Name: Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Apprenez à différencier les cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques PDX1+ homogènes par culture en monocouche adhérente. Cette méthode permet une manipulation génétique efficace pour la recherche en médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) par l’intermédiaire de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 et 18 K 08510) à T.T. et subvention pour les chargés de recherche de pages jsp (jsp KAKENHI Grant Number 17J07622) A.K. et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) par le biais de ses travaux de recherche accordent « Core Center for iPS Cell Research, centre de recherche de réseau pour la réalisation de la médecine régénérative » à K.O. Les auteurs remercient Dr Peter Karagiannis pour la lecture du manuscrit.

Expériences à l’aide de hPSCs ont été approuvées par le Comité d’éthique de la faculté de médecine et la Graduate School of Medicine, Université de Kyoto.
1. préparation des matériaux
Remarque : Préparer tous les milieux et réactifs pour culture de cellules dans un milieu stérile. Échauffement de base milieux de culture à la température ambiante (RT) avant utilisation. Médium pour la différenciation est utilisée moins de 6 h à RT. détails des réactifs sont répertoriés dans la Table des matières.
<ol><li>
Différenciation (Figure 1 a)
	<ol>
<li>Milieu de phase 1 a : transfert milieu RPMI 1640 dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum, activine A, CHIR99021 et Y-27632 à une concentration de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM et 10 μm, respectivement.</li>
		<li>Moyen de stade 1 b : transfert milieu RPMI 1640 dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum, activine A et la CHIR99021 à une concentration de 100 ng/mL, 1 x, ≤ 1 μM, respectivement. Remarque : La concentration de CHIR99021 doit être inférieure à celui de milieu de Stage de 1 a et addition n’est pas nécessaire, mais elle augmente le nombre de cellules.</li>
		<li>Moyenne de l’étape 2 : médium de transfert amélioré MEM (iMEM) dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum et le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) à une concentration de 0,5 x et 50 ng/mL, respectivement.</li>
		<li>Moyenne de l’étape 3 : iMEM caloporteur dans un tube à l’aide d’une pipette. Ajouter le supplément sans sérum, KGF, caboche, 3-céto-N-aminoéthyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) et l’acide 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) à la pipette concentrations de 0,5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM et 10 nM, respectivement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytométrie en flux (FCM)
	<ol>
<li>1 x tampon de perméabilisation/lavage : transvaser l’eau dans un tube par une pipette. Ajouter le tampon de perméabilisation/lavage par une pipette à une concentration de 1 x.</li>
		<li>FCM bloquant la solution : transférer 1 x tampon de perméabilisation/lavage dans un tube par une pipette. Ajouter sérum âne par une pipette à une concentration de 2 % (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunomarquage
	<ol>
<li>Bloquant la solution : Phosphate-Buffered Saline (SPD de transfert Dulbecco) dans un tube par une pipette. Ajouter sérum âne et Triton X en pipette à des concentrations de 5 % (vol/vol) et 0,4 % (vol/vol), respectivement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC différenciation de progéniteurs de cellules/pancréatique Foregut postérieur (PDX1 cellules+ )
Remarque : Effectuer toutes les procédures en utilisant des techniques stériles. hPSCs sont maintenus sur des plaques 6 puits recouvert d’un matériau synthétique pour hPSCs avec hPSC moyen d’entretien selon instructions17,26 les directives du fabricant. Lorsque les cellules atteignent 50-80 % confluence (stade 0) les utiliser pour différencier.
<ol><li>
Préparer membrane basale matrice revêtu de plaques.
	<ol>
<li>6 mL de milieu RPMI 1640 (4 °C) dans un tube de transfert refroidi à 4 °C sur la glace. Ajouter 2 mg de matrice de la membrane basale (4 °C) avec embouts de mL-pipette 1 refroidi et bien mélanger en douce de pipetage pour rendre la membrane basale 0,33 mg/mL dans une matrice.</li>
		<li>Transférer 2 mL de matrice de membrane de sous-sol dilué dans chaque puits de plaques de culture cellulaire 6 puits par une pipette. Placer les plaques à 37 °C pendant 60 à 90 min dans un incubateur. Par la suite, garder les plaques à ta jusqu'à utilisation (à moins de 3 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La hPSCs des graines et ouvrir la différenciation définitive endoderme (étape 1).
	<ol>
<li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (RT) de 0,5 mM / puits pour laver la hPSCs cultivées dans les plaques 6 puits à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Aspirer 0,5 mM EDTA et ajouter 2 mL d’EDTA 0,5 mM / puits en pipette. Incuber les plaques à 37 °C pendant 5 min.</li>
		<li>Aspirer 0,5 mM EDTA et ajouter 1 mL de milieu de maintenance hPSC à ta additionné de 10 μM Y-27632 par bien de pipette. Pipetter doucement mais rapidement à s’envoler des cellules attachées sur les plaques et de dissocier les cellules regroupées dans des cellules individuelles. Ne se propagent pas la suspension cellulaire pendant le pipetage.</li>
		<li>Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger contenant 4 mL de milieu de maintenance hPSC à RT additionné de 10 μM 50 mL Y-27632. Pipetez doucement la suspension cellulaire.</li>
		<li>Compter le nombre de cellules dans la suspension de cellules à l’aide de la procédure d’exclusion de tache bleu Trypan.<ol>
<li>Mix 15 μl de suspension cellulaire et 15 μl de bleu Trypan dans un tube.</li>
			<li>Transférer 10 μL de la suspension cellulaire diluée avec le bleu Trypan vers la cellule de comptage des diapositives en double par une pipette de 10 μL.</li>
			<li>Compter la cellule numéro avec un compteur de cellule automatique et calcul de la densité cellulaire dans la suspension cellulaire. La viabilité est habituellement > 98 %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquote la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 50 mL à 1-1. 5 x 106 cellules / puits de 6 plats (1-1. 5 x 105 cellules/cm2).</li>
		<li>Centrifuger le tube de 50 mL à 200 x g à RT pendant 5 min.</li>
		<li>Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension les cellules avec 1 mL de milieu de Stage 1 a (RT) par puits. Doucement, la suspension cellulaire, déposer et ajouter un autre 1 mL de milieu de Stage 1 a (total, 2 mL par puits).</li>
		<li>Aspirer la matrice de la membrane de sous-sol dilué dans les puits des plaques de culture cellulaire établis à l’étape 2.1.2 par une pipette μL 1 000. Passez à l’étape suivante immédiatement.</li>
		<li>Pipetez doucement, encore une fois, la suspension de cellules à l’étape 2.2.8. Immédiatement après le mélange, transférer la suspension cellulaire (2 mL) dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Couvrir la plaque avec une feuille d’aluminium pour protéger la plaque de la lumière. Placer la plaque dans le banc propre à ta pendant 10-15 min. Remarque : Ne pas déplacer la plaque après le semis.</li>
		<li>Placez délicatement la plaque dans un 37 °C, 5 % CO2 incubateur (atmosphère humidifiée) et de la culture pendant 24 h. Remarque : Ne pas secouer la plaque après le semis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induire la différenciation en définitive endoderme (stade 1 b).
	<ol>
<li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans les puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois. Remarque : Pour enlever les cellules mortes de la monocouche, secouez légèrement la plaque avant chaque aspiration.</li>
		<li>Aspirer le SPD utilisés par une pipette et ajouter 4 mL de milieu de phase 1 b (37 °C) / puits. Placez délicatement la plaque dans l’incubateur de 37 °C (atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 48 h.</li>
		<li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois. Remarque : Retirer les cellules mortes de la monocouche en agitant doucement avant chaque aspiration.</li>
		<li>Aspirer le SPD utilisé par pipette et ajouter 4 mL de milieu de phase 1 b (37 °C) / puits. Placez délicatement la plaque dans l’incubateur (37 °C, une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induire la différenciation dans le tube d’intestin primitif (étape 2).
	<ol>
<li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Remarque : Retirer les cellules mortes de la monocouche en agitant doucement avant chaque aspiration.</li>
		<li>Aspirer le SPD utilisé par pipette et ajouter 4 mL de milieu de Stage 2 (37 °C) / puits. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 4 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induire la différenciation en PDX1+ de cellules (étape 3).
	<ol>
<li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.</li>
		<li>Aspirer le SPD utilisé par pipette et ajouter 4 mL de milieu de Stage 3 (37 °C) / puits. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2) et de la culture pendant 3 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induire la différenciation en cellules endocrines du pancréas.
	<ol>
<li>Induction de cellules NKX6.1+ (stade 4, pendant 8 jours) suivie par induction des cellules endocrines (stade 5, pendant 12 jours) s’exécute avec les protocoles décrits antérieurement3,16,26. Caractériser et valider la différenciation des cellules endocriniennes par immunomarquage et analyse la réaction en chaîne (qRT-PCR) polymérase quantitative de transcription inverse en temps réel. Remarque : Voir Al. Toyoda16 et Kimura et al.,26 , pour des procédures expérimentales détaillées. Consultez le tableau 1 pour les séquences d’amorces utilisées pour l’analyse qRT-PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cytométrie en flux (FCM)
<ol><li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de 0,5 mM EDTA au puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’addition de 0,5 mM EDTA une fois. Remarque : Secouez la plaque doucement pour enlever les cellules mortes des cellules monocouche avant chaque aspiration.</li>
	<li>Pour dissocier les cellules (environ 3 à 6 × 106 cellules / puits), ajouter 2 mL de 0,25 % trypsine contenant 0,5 mM EDTA / puits. Incuber les plaques à 37 °C pendant 5-10 min.</li>
	<li>Pipetter doucement mais rapidement à se dissocier les cellules regroupées en cellules individuelles. Ne se propagent pas la suspension cellulaire pendant le pipetage.</li>
	<li>Ajouter 8 à 10 mL de milieu de base (RPMI 1640 ou iMEM, RT) contenant 0,5 x supplément sans sérum et 10 μM Y-27632 par puits et mélanger la suspension cellulaire. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 300 x g à RT pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 2 mL d’EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipetez doucement la suspension cellulaire.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 300 x g à RT pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 100 μL de tampon de fixation et permeabilization par 106 cellules sous une hotte. Pipetez doucement la suspension cellulaire sous une hotte. Maintenir le tube à RT pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 400 g au RT pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le surnageant sous une hotte et remettre en suspension les cellules avec une solution FCM bloquant 500 μL par 106 cellules. Pipetez doucement la suspension cellulaire. Maintenir le tube à RT pendant 30 min.</li>
	<li>Transférer 50 μl de la suspension de cellules dans un tube (environ 1 x 105 cellules). Centrifuger le tube à 400 g au RT pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 100 μL d’anticorps primaire dilué (voir Table des matières) dans FCM bloquant la solution et laisser incuber à 4 °C pour > 16 h.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 400 x g à RT pour 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 180 μl de 1 x tampon de Perm/lavage.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 400 g au RT pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 100 μL d’anticorps secondaire dilué (voir Table des matières) en bloquant la solution de la FCM. Incuber les cellules à ta pendant 60 min ou à 4 °C pendant > 16 h avec protection contre la lumière.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 400 x g à RT pour 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 180 μl de 1 x tampon de Perm/lavage.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 400 g à ta pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 180 μl de sérum âne 2 % au SPD.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire en transférant sur un 5 mL tube polystyrène fond rond avec une crépine (mailles de nylon de 35 µm) de la cellule et les conserver à 4 °C avec protection contre la lumière jusqu'à l’analyse.</li>
	<li>Analyser une proportion de cellules colorées positivement par un cytomètre de flux27.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Aspirer le moyen utilisé et ajouter 2 mL de SPD dans le puits de la pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois. Remarque : Secouez légèrement la plaque pour enlever les cellules mortes des cellules monocouche avant chaque aspiration.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) (4 °C) / puits sous une hotte à l’aide d’une pipette. Maintenir la plaque à 4 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Retirez la PFA sous une hotte à l’aide d’une pipette. Ajouter 2 mL de SPD à ta le puits sous une hotte à l’aide d’une pipette. Répétez l’aspiration et l’ajout de SPD une fois.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de solution de saturation / puits et maintenir la plaque au RT pendant 30 min.</li>
	<li>Aspirer la solution utilisée et ajouter 1 mL d’anticorps primaire (voir Table des matières) en bloquant la solution / puits. Incuber à RT pendant 60 min ou à 4 °C pendant > 16 h.</li>
	<li>Aspirer la solution utilisée, ajouter 2 mL de SPD contenant 0,4 % Triton X-100 et incuber à RT pendant 10 min. répéter l’aspiration, ajout de solution et un temps d’incubation.</li>
	<li>Aspirer la solution utilisée et ajouter 1 mL d’anticorps secondaire (voir Table des matières) en bloquant la solution / puits. Incuber à RT pendant 60 min avec protection contre la lumière.</li>
	<li>Aspirer la solution utilisée, ajouter 2 mL de SPD contenant 0,4 % Triton X-100 (RT) et incuber à RT pendant 5 min avec protection contre la lumière. Répétez l’aspiration, l’addition de la solution et d’incubation deux fois.</li>
	<li>Prendre des photographies au microscope pour vérifier l’efficacité de différenciation sous un microscope de fluorescence28.</li>
</ol>

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<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La génération de PDX1+ cellules se compose de plusieurs étapes ; par conséquent, il est essentiel de traiter les cellules au moment opportun. Parmi les mesures, l’efficacité de l’induction de l’endoderme définitif dans une large mesure affecte l’efficacité de l’induction final, éventuellement par l’interférence des autres cellules de lignée contaminantes (mésoderme et ectoderme), qui peuvent proliférer et/ou sécrètent des facteurs qui perturber la différenciation spécifique. Si la proportion des SOX17+</s...

Le pancréas se compose principalement de cellules exocrines et endocrines et son dysfonctionnement ou surcharge provoque plusieurs maladies comme la pancréatite, le diabète et le cancer du pancréas. Afin d’élucider la pathogénie de le pancreatopathy, il est nécessaire d’analyser le processus de développement et la fonction des cellules du pancréas. En outre, une alimentation de variétés de cellule stables avec qualité robuste est nécessaire pour établir la thérapie de supplémentation de cellules/tissus. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule à ces fins, et le protocole de différenciation vers les cellules du pancréas a été intensivement étudiée1,2,3, 4. Les progrès récents dans la production in vitro de cellules β pancréatiques imitent la génération des cellules β homme adulte et ces cellules voir la thérapeutique sur l’implantation dans les diabétiques modèle souris2,3. En outre, l’analyse des cellules β générés par la les cellules souches pluripotentes induites (CISP) de sain et de type 1 diabetes patients donateurs a révélé aucune différence fonctionnelle y compris quand il est sous tension5. En outre, phénotypes de la maladie ont été partiellement reproduites dans les cellules pancréatiques induites avec CISP dérivé de patient ou hPSCs hébergeant des mutations génétiques dans le même site que les patients6,7.
Pour générer des cellules pancréatiques de hPSCs, la différenciation dirigée par étapes qui récapitule les processus de développement est utilisée. Le pancréas est dérivé de la couche de l’endoderme de l’embryon précoce, qui exprime la région Y-box 17 (SOX17) de détermination du sexe et de forkhead box A2 (FOXA2)8. Se fondant sur les études sur les souris, la couche endoderme forme le tube de l’intestin primitif, qui se caractérise par l’expression du facteur nucléaire hépatocytaire 1 bêta (Hnf1β) et le facteur nucléaire hépatocytaire 4 alpha (Hnf4α). Le tube de l’intestin primitif s’allonge et se développe dans l’appareil respiratoire, digestif et des organes. Après l’allongement, la zone de l’intestin postérieur devient la région pancréatique présumée, comme marqué par l’expression de la protéine de boîte homéotique de pancréas/duodénum de facteur de transcription 1 (PDX1)8,9,10. Les parties ventrales et dorsales de le PDX1+ gut tube épaissir à bourgeons pancréatiques de forme, qui sont marqués par la co-expression de pancréas transcription factor 1 sous-unité alpha (PTF1A) et NK6 boîte homéotique 1 (NKX6.1)8,11. Cette expression marque le début morphologique de l’organogenèse du pancréas. Les cellules pancréatiques endoderme, qui sont des composants des bourgeons pancréatiques, forment un réseau tubulaire ramifié de structures épithéliales12 et finalement se différencient en cellules exocrines et endocrines, dont les cellules insulino-sécrétrices β et α-cellules qui sécrètent du glucagon. Expression de PDX1 est détectée tout d’abord à la région pancréatique présumée, qui est ensuite observée tout au long de tout le développement du pancréas et montre la localisation de cellules β et δ9,13,14. Bien que le Pdx1+ zone de cellule qui n’exprime pas Ptf1a ou Nkx6.1 se différencie dans l’antre gastrique, duodénum, biliaires extrahépatiques et certaines cellules de l’intestin au milieu d’un stade avancé du développement chez la souris9, PDX1+ les cellules sont considérés comme les ancêtres du pancréas aux premiers stades du développement chez l’homme.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules pour la génération des lignées du pancréas. La protocole initiés différenciation par ensemencement dissocié monocellules15,16,17. Généralement, hPSCs indifférenciées sont mémorisées dans des colonies ou des agrégats de cellules en suspension ou en adhérence. En conséquence, la plupart des protocoles initient la différenciation peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes à des hétérogénéités spatiales et transcriptionnelle18,19,20,21,22, qui pourrait entraver la première étape de différenciation vers endoderme définitif suivie de différenciation inefficace à PDX1+ cellules. Le présent protocole peut proposer un maniement facile pour améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvées pour différencier inefficacement de lignées endodermiques et PDX1+ cellules23, 24 , 25.

<table><tbody><tr><td>Acide benzoïque 3-Keto-N-aminoethyl-N&prime ;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtalényl)-1-propényl]-benzoïque</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CDX2 [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>Anti-CDX2, &times ; 1/1000 dilution</td></tr><tr><td>B-27 Supplément (50 &times ;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Supplément sans sérum</td></tr><tr><td>BD FACSAria II Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Pour cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Congélateur biomédical</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>Pour -30 &deg ; C</td></tr><tr><td>Stockage Lames de comptage cellulaire pour compteur de cellules TC10/TC20, double chambre</td><td>BIO-RAD</td><td>1450011</td><td>Lame de comptage en verre</td></tr><tr><td>PLAQUE MULTIPUITS DE CULTURE CELLULAIRE, 6 PUITS, PS, TRANSPARENT</td><td>Greiner bio-one</td><td>657165</td><td>Pour la culture de différenciation/plaque à 6 puits</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>TOMY</td><td>AX-310</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>BANC PROPRE</td><td>SHOWA KAGAKU&nbsp ;</td><td>S-1601PRV</td><td>Banc propre</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Plaque à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Pour la culture sans alimentation de hPSC/plaque à 6 puits</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice de membrane basale Facteur de croissance réduit</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrice de membrane basale</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC Substrat</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>Pour la culture sans alimentation de hPSC/matériau de surface synthétique pour hPSC</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>Leica CM1510 S</td><td>Pour l’immunocoloration des agrégats.</td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>tampon de permanente/lavage est&nbsp ; Tampon de perméabilisation/lavage. Le tampon Cytofix/Cytoperm est un tampon de fixation et de perméabilisation.</td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Pour l’immunomarquage d’agrégats</td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 488 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Anticorps secondaire, &times ; 1/500 dilution</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>Anticorps secondaire, &times ; dilution 1/500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Anticorps secondaire, &times ; dilution 1/500</td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Sérum d’âne</td></tr><tr><td>D-PBS(-) sans Ca ou Mg</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Pour la culture sans alimentation de hPSCs/milieu d’entretien hPSC</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre à cellules Capuchon à pression</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>5 mL Tube en polystyrène à fond rond Corning 5 mL avec filtre à cellules</td></tr><tr><td>Pointe filtrante, 1 000 & micro ; L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>S’utilise avec des pipettes</td></tr><tr><td>Pointe Filtre, 20 & micro ; L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>À utiliser avec des pipettes</td></tr><tr><td>Pointe de filtre, 200 & micro ; L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>Utilisation avec des pipettes</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>Pour l’immunocoloration</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td>Incubateur</td></tr><tr><td>HNF-1&beta ; Anticorps (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta ;, &times ; dilution 1/200</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha ; Anticorps (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha ;, &times ; dilution 1/200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Pour la coloration du noyau, &times ; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Pancréas humain ARN total</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Anticorps PDX-1/IPF1 humain</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, IgG de chèvre, &times ; dilution 1/200</td></tr><tr><td>Anticorps humains SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Anti-SOX17, &times ; dilution 1/200</td></tr><tr><td>MEM amélioré Option moyenne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>Chambre d’incubation</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>Pour l’immunocoloration des agrégats Gants d’examen</td></tr> en <tr><td>latex</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS verre diapositive enduit</td><td>Matsunami Glass</td><td>83-1881</td><td>Pour immunocoloration des agrégats</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Plaque de réaction à 96 puits</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>Pour microscope RT-qPCR</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Microtube</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&alpha ;-Fetoprotéine</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>Anti-AFP, &times ; 1/200 dilution</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>Oligo sur mesure</td><td>Pour la RT-qPCR de la séquence est « TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT »</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, poudre</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA, fixateur, dilué dans DPBS</td></tr><tr><td>Réfrigérateur pharmaceutique</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td><td>Pour 4 &deg ; C stockage</td></tr><tr><td>PIPETMAN P&nbsp ;</td><td>Pipette GILSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humaine KGF/FGF-7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>Noggin Humain Recombinant</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>Recombinant Humain/Souris/Rat Activine A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu ; L)</td><td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNase-free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec L-Gln</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>Film d’étanchéité pour temps réel</td><td>Takara</td><td>NJ500</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques 10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, &times ; 1/200</td></tr><tr><td>dilution StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientifique</td><td></td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td>Pour l’immunocoloration des agrégats</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II&nbsp ;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20 Compteur de cellules automatisé</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>Compteur automatique</td></tr><tr><td>de cellules Tissue-Tek Composé OCT 4583&nbsp ;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>Pour l’immunocoloration des agrégats</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Moules/Adaptateurs</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>Pour l’immunocoloration des agrégats</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur ultrafroid</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>Pour -80 &deg ; C stockage</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Diluer avec DPBS pour préparer 0,5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Pour RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>

génération efficace du pancréas/duodénum homéotique protein 1+ postérieure foregut/pancréatique progéniteurs de hpscs dans les cultures de l’adhérence

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule pour la médecine régénérative et une plate-forme pour l’étude des processus de développement humains. Réalisé par étapes de différenciation qui récapitule les processus de développement est un des principaux moyens pour générer des cellules pancréatiques y compris pancréas/duodénum homéotique protéine 1+ (PDX1+) des cellules progénitrices pancréatiques. Les protocoles classiques initient la différenciation avec petites colonies peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes aux hétérogénéités, qui pourraient entraver la différenciation à PDX1+ cellules. Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules. Le protocole consiste en quatre étapes et initie la différenciation par ensemencement monocellules dissociées. L’induction de SOX17+ cellules de l’endoderme définitif a été suivie par l’expression des marqueurs de tube deux intestin primitif, HNF1β et HNF4α et différenciation éventuelle en PDX1+ cellules. Le présent protocole offre une manipulation facile et peut améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvés à se différencier de manière inefficace en lignées endodermiques ou PDX1+ cellules.

HiPSCs multiplication (585A129,30) se condensent et forment une monocouche homogène (Figure 1 b) qui convient à la différenciation. HiPSCs indifférenciés (stade 0) sont dissociées et re-graines comme des cellules individuelles à faible densité (1-1. 5 x 105 cellules/cm2). Moins de 1 h, les cellules sont fixées à la plaque et commencent à montrer la partie saillante. Jour 1, les cellules sont se sont multipliés e...

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Le principal avantage de cette technique est qu’avant la stimulation, les cellules sont dispersées uniformément, puis stimulées uniformément dans l’adhérence cellulaire en tandem. Azuma Kimura, étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, transférer six millilitres de RPMI 1640 dans un tube refroidi à quatre degrés Celsius sur la glace.À l’aide de pointes de pipette refroidies d’un millilitre, ajouter deux milligrammes de matrice membranaire du sous-sol. Bien mélanger par pipetting doux pour en faire une matrice membranaire sous-sol avec une concentration de 0,33 milligramme par millilitre. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer deux millilitres de la matrice de membrane diluée du sous-sol dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 60 à 90 minutes. Après cela, garder la plaque à température ambiante jusqu’à trois heures, jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Tout d’abord, aspirer le milieu utilisé et utiliser une pipette pour ajouter deux millilitres de 0,5 millimolar EDTA à chaque puits pour laver les hPCS cultivés dans la plaque de six puits.Ensuite

efficient-generation-pancreasduodenum-homeobox-protein-1-posterior

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Biologie du développement

Ici, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une...

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 + progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Protocoles pour générer des lignes de mutants HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR et de différencier hPSCs dans les cellules ß-like glucose-sensibles sont décrits. La combinaison de la technologie d'édition génome avec une différenciation HPSC dirigée fournit une plate-forme puissante pour l'analyse systématique du rôle des déterminants de la lignée dans le développement humain et de la progression de la maladie.

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Nous présentons ici un protocole pour produire de l’insuline exprimant 3D pancreatoids murin de progéniteurs pancréatique flottant e10.5 dissocié et le mésenchyme associé.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

Ce protocole présente une comparaison entre deux protocoles d’induction différents pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) vers des lignées pancréatiques in vitro: le protocole intégratif et le protocole non intégratif. Le protocole intégratif génère plus de cellules productrices d’insuline (PI).

In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

Le présent protocole décrit une méthode améliorée pour augmenter la co-expression des facteurs de transcription PDX1 et NKX6.1 chez les progéniteurs pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans des monocouches planes. Ceci est réalisé en reconstituant la matrice fraîche, en manipulant la densité cellulaire et en dissociant les cellules endodermiques.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en précurseurs de cellules bêta pancréatiques dans un système de culture 2D

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Les cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules souches peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment des thérapies cellulaires pour la dégénérescence rétinienne, la modélisation de maladies et des études de médicaments. Nous présentons ici un protocole simple pour dériver de manière reproductible l’EPR à partir de cellules souches.

Dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

Apprenez à différencier les cellules souches pluripotentes humaines en progéniteurs pancréatiques PDX1+ homogènes par culture en monocouche adhérente. Cette méthode permet une manipulation génétique efficace pour la recherche en médecine régénérative.

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence (Vidéo) | JoVE Journal

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1⁺ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

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