Isolement de cellules souches intestinales et de la Culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les effets de l’ischémie intestinale sur les cellules souches épithéliales intestinales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules souches, telles que la résistance des cellules souches aux lésions et leur contribution à la réparation après une lésion ischémique. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un grand modèle animal qui peut être utilisé pour l’étude des maladies intestinales cliniques et de leur réparation.

Amy Stieler Stewart, une étudiante diplômée, et John Freund, un spécialiste de la recherche de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par utiliser une lame de scalpel pour faire une incision ventrale de huit à 10 centimètres sur la ligne médiane de l’abdomen centrée sur l’ombilic d’un porc croisé Yorkshire de huit à 10 semaines. Localisez le jéjunum, à environ 40 centimètres de la jonction iléo-caecale.

Ligaturez l’intestin circonférentiellement deux fois pour délimiter des boucles de jéjunum de 10 centimètres de long avec un centimètre entre chaque ligature. Créez deux boucles par point temporel d’ischémie adjacentes l’une à l’autre, une pour l’ischémie et une pour l’ischémie avec une heure supplémentaire de reperfusion. Pour induire une ischémie complète réversible, utilisez des pinces vasculaires ou des hémostatiques bulldog pour obstruer environ trois vaisseaux mésentériques par pince pendant la période expérimentale appropriée.

Gardez l’abdomen couvert tout au long de la période ischémique. À la fin de l’expérience, utilisez des ciseaux de Metzenbaum pour prélever d’abord un morceau de contrôle du jéjunum normal à au moins cinq à 10 centimètres à proximité de la dernière anse ischémique, puis pour collecter le reste des anses. Stockez les boucles de chaque point de blessure dans de petits récipients de PBS glacé jusqu’à l’isolement de la crypte.

Pour isoler les cellules souches de la crypte, utilisez un fil de calibre 20 et une pince à tissus pour inverser chaque boucle de l’intestin grêle afin que la surface de la muqueuse soit exposée. Suturez solidement le haut et le bas de chaque boucle au fil et rincez chaque boucle inversée dans du PBS glacé. Lorsque tous les débris luminaux ont été éliminés, placez immédiatement les échantillons dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 30 millilitres de réactif de dissociation numéro un sur de la glace pendant 30 minutes avec agitation et inversion toutes les cinq minutes.

À la fin de la période d’incubation, transférez les échantillons dans des tubes correspondants de 50 millilitres contenant 30 millilitres de réactif de dissociation numéro deux et granulez les échantillons de la boucle ischémique de deux à quatre heures par centrifugation. Remettez les pastilles en suspension dans cinq millilitres de PBS et utilisez une aliquote de 50 microlitres de chaque échantillon pour vérifier le degré d’association de la crypte et la quantité de débris par microscopie optique. Ensuite, placez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes en secouant ou en inversant toutes les cinq minutes.

Ensuite, transférez les échantillons directement dans 25 millilitres de PBS glacé sur glace dans un agitateur orbital réglé à 60 tr/min pour deux à cinq minutes d’agitation avec agitation manuelle supplémentaire ou inversion toutes les 30 secondes. À la fin de l’incubation par agitation, vérifiez le degré d’association des cryptes et la quantité de débris et transférez les échantillons dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres contenant 25 millilitres de PBS froid pour agiter jusqu’à ce que les cryptes intactes soient isolées avec un minimum de débris et de villosités. Lorsque les anses ont été complètement dissociées, retirez le tissu restant, granulez les échantillons par centrifugation et remettez en suspension les pastilles de crypte restantes dans cinq millilitres de PBS frais.

Ensuite, aliquote 150 cryptes par tube dans des tubes de microcentrifugation individuels et granulation des cryptes par microcentrifugation. À l’aide d’une pipette pré-refroidie, remettez doucement les granulés en suspension avec 50 microlitres de mélange principal par puits, puis pipetez rapidement 15 fois pour mélanger. Ensuite, versez une gouttelette de crypte de 50 microlitres au centre de chaque puits d’une plaque pré-vermifugée et quadrillée à 24 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Après 30 minutes, superposez chaque galette matricielle avec 500 microlitres par puits de milieu de cellules souches épithéliales intestinales, en ajoutant 500 microlitres de PBS stérile à tous les puits inutilisés pour maintenir l’humidité et compter le nombre de cryptes plaquées, jour zéro. Ajoutez des facteurs de croissance dans chaque puits toutes les 48 heures, en remplaçant le surnageant toutes les 96 heures par 500 microlitres de milieu frais supplémenté en facteurs de croissance. L’ischémie intestinale complète est créée dans les anses de l’intestin grêle en utilisant l’occlusion vasculaire avec des sutures ou des pinces, comme illustré.

Si elle est effectuée correctement, la lésion ischémique commencera à l’extrémité des villosités intestinales et migrera vers le bas dans la crypte à mesure que la durée de l’ischémie augmente. Une erreur courante avec la technique chirurgicale peut se produire lorsque les vaisseaux sanguins ne sont pas ligaturés ou clampés uniformément, ce qui entraîne une ischémie hémorragique dans laquelle la veine à paroi mince s’effondre avant l’artère, permettant au sang supplémentaire de s’infiltrer dans les tissus. Suite à l’ablation des anses intestinales ischémiques, les cryptes intestinales peuvent être isolées avec succès en suivant le protocole de dissociation comme nous venons de le démontrer.

Les cryptes des points temporels les plus gravement endommagés sont souvent brisées et contiennent plus de débris cellulaires de fond par rapport à celles qui ne subissent aucun dommage ou des dommages légers. Lorsque des cryptes intestinales normales et légèrement endommagées sont mises en culture, des entérosphères se forment dans les 24 à 48 heures. Avec des lésions ischémiques graves, les cryptes intestinales survivent mais sont endommagées, ce qui entraîne la formation de sphères beaucoup plus petites au départ.

Au bout de 72 à 120 heures, les entéroïdes de toutes les cryptes deviennent plus complexes avec des lumières centrales évidentes et des structures bourgeonnantes, et avec une diminution globale de l’efficacité de la croissance des cryptes, ainsi qu’une diminution de la taille des entéroïdes dérivés du tissu intestinal gravement endommagé. Une fois maîtrisées, les procédures de placage isolant de la crypte peuvent être terminées en deux à trois heures environ si elles sont effectuées correctement. Il est préférable que les cryptes collectées pour le placage proviennent de lavages et non de fractions de dissociation en raison de la probabilité accrue de contamination de la culture dans la fraction de dissociation.

Cette méthode peut également être utilisée pour tester l’efficacité des médicaments dans le traitement des lésions épithéliales résultant d’une ischémie plus ou moins reperfusion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie gastro-intestinale pour explorer l’impact de l’ischémie sur l’épithélium, en particulier sur les cellules souches intestinales, dans un modèle de grand animal translationnel et cliniquement pertinent. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une ischémie intestinale avec ou sans reperfusion ainsi que d’isoler les cryptes intestinales pour la culture 3D suite à des lésions in vivo.