Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1⁺ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1⁺ (PDX1⁺) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Le principal avantage de cette technique est qu’avant la stimulation, les cellules sont dispersées uniformément, puis stimulées uniformément dans l’adhérence cellulaire en tandem. Azuma Kimura, étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, transférer six millilitres de RPMI 1640 dans un tube refroidi à quatre degrés Celsius sur la glace.

À l’aide de pointes de pipette refroidies d’un millilitre, ajouter deux milligrammes de matrice membranaire du sous-sol. Bien mélanger par pipetting doux pour en faire une matrice membranaire sous-sol avec une concentration de 0,33 milligramme par millilitre. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer deux millilitres de la matrice de membrane diluée du sous-sol dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 60 à 90 minutes. Après cela, garder la plaque à température ambiante jusqu’à trois heures, jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Tout d’abord, aspirer le milieu utilisé et utiliser une pipette pour ajouter deux millilitres de 0,5 millimolar EDTA à chaque puits pour laver les hPCS cultivés dans la plaque de six puits.

Ensuite, aspirez l’EDTA des puits et ajoutez deux millilitres d’EDTA frais de 0,5 millimolaire à chaque puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, aspirer l’EDTA de chaque puits.

Ajouter un millilitre de milieu d’entretien hPSC à température ambiante, complété par 10 micromolaires Y27632 à chaque puits. Pipette doucement mais rapidement pour souffler les cellules attachées sur la plaque et de dissocier toutes les cellules agglutinées en cellules individuelles. Transférer la suspension cellulaire dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres contenant quatre millilitres de milieu d’entretien hPSC complété par 10 micromolaires Y27632 par puits et mélanger par pipetting.

Ensuite, mélangez 15 microlitres de suspension cellulaire avec 15 microlitres de bleu trypan dans le tube. Utilisez une pipette de 10 microlitres pour transférer 10 microlitres de la suspension cellulaire diluée dans des diapositives de comptage cellulaire en double. À l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, comptez le numéro de cellule et calculez la densité cellulaire dans la suspension cellulaire.

Répartir la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres à une densité d’un à un million et demi de cellules pour chaque puits à utiliser. Centrifuger le tube à 200 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Après cela, utilisez une pipette pour aspirer le supernatant et suspendre à nouveau les cellules à l’aide d’un millilitre de milieu de stade 1A par puits.

Pipette doucement la suspension cellulaire, puis ajouter un autre millilitre de stade 1A milieu par puits. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, aspirez la matrice de membrane diluée du sous-sol à partir des puits de la plaque de culture cellulaire précédemment préparée. Pipette immédiatement la suspension dans le tube doucement et transférer deux millilitres dans chaque puits d’une plaque de six puits.

Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour la protéger de la lumière et placer la plaque sur un banc propre à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Après cela, transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et une atmosphère humidifiée pendant 24 heures. Tout d’abord, secouez doucement la plaque et utilisez une pipette pour aspirer le milieu utilisé.

Ajouter ensuite deux millilitres de DPBS à chaque puits. Secouez doucement la plaque à nouveau et aspirez le DPBS utilisé. Ajouter quatre millilitres de milieu de scène 1B, préchauffé à 37 degrés Celsius, à chaque puits.

Transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et une atmosphère humidifiée à la culture pendant 48 heures. Après cela, secouez doucement la plaque et aspirez le milieu utilisé. Ajouter deux millilitres de DPBS à chaque puits.

Répétez cette aspiration et l’ajout de DPBS une fois de plus. Secouez doucement la plaque et aspirez le DPBS utilisé. Ajouter quatre millilitres de milieu de scène 1B, préchauffé à 37 degrés Celsius, à chaque puits.

Transférer soigneusement la plaque dans un incubateur, à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et une atmosphère humidifiée à la culture pendant 24 heures. Tout d’abord, secouez doucement la plaque et aspirez le milieu utilisé. Ajouter deux millilitres de DPBS à chaque puits de la plaque de six puits.

Ensuite, secouez doucement la plaque et aspirez le DPBS utilisé. Ajouter quatre millilitres de la deuxième étape moyenne, préchauffée à 37 degrés Celsius, à chaque puits. Transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et une atmosphère humidifiée à la culture pendant quatre jours.

Agiter délicatement la plaque et aspirer le milieu utilisé. Ajouter deux millilitres de DPBS à chaque puits. Répétez ce processus d’aspiration et d’ajout de DPPS une fois de plus.

Après cela, secouez doucement la plaque et aspirez le DPBS utilisé. Ajouter quatre millilitres de l’étage trois moyen, préchauffé à 37 degrés Celsius, à chaque puits. Transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et une atmosphère humidifiée à la culture pendant trois jours.

Dans cette étude, les hIPSE de propagation sont condensés et forment un monocouche homogène qui convient à la différenciation. Les hIPSE indifférenciés sont dissociés et résédités en cellules individuelles à faible densité cellulaire. Dans l’heure qui suit, les cellules sont fixées à la plaque et commencent à montrer une saillie.

Le premier jour, les cellules sont proliférées et bien réparties pour couvrir 80 à 90% de la surface. Les jours trois et quatre, les cellules forment une feuille de monouche homogène qui peut être décrite comme une apparence pavée. À ce stade, la plupart des cellules cessent d’exprimer SOX2, qui est un marqueur pour les cellules indifférenciées, et au lieu d’exprimer un marqueur endoderm définitif, SOX17, à plus de 90%Most SOX17 cellules positives expriment FOXA2.

Ensuite, les cellules commencent à exprimer les marqueurs primitifs de goptupe, HNF1-bêta et HNF4-alpha, et expriment par la suite un marqueur progéniteur pancréatique postérieur de foregrate, PDX1, à plus de 90%L’induction cellulaire PDX1-positive est reproductible dans une autre ligne de hIPSE, 1231A3, et une ligne hESE, KhES-3. Les résultats du QRTPCR de l’expression mrna des marqueurs de stade sont compatibles avec l’immunostaining et l’expression mrna de PDX1 est évidente à l’étape trois et augmente sensiblement après. Puisque les cellules ESIPS indifférenciées sont cultivées en colonies, les cellules individuelles sont localement dans un état différent.

Ce protocole fournit un moyen de stimuler les cellules uniformément pour la différenciation élue.