Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

L’objectif général des procédures présentées ici est d’identifier les étapes de la germination des spores afin que les niveaux de transcrits géniques puissent être évalués. L’analyse de ces changements permettra d’approfondir les connaissances sur une étape critique de la dispersion de la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les transitions au cours de la germination des téliospores qui sont liées à des changements dans les niveaux de transcription des gènes et reflètent ainsi des changements dans le contrôle de l’expression des gènes.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle identifie les transitions de niveau de respiration qui ne correspondent pas aux commutateurs morphologiques visibles et permet d’isoler physiquement les téliospores à des stades distincts de la germination. Cette technique a des implications pour le contrôle de la dissémination des agents pathogènes, car elle nous permet d’identifier les transitions clés dans la germination des spores, qui, si elles étaient modifiées, pourraient bloquer la propagation de la maladie. Commencez cette procédure par l’infection des épis de maïs, la récolte des téliospores, ainsi que le test de viabilité et de germination des téliospores, comme décrit dans le protocole textuel.

Pour induire la germination, pesez d’abord une quantité égale de téliospores pour chaque expérience de respiration. Dans une enceinte de biosécurité, ajoutez les téliospores dans une chambre de respiration autoclave. Remplissez la chambre de bouillon de dextrose de pomme de terre, complété par du sulfate de streptomycine et du sulfate de kanamycine.

Pipetez de haut en bas pour créer une suspension de téliospore. Placez le couvercle de la chambre dans la chambre pour créer un joint étanche à l’air. Pour obtenir la mesure OCR, placez d’abord la chambre dans le rack de la chambre à l’intérieur d’un bain-marie.

Ensuite, placez la sonde à oxygène à l’intérieur de l’ouverture de la chambre. Surveillez les points de données apparaissant en temps réel sur le programme de taux de trace du capteur. Laissez la sonde se stabiliser pendant environ trois minutes après avoir été placée dans la chambre.

Cliquez sur Mesurer pour mesurer les niveaux d’oxygène en continu pendant six heures avec des mesures enregistrées à des intervalles de deux secondes. Arrêtez la mesure et répétez ces étapes pour chaque échantillon à analyser avant d’exporter les données vers Microsoft Excel et d’effectuer l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte. Placez environ 10 milligrammes de téliospores d’umatus dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Suspendez les téliospores dans 500 microlitres de PDB complété par du sulfate de streptomycine. Pipeter doucement pour mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’amas de téliospores dans le milieu. Transférez la suspension de téliospores dans une fiole Erlin Meyer de 250 millilitres autoclavée, contenant du PDB, complété par du sulfate de streptomycine.

Incuber le ballon pendant la nuit à 28 degrés Celsius, en l’agitant à 90 tr/min. Préparez une boîte de Pétri en pipetant quatre à cinq gouttes de cinq microlitres d’eau distillée sur le dessus de la boîte de Pétri. Ensuite, pipetez trois gouttelettes de deux microlitres de solution de stabilisation d’ARN sur la boîte de Pétri à utiliser pour le prélèvement d’échantillons.

Pipetez également 30 gouttelettes de cinq microlitres de téliospores en germination sur la boîte de Pétri. Ajoutez 15 millilitres d’huile minérale dans la boîte de Pétri. Assurez-vous que toutes les gouttelettes sont recouvertes d’huile avant de continuer.

Ensuite, préparez un microcapillaire avec un diamètre intermédiaire de 15 microns, une bride d’un millimètre, une longueur de 55 millilitres et un angle de pointe de 20 degrés. Placez-le dans le support microcapillaire et immergez-le dans l’huile minérale, où l’action capillaire permettra à l’huile minérale de pénétrer dans le microcapillaire. Relâchez la pression dans le microcapillaire avant de l’amener à la gouttelette d’eau.

Aspirer pour préparer le microcapillaire avec de l’eau. À l’aide des commandes du micromanipulateur, déplacez le microcapillaire préparé vers l’une des gouttelettes de germination et pénétrez dans la gouttelette. Abaissez le microcapillaire et amenez la bouche du microcapillaire jusqu’à une téliospore en germination au stade de germination d’intérêt.

Aspirer lentement afin de capturer le téliospore en germination. Arrêtez d’aspirer une fois que la téliospore a pénétré dans le microcapillaire. Répétez l’opération jusqu’à ce qu’il y ait environ cinq téliospores dans le microcapillaire.

Soulevez le microcapillaire à l’aide du micromanipulateur et amenez-le à la gouttelette collectrice de la solution de stabilisation de l’ARN. Pénétrez la gouttelette et injectez les téliospores dans la gouttelette. Répétez ces étapes jusqu’à ce qu’environ 1 000 téliospores aient été capturées.

Pour récupérer la gouttelette collectrice, pipetez la gouttelette collectrice et transférez-la dans le couvercle du tube microcentral libre de 2,0 millilitres de l’ADN d’un ARN. Appliquez soigneusement l’huile minérale à l’aide de la pipette, sans perturber la gouttelette de collecte. Les téliospores peuvent maintenant être utilisées pour des applications en aval telles que l’isolement de l’ARN.

Ce graphique illustre un résultat typique de l’évaluation des changements de niveau d’oxygène dans les suspensions de téliospores induites à germer. Par rapport aux téliospores non induites, la séparation indiquant le début de la respiration se produit à environ 30 minutes. Si l’on considère qu’il faut environ 15 minutes pour installer et transporter l’échantillon jusqu’à la sonde d’oxygène, ce temps est en fait de 45 minutes.

On voit ici les cinq étapes de la germination des téliospores. Au premier stade, les téliospores sont induites à germer mais ne montrent aucun signe morphologique de germination. Les téliospores de stade deux montrent un promycélium émergé d’une longueur inférieure au diamètre de la téliospore.

Au troisième stade, la longueur du promycélium est supérieure au diamètre du téliospore. Le quatrième stade est caractérisé par une promycélie avec des basidiospores attachées. Et au stade cinq, il y a des basidiospores en herbe.

Ici, les téliospores en germination asynchrone sont montrées et le microcapillaire est positionné près d’un téliospore de stade trois. La téliospore de stade trois est ensuite aspirée dans le microcapillaire et transférée dans une goutte de solution de collecte. Une fois maîtrisée, cette technique de microdissection peut être utilisée pour isoler 1 000 téliospores spécifiques du stade en six à sept heures.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de faire des pauses fréquentes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler physiquement les spores à des stades morphologiquement distincts de la germination. Et identifiez le moment de l’initiation de la respiration.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la nécessité de maintenir la stérilité. Et la nécessité de faire preuve de patience et d’isoler les types de cellules par microdissection. La mise au point de cette technique ouvre la voie aux phytopathologistes fongiques pour explorer les aspects morphologiques et moléculaires de la germination dans les champignons dévastateurs du charbon et de la rouille qui menacent la sécurité alimentaire mondiale.

Bien que cette technique s’applique à nous, les ligomatistes, elle pourrait également être utilisée dans de nombreux autres agents pathogènes dévastateurs des cultures agricoles qui entraînent des milliards de dollars de pertes annuelles. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’isolement de l’ARN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : quel est le profil et le moment du changement de niveau de transcription ?