Name: Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Apprenez l'extraction des ganglions lymphatiques médiastiniques chez la souris pour évaluer l'activation des cellules dendritiques lymphoïdes après injection de nanomatériaux immunostimulants. Cette technique permet d'étudier les réponses immunitaires.

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Cette recherche a été financée par le programme de découverte de matériaux créatifs grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et les futur Planning (FRO-2017M3D1A1039421) et par programme de biotechnologie Marine, financé par le Ministère des Océans et pêches, République de Corée et une subvention (20150220).

Toutes les procédures expérimentales, notamment l’isolement de manipulation, le sacrifice et organe animal ont été réalisées en stricte conformité avec les règles de l’International animalier et Comité de l’urbanisme au centre clinique de santé publique de Shanghai et Asan Medical Center. Le protocole de l’étude a été approuvé par les commissions respectives sur l’éthique de l’expérimentation animale au centre clinique de santé publique de Shanghai (numéro de protocole de la souris : SYXK-2010-0098) et Asan Medical Center (2016-02-168).
1. préparation du matériel
Remarque : Un nano-adjuvant, INP, composé d’un transporteur auto-assemblés lipide-ADN, à savoir U4T, et oligonucléotides contenant de motif du CpG, eCpG, était employé dans la présente étude pour tester l’itinéraire approprié injection d’immunothérapie et de la vaccination chez la souris2 . Important, autres molécules thérapeutiques potentiels tels que les antigènes, anticorps et d’agents de traitement adjuvant peuvent être substituées à l’INP et testés selon les mêmes méthodes décrites ci-dessous.
<ol><li>INP formulation2,4,7<ol>
<li>Anneal U4T (160 µM, transporteur) avec eCpG (80 µM, qui contient une séquence d’agoniste TLR9) en présence de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) et MgCl2 (2 mM). La quantité standard de recuit est entre 50 et 110 µL dans un tube PCR. Porter le mélange à 95 ° C pendant 10 min et ensuite laisser refroidir lentement (1 ° C/16 min) à 25 ° C à l’aide d’un thermocycleur. Le protocole de recuit nécessite environ 2 h. ATTENTION : Le liquide contenant du U4T est très mousseux et doit être manipulé avec soin.</li>
		<li>Faire 50 µL d’extraits de la préparation de l’INP ; Utilisez 50 µL du matériau pour chaque injection. Remarque : Dans le cas de 100 µL par injection, répétez l’étape 1.1 avec le calcul correct des ingrédients.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. le général Animal procédures
Remarque : Les méthodes alternatives pour la manipulation des souris peuvent être utilisés selon les exigences de laboratoire et les protocoles approuvés d’animaux8. Le type de souris utilisées est souris C57BL/6 et femelles de 6 semaines.
<ol><li>Liste des matériaux<ol>
<li>Préparer le liquide anesthésique (isoflurane), machine anesthésique, chambre d’inhalation de dioxyde de carbone (CO2), gaze stérilisée, forceps, drisse de souris, gants, pince crochetée, 1po dissection ciseaux, ciseaux de dissection 2 pouces, alcool pour stérilisation et seringue à insuline.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inhalant anesthésie Remarque : L’anesthésie est obligatoire pour intranasale, sous-cutanée, coussinet plantaire et des injections intraveineuses de souris9. Une chambre à induction avec un réservoir de machine et de l’oxygène vaporisateur connecté est utilisée pour cette procédure.<ol>
<li>Placer l’animal dans la chambre de l’induction et assurez-vous de bien fermer le couvercle.</li>
		<li>Flux de l’oxygène à 1 L/min et réglez le vaporisateur à un niveau d’induction de 4 % pour l’isoflurane.</li>
		<li>Varier la durée d’exposition des animaux dans la chambre selon le poids de l’animal ; Cependant, plus de 10 s d’exposition et de surveiller toutes les 5 min est nécessaire pour l’anesthésie,10. Remarque : Aucun réflexe pédale n’indique anesthésie réussie.</li>
		<li>Mettez hors tension de l’inducteur de l’isoflurane et débit 1 L/min d’oxygène pour prévenir l’exposition du personnel au gaz isoflurane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrifice<ol>
<li>Préparer une chambre pour le CO2 inhalation sacrifice selon le NIH « lignes directrices pour l’euthanasie de rongeurs à l’aide de dioxyde de carbone »11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Réponse de gag test pour confirmer que l’animal soit entièrement sacrifiée.<ol>
<li>Vérifiez que la souris est correctement sacrifiée en pinçant le bout de son pied et ne confirmant aucune réponse du gag. S’il y a une réponse, répétez l’étape 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Désinfection<ol>
<li>Désinfecter toutes les surfaces utilisées pour les injections ou les dissections avec pulvérisation d’alcool et de gaze stérilisée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stockage de l’orgue<ol>
<li>Forceps permet de supprimer tous les gras et le sang qui entoure les organes récoltés. Stocker ces tissus récoltées individuellement dans une boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS. Le conteneur et les médias peuvent différer selon les exigences de la procédure ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. injection itinéraires
<ol><li>Utilisez les méthodes de six injection pour étudier les réponses immunitaires dépendantes injection : par voie orale, par voie nasale, sous-cutanée, coussinet plantaire, intrapéritonéale et par voie intraveineuse8,12,13.</li>
</ol>4. isolement des ganglions lymphatiques et la rate
Remarque : Utilisez la souris maigres jeunes et en bonne santés (âgés de 6 semaines) pour ces procédures car les graisses qui s’accumulent généralement dans les ganglions lymphatiques chez les souris âgées sont difficiles à enlever et peut empêcher la bonne visualisation de l’orgue.
<ol><li>Récolte des étapes Remarque : Cette section décrit la récolte après l’injection de l’iLN, rate et mLN des souris pour analyser la stimulation immunitaire. Se référer aux étapes 2,3 à 2,5 pour le sacrifice, bâillonner la réponse et les méthodes de désinfection.<ol>
<li>Épingler les membres de la souris sur le panneau isolant chirurgicale et stériliser la face ventrale de la souris avec l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Choisir un emplacement 2 cm au-dessus de la zone génitale et pinces à usage accroché à tirer vers le haut de la couverture de l’épiderme comme une tente. Faire une coupe d’environ 1 cm à cet endroit et faire glisser les ciseaux (2 po) sous la peau, faire de nouvelles coupures de dissection.</li>
		<li>Pour le tégument, couper verticalement à travers l’épiderme avec les deux bras des ciseaux (2 pouces). Exposer les organes internes recouverts de péritoine.</li>
		<li>Épinglez la couche externe de la peau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement du ganglion inguinal (iLN)
	<ol>
<li>Localiser l’iLN sur le côté gauche de la jambe suite à la conjonction du vaisseau sanguin dans la jambe gauche, qui apparaît comme une lettre inclinée « Y ». Remarque : Pour les souris injectées par voie sous-cutanée, choisissez un iLN du même côté de l’emplacement de l’injection.</li>
		<li>Découvrir la couche avec deux pinces pour déchirer la couche lipidique couverte et récolter l’iLN jaune pâle (forme de haricot, 2 mm). Pour un traitement ultérieur et le stockage du tissu, reportez-vous à l’étape 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement de la rate 14<ol>
<li>Faire une tente au centre du péritoine avec accroché des pinces dans une main et utiliser petite mince ciseaux (1 pouce) dans l’autre main pour couper le péritoine.</li>
		<li>Pinces à usage accroché dans la main gauche pour saisir l’intestin et retournez-le pour localiser la rate de type haricot rouge (longueur d’environ 14 mm) attachée à la partie supérieure gauche de l’abdomen de la souris.</li>
		<li>Retirez doucement la rate avec un autre ensemble de pinces dans la main droite tout en détachant des autres organes avec la pince crochetée. Suivez l’étape 2.6 pour stocker la rate. Remarque : Des soins sont nécessaire lorsqu’ils pêchent la rate, car c’est un organe mou facilement endommagé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement du ganglion médiastinal (mLN) Remarque : Le mLN est situé à environ 1 cm sous les côtes et est couvert par d’autres organes comme le cœur et les poumons. En raison de son emplacement et de petite taille, il est important d’exposer avec soin les environs à l’aide de pinces et ciseaux (1 pouce).<ol>
<li>Couper le diaphragme et séparez-le de la membrure. Maintenir le corps des côtes avec une pince et puis couper les côtés gauche et droit des côtes avec des ciseaux (1 pouce). Epinglez les nervures coupure sur l’épaule de la souris sur le droit d’exposer le cœur et les poumons. Remarque : prendre soin de ne pas pour couper tout les vaisseaux sanguins autour du cœur et des poumons, comme une fuite de sang le rend très difficile de localiser le minuscule mLN translucide. Si les vaisseaux sanguins sont coupés, doucement absorber le sang dans la zone avec de la gaze.</li>
		<li>Avec une pincette crochetés à la main droite, mettez le cœur et les poumons doucement vers la droite jusqu'à ce que l’épine dorsale est exposée. Utilisez une paire de pinces régulières dans la main gauche pour supprimer l’iLN avec la pince crochetée à la main droite pour aider à cette récolte.</li>
		<li>Saisir les poumons et les retourner jusqu'à ce que l’épine dorsale est largement exposée. Le mLN (une structure translucide en forme de haricot d’environ 2 mm de taille) est situé entre les poumons et la colonne vertébrale.</li>
		<li>Utiliser la pince crochetée pour exposer la zone autour de la millions de francs et l’autre pince pour extraire le tissu. Remarque : Le mLN est entouré de nombreux autres tissus qui doivent être enlevés soigneusement avec une pince avant la récolte.</li>
		<li>Voir l’étape 2.7 pour obtenir des instructions sur le stockage les millions de francs récoltées.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. préparation des échantillons pour la cytométrie en flux
Remarque : Pour doser l’activation des contrôleurs de domaine dans l’iLN récolté, rate et mLN, des suspensions de cellules individuelles de ces tissus sont colorées avec des anticorps conjugués fluorescence comme marqueurs spécifiques à DC, les molécules de costimulation et majeur d’histocompatibilité complexes molécules et analysés par cytométrie en flux.
<ol><li>
Préparation de suspensions unicellulaires : rate
	<ol>
<li>Ajouter 5 mL de milieu de culture frais (CM) en 6 mm boîte de Petri et placer les échantillons sur la glace.</li>
		<li>Enlever les tissus environnants de sang et de la graisse et placer le tissu dans le couvercle de la boîte de Pétri.</li>
		<li>Couper les tissus en petits fragments (< 1 mm) avec des ciseaux courbes. Suspendre les fragments dans du PBS suivie de filer vers le bas le tissu à l’aide d’une centrifugeuse à 646 × g pendant 5 min et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Suspendre les échantillons à nouveau dans 3 mL de CM et de digérer les fragments avec 200 µL de solution de 2 % sérum bovin fœtal (SVF) additionné de collagénase IV pendant 20 min.</li>
		<li>Agiter doucement et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 h. filtrez les tissus digérés par l’intermédiaire de maille en nylon (100 nm) et tournez en bas. Laver les cellules individuelles dans 5 mL de PBS et éliminer le surnageant par centrifugation.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de solution d’isolement de cellules. Re-charger une autre couche de 5 mL de solution d’isolation de cellules claires pour former une pile de couche par couche aqueuse.</li>
		<li>Centrifuger la préparation de cellules à 2012 × g pendant 10 min. obtenir le surnageant, qui est la fraction de densité plus léger (< 1,077 g/cm3), pour analyse en cytométrie en flux ultérieurs.</li>
		<li>Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de suspensions unicellulaires : ganglion lymphatique
	<ol>
<li>Suivez l’étape 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de CM en utilisant une pipette 10 mL de suspendre les cellules en pipettant également, 3 - 4 fois. Après avoir soigneusement suspendant les cellules, utilisez maille en nylon stérile pour filtrer les cellules pour la collecte dans un tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Faites tourner les cellules vers le bas à 646 ×g pendant 7 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 5 mL supplémentaire de CM en pipette 10 mL de mieux suspendre les cellules de pipetage.</li>
		<li>Laver avec du PBS et compter le nombre de cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse en cytométrie en flux
	<ol>
<li>Aliquote de 0,5 à 1 × 106 cellules dans chaque cellule activée par fluorescence tri tube (FACS).</li>
		<li>Centrifuger à 646 × g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 5 µL de chaque dilution conjugué fluorescence préparation d’anticorps aux cellules à remettre en suspension le culot cellulaire et vortex. Remarque : Il est important de protéger le culot cellulaire de l’exposition à la lumière autant que possible parce que les anticorps fluorescent étiquetés sont sensibles à la lumière. Générer un mélange maître anticorps et toujours ajouter le bloc Fc.</li>
		<li>Préparer le tampon de FACS avec 100 µL de PBS, 1 % de FBS régulière inactivés par la chaleur et 0,1 % d’azide de sodium.</li>
		<li>Placer l’échantillon dans le tube à 4 ° C pendant 30 min. Rincer les cellules avec 2 à 4 mL de FACS tampon et centrifuger l’échantillon à 1700 tr/min à 7 min à 4 ° C.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules de 500 µL de tampon de FACS dans l’obscurité. Analyser les cellules par cytométrie en flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nombreuses avancées en nanotechnologie et en immunologie ont été obtenues par le biais de la recherche thérapeutique de l’administration de médicaments et d’immunostimulation. Une sélection rigoureuse de la méthode d’injection est connue pour être importante pour l’immunostimulation, qui a fait l’objet de la présente étude.
Itinéraires d’injection différentes ont été évalués pour un naturellement non toxiques et biodégradable basées sur l’ADN matériel, INP (immunostimulantes nanoparticules), a...

Avancées en immunologie et nanomatériaux ont conduit à une abondance de potentielles nouvelles stratégies thérapeutiques pour les applications en biomédecine, y compris l’immunostimulation et délivrance de médicaments. Optimisation de la voie d’administration est un aspect vital affectant l’efficacité des agents immunostimulantes. Une NANOPARTICULE immunostimulantes (INP) composé de l’ADN est un adjuvant de nano-immunitaire nouvellement développé Self-assemblé microphase séparation à cause de la structure amphiphile de lipide-ADN1. Par conséquent, les protocoles pour INP touchant l’administration du matériel1 in vivo par des voies différentes et trois procédures pour la récolte des tissus appropriés tels que le ganglion inguinal (iLN), médiastinale LN (mLN) et la rate, sont décrit. Enfin, ces tissus ont été analysés pour l’activation des cellules dendritiques (DC), les cellules présentatrices d’antigène plus puissants dans le système immunitaire. Ce protocole peut également être appliqué pour l’évaluation des antigènes, anticorps ou autres adjuvants immunitaires2.
Nous avons testé la formulation de l’INP, parce que c’est un agent qui a montré de grandes promesses. INP est un récepteur Toll-like 9 (TLR9) matériel adjuvant qui contient des acides nucléiques, pour laquelle évaluation d’immunostimulation efficacité est nécessaire pour tester l’injection différentes méthodes3. Dans ce contexte, la stimulation de la DCs est un puissant point de terminaison pour in vivo de l’évaluation. Après que les molécules de l’antigène ou immunostimulantes sont phagocytées par les contrôleurs de domaine dans les tissus périphériques ou le sang, ces cellules migrent vers les organes lymphoïdes comme la rate et le LNs4,5. Ainsi, activation de DC a été analysée dans la rate et iLN mLN des animaux injectées. Correctement la cueillette de ces tissus est donc aussi cruciale pour l’évaluation de la réponse immunitaire à un adjuvant ou agents pathogènes nouveaux5. La récolte de ces tissus est aussi importante pour le développement d’une nouvelle méthodologie immunologique comme une thérapie contre le cancer. En outre, ce protocole peut être utilisé pour vérifier l’efficacité d’autres médicaments, tels que les virus de l’immunodéficience humaine thérapeutique6.

<table><tbody><tr><td><fort>Matériel</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr>phosphate <tr><td>tampon salin</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>Organes de lavage</td></tr><tr><td>(PBS, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solution d’isoflurane&nbsp ;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Processus d’anesthésie</td></tr><tr><td>Tuberculine 1 mL seringue -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Injection 50 mL tube conique&nbsp ;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>Processus d’anesthésie</td></tr><tr><td>1mL Seringue à insuline&nbsp ;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy ;II)_short aiguille</td><td>324826</td><td>Injection intramusculaire</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30081.01</td><td>Stockage des organes</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&nbsp ; Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Analyse FACS</td></tr><tr><td>Alcool éthylique anhydre 99,5 %&nbsp ;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Désinfectant</td></tr><tr><td><fort>Équipements</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Thermocycleur)</td><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Ssufine-Anealing <tr><td>Centrifugeuse FACS tube&nbsp ;</td><td>FALCON</td><td>2052</td><td>Analyse FACS</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux haute performance automatisé</td><td>BD (États-Unis), FACSVerse-FACS</td><td></td> <td>analyse</td></tr></tbody></table>

immunostimulantes agent evaluation : lymphoïde tissu extraction et injection route-dépendante des cellules dendritiques activation

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Pour l’évaluation d’un nouvel agent thérapeutique pour l’immunothérapie ou vaccination, il est essentiel d’analyse de l’activation de cellules immunitaires dans les tissus lymphatiques. Ici, nous avons étudié les effets immunologiques d’un immunostimulant roman lipide-ADN sous forme de nanoparticules de voies d’administration différentes chez la souris : orale, par voie nasale, sous-cutanée, coussinet plantaire, intrapéritonéale et par voie intraveineuse. Ces injections influenceront directement la réponse immunitaire et la récolte des tissus lymphatiques et analyse de l’activation des cellules dendritiques (DC) dans les tissus sont des éléments essentiels de ces évaluations. L’extraction des ganglions lymphatiques médiastinaux (mLNs) est important mais assez complexe à cause de la taille et l’emplacement de cet organe. On décrit une méthode progressive pour récolte le ganglion inguinal (iLN), mLN et la rate et l’analyse d’activation DC par cytométrie en flux.

Afin d’évaluer les itinéraires d’injection appropriée de l’INP pour l’activation du tissu lymphatique DC, la population de DC comme lignée a été définie comme –CD11c+ des cellules de la rate et iLN mLN et analysé les niveaux d’expression des molécules de costimulation. Traitement de l’INP en sous-cutanée (s.c.) et l’injection par voie intraveineuse (i.v.) fait la promotion des augmentations substantielles dans l’expression de CD40, CD80 et CD86 dans...

Les procédures expérimentales pour l’extraction ultérieure des tissus lymphatiques pour tester l’activation des cellules dendritiques lymphoïdes sont décrites après traitement d’un nanomatériau immunostimulante.

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

L’objectif global de cette procédure est de familiariser la technique unique requise pour isoler le ganglion lymphatique médiastinal des souris. L’opération a été menée après injection de matériel immunostimulant sur six voies différentes chez la souris. Dans cette étude, nous avons utilisé une nouvelle classe de matériaux formant des structures de taille nanométrique.Les surfactants se composent du groupe de tête hydrophile et de la queue hydrophobe. Ceux-ci forment la micelle sphérique ou toute autre structure secondaire due à la séparation de microphage. Nous avons utilisé cette propriété à une macromolécule bio qui est l’ADN.L’amphiphile d’ADN, montré ici, comme nucléotides réguliers tels que A, C, G, T, a des blocs hydrophiles tandis que les nucléobases neurocellaux modifiés de lipide agissent comme unités hydrophobes. L’oligo modifié a été synthétisé par synthétiseur d’ADN dans des octogrammes à grande échelle. Dans les équimédias, les DNAs lipidiques amphiphiliques forment spontanément des micelles sphériques de taille nanométrique.Lorsque micelle est formé, l’ADN reste mono-échoué comme un transporteur vide avec environ 10 nanomètres de diamètre. Pour équiper le porteur d’un stimulant immunitaire, il est simple d’étendre la séquence d’ADN avec le récepteur à péage neuf adjuvants, à savoir eCpG. L’ADN lipidique et la base d’eCpG ici donc la surface externe de micelle est dégradée avec la séquence de CpG.Nous nomment alors cette nano particule stimulante immunitaire comme l’INP. Afin de déterminer le bon moyen d’inps pour la réponse immunitaire, nous avons injecté des INP à des souris dans 64 voies d’injection et par conséquent un tissu de ganglion lymphatique approprié ont été analysés. Pour plus d’instructions d’injection, veuillez trouver un article job publié par Charles River en 2012.Le principal avantage de cette vidéo est de montrer visuellement comment obtenir un ganglion lymphatique médiastinien. La vidéo montre explicitement l’emplacement du ganglion lymphatique médiastinien que beaucoup de gens trouvent une difficulté à isoler les organes. Toutes les expériences ont été menées en vertu des lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Shanghai Public Health Clinical Center, ou University of Ulsan College of Medicine.Cette partie montrera l’emplacement spécifique des organes ou des tissus, qui sont cruciaux pour l’analyse immunologique. La rate et deux ganglions lymphatiques seront isolés. Tout d’abord, les souris ont été sacrifiées par l’euthanasie par inhalation de dioxyde de carbone et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance comme suivant les conseils du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.A partir de maintenant, trouvons les organes et isolons-les. Tout d’abord, bien fixer la souris sur le bureau d’opération avec quatre broches sur la paume de la souris. Stériliser la zone de dissection avec de l’alcool.Disséquer la couverture extérieure du bas de l’abdomen de la souris avec un ciseaux de grande taille. Utilisez des forceps pour ouvrir les deux côtés de la fixation et le fixer avec des broches sur la table d’opération. L’emplacement du ganglion lymphatique inguinal est exposé en trouvant la conjonction du vaisseau descendant vers la jambe gauche.La forme du navire ressemble à la lettre d’alphabet incliné Y.Découvrez la couche avec les forceps et tirez-la de la peau. Couper le péritoine avec de plus petits ciseaux pour exposer les organes internes. Déplacez l’intestin vers la droite en utilisant des forceps puis enveloppez dans la rate en forme, qui montrent sur la gauche, côté supérieur gauche de l’abdomen.Une attention supplémentaire est nécessaire pendant la procédure car la rate est facile à perturber. Enfin, le point clé de cette vidéo: la récolte des ganglions lymphatiques médiastinaux. Il est situé sous le côté supérieur du poumon, ce qui est difficile à voir en raison de sa petite taille et l’emplacement quelque peu caché.Exposez soigneusement la zone à l’aide de petits ciseaux et de forceps. Couper les deux côtés des côtes et le diaphragme ainsi. Couper les côtes coupées au-dessus de la poitrine.Pendant la procédure éviter d’endommager le cœur et les vaisseaux sanguins car il pourrait aveugler le site, trouver le ganglion lymphatique médiastinal translucide. Si par accident le vaisseau sanguin éclate, essuyez doucement le sang avec de la gaze. Prenez le côté gauche du poumon et retournez-le doucement de l’autre côté pour voir sous le poumon.Remontez le ganglion lymphatique médiastinal à l’aide de forceps. Après la récolte du ganglion lymphatique médiastinal, assurez-vous d’enlever parfaitement toute la graisse et le sang entourant le ganglion lymphatique puisque le tissu non désiré peut influencer l’analyse. Enfin, tous les organes isolés sur une boîte de Pétri rempli de médias.Total 0,1 fois 10 à la sixième cellule ont été analysées sur cette cytométrie de flux. Basé sur le getter de force et la population de leucocyte de getter de taille a été fermé et que les cellules ont été exclues par la coloration foncée. 24 heures après injection d’INP par 64 voies d’injection, rate, ganglion lymphatique inguinal, et ganglion lymphatique médiastinal ont été récoltés et analysés activation de DC par cytométrie de flux.Basé sur la stratégie de la population de DC de cytométrie de flux a été défini comme CD11C cellules positives et négatives de lignée dans le leucocyte vivant. Notamment, l’injection intranasale de l’INP a favorisé des augmentations significatives de l’expression de CD40, 80, 86 dans le ganglion lymphatique médiastinal comparé à PBS pour le contrôle. Par conséquent, ces données ont suggéré que l’injection intranasale de l’INP puisse être employée comme adjuvant muqueux pour l’amélioration de l’immunité dans le poumon.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une méthode de conversion de cellules dendritiques (DC) en DC tolérogènes (TolDCs) à l’aide d’un agent pharmacologique immunomodulateur. Cette conversion est confirmée par l’évaluation de la fonction de TolDC à travers leur effet immunosuppresseur sur les lymphocytes T CD4+.

Effet d’un agent pharmacologique immunomodulateur sur l’interaction entre les cellules dendritiques et les lymphocytes T CD4+

La méthode la plus couramment utilisée pour générer un grand nombre de cellules dendritiques autologues (CD) pour l'utilisation dans l'immunothérapie tumorale est décrite. La méthode utilise IL-4 et GM-CSF pour différencier les PED à partir de monocytes. Les DC immatures sont stimulées à maturité, puis chargé avec des antigènes avant qu'ils ne soient réinjectées au patient.

Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l&#39;immunothérapie

La vaccination prophylactique et thérapeutique échoue souvent pour stimuler une forte réponse immunitaire due à la semaine drainage du vaccin vers les ganglions lymphatiques et par conséquent faible implication des cellules immunitaires. Par injection directe de vaccin vers les ganglions lymphatiques, dite injection intralymphatique, l'efficacité du vaccin peut être fortement améliorée, et les doses de vaccin peut être réduite.

Intralymphatique Immunothérapie et vaccination chez la souris

Les cellules dendritiques immatures peuvent être différenciées sélectivement en cellules dendritiques tolérogènes ou matures pour réguler l’équilibre entre l’immunité et la tolérance. Ce travail présente un moyen de générer à partir de cellules dendritiques (moDC) dérivées de monocytes immatures, des moDC tolérogènes in vitro et matures qui diffèrent par leurs phénotypes métaboliques.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND) peut détecter de petites quantités de molécules associées à risque et sont donc facilement apprêté. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des RCSCND de sang et de tumeurs et de leur mise en route avec les complexes immuns tout en soulignant des précautions qui doivent être menées afin d’éviter leur activation prématurée.

Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

Nous présentons ici un protocole visant à développer et caractériser les cellules dendritiques tolérogène (TolDCs) et évaluer leur utilité immunothérapeutique.

Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Le dispositif de transimmunization (TI) ou la plaque et les protocoles connexes ont été élaborés pour reproduire les principales caractéristiques de la photochimiothérapie extracorporeuse (ECP), dans un contexte expérimental, permettant la production de cellules dendritiques activables physiologiquement activées et réglables cellules (DCs) pour l’immunothérapie du cancer.

Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

La méthodologie décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) et leur application pour l’évaluation in vitro de candidats antigéniques au cours du développement de vaccins vétérinaires potentiels chez les bovins.

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Nous décrivons une procédure pour évaluer la capacité des agents pharmacologiques à générer des cellules dendritiques tolérogènes à partir de cellules dendritiques naïves dérivées de monocytes in vitro et à valider leur puissance par génération autologue de cellules T régulatrices.

Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14+ humains

Apprenez l'extraction des ganglions lymphatiques médiastiniques chez la souris pour évaluer l'activation des cellules dendritiques lymphoïdes après injection de nanomatériaux immunostimulants. Cette technique permet d'étudier les réponses immunitaires.

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation (Vidéo) | JoVE Journal

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

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