analysés. Préparez un pré-mélange en utilisant un microlitre du premier produit PCR par gène comme modèle. Ajustez tous les volumes en fonction du nombre de gènes à analyser et envisagez d’utiliser 10 % de volume supplémentaire pour compenser les erreurs de pipetage.

Agitez doucement, tournez le tube et répartissez 80 microlitres de prémélange dans chaque tube PCR. Ajoutez deux gouttes d’huile minérale par tube sans toucher la paroi ou le capuchon des tubes. Exécutez 35 cycles de PCR puis effectuez un démarrage à chaud en expulsant 20 microlitres de mélange d’amorce interne.

Analyser les deuxièmes projets de PCR par électrophorèse sur gel d’Aragase. Un neurone pyramidal de couche cinq a été identifié visuellement par son grand soma et une dendrite apicale proéminente. L’enregistrement des cellules d’attraction a révélé des propriétés électrophysiologiques typiques des neurones à pointes régulières de couche cinq avec une faible résistance à l’entrée, des potentiels d’action de longue durée et une adaptation prononcée de la fréquence de pointe.

L’analyse moléculaire de ce neurone a révélé l’expression de vGluT1, confirmant son phénotype glutamitergique. Ce neurone exprimait également la somatostatine et l’ATP1-alpha-1 et trois sous-unités des ATPA sodium-potassium. Le marquage par biocytine des neurones enregistrés, a confirmé une morphologie pyramidale.

Comme prévu pour les neurones glutamitérgiques, l’analyse moléculaire de 26 cellules pyramidales de couche cinq a révélé l’expression de vGluT1 mais aucun des deux GAD. Une fois la technique peut être faite dans les deux jours, si elle est correctement préparée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être très prudent pour éviter les contaminations.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sonder l’expression de 10 gènes simultanément à partir de cellules uniques caractérisées par des amas de plaques selon les tranches de cerveau, après la récolte du cytoplasme, la transcription inverse et les PCR à chaud. N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthidium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.