Name: Isolement de cellules souches intestinales et de la Culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Apprenez l'isolation et la culture de cellules souches intestinales dans un modèle porcin d'ischémie segmentaire. Cette méthode permet d'étudier la réparation épithéliale après lésion ischémique.

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Ce projet a été soutenu par les NIH K01OD0199 NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 et Département des Sciences cliniques, diffusion fonds

Pour ces expériences, toutes les études animales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de North Carolina State University.
1. préparation de la Culture
Remarque : Tous les réactifs sont répertoriés dans la Table des matières. Les concentrations de facteur de croissance spécifiques sont répertoriées dans le tableau 1.
<ol><li>Préparer une solution d’acide (EDTA) éthylènediaminetétraacétique 0,5 M dans l’eau désionisée distillée (ddH2O). Mélanger convenablement et ajuster le pH à 7.4 à l’aide de solutions de NaOH ou HCl. NOTE : Composent solution d’EDTA frais avant chaque expérience.</li>
	<li>Préparer le réactif de dissociation #1 (DR #1) comme suit et le placer sur la glace : tamponnée au phosphate de combiner une solution saline sans Ca2 + et Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1, 4-le dithiothréitol (DTT), 10 µM Y27632 et 1 X antibiotique-antimycosiques solution (anti-Anti) contenant de la pénicilline, la streptomycine et amphotéricine b. NOTE : Ajouter Y27632 immédiatement avant le prélèvement de tissu.</li>
	<li>Préparer le réactif de dissociation #2 (DR #2) comme suit et le placer dans un bain-marie à 37 ° C : PBS de combiner sans Ca2 + et Mg2 +, EDTA de 0,5 M, 10 µM Y27632 et 1 X anti-Anti. NOTE : Ajouter Y27632 immédiatement avant le prélèvement de tissu.</li>
	<li>Préparer les cellules souches épithéliales intestinales (IESC) médias comme suit : Mélanger 25 mL avancé le milieu DMEM/F12 avec 1 Supplément N2 X, 1 X B-27 supplément, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax et 1 X anti-Anti. Conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Préparer un mélange maître de facteur de croissance réduite membrane basale matrix (matrice) et des facteurs de croissance supplémentaires comme suit : dégeler la matrice sur la glace. Dans un tube de microcentrifuge, ajoutez 100 ng/mL caboche humaine recombinante, 500 ng/mL 1 R-Spondin humaine recombinante, 50 ng/mL recombinant humain facteur de croissance épidermique (EGF), 100 ng/mL Wnt3a humaine recombinante, 10 mM, Nicotinamide, gastrine nM 10 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 et inhibiteur de kinase 3 2,5 µM glycogène synthase (GSK3i, CHIR99021). Lorsque la matrice est décongelée, compléter avec le mélange de facteur de croissance (fabrication de mélange principal) et stocker sur la glace. Remarque : Veillez à éviter l’introduction de bulles d’air car cela créera artefact dans la galette de la matrice au cours de l’électrodéposition.</li>
	<li>Préchauffer un plat de 24 puits tissue culture dans un incubateur à 37 ° C avant de commencer les procédures d’isolement cellulaire.</li>
</ol>2. modèle chirurgical de l’ischémie et prélèvement tissulaire
<ol><li>Utilisation de huit à dix semaines Yorkshire croisés porcs des deux sexes (recommandé). Supprimer tous les aliments pour animaux 16-18 h avant la chirurgie. Permettre aux porcs accès à l’eau en permanence.</li>
	<li>Planifier les porcs pour arriver au moins 48 h avant les expériences permettant l’acclimatation environnementale. Remarque : Des techniciens vétérinaires et/ou biologique, supervisés par un vétérinaire licencié fournissent des soins courants aux animaux et assistance aux procédures anesthésiques.</li>
	<li>Premedicate le cochon avec la xylazine (1,5 mg/kg par voie intramusculaire (IM)) et la kétamine (11-20 mg/kg (IM))15. Une fois calme, intuber l’orotracheally de porc.</li>
	<li>Maintenir les porcs sous anesthésie générale à l’isoflurane (2-5 %), vaporisé dans 100 % O2 jusqu’au moment de l’euthanasie.</li>
	<li>Placer le cathéter intraveineux (IV) (veine d’oreille recommandé) et administrer un fluide de remplacement comme solution de Ringer à un taux de maintenance de 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Exécuter la routine anesthésique suivi y compris oxymétrie de pouls, électrocardiographie et de mesures indirectes artérielle15. Surveiller la fréquence respiratoire du porc et l’effort et ventiler manuellement ou mécaniquement au besoin si fin marée CO2 s’élève au-dessus de 55 à 60 mmHg. Remarque : Une anesthésie appropriée est confirmée par une surveillance continue des tendances de la fréquence cardiaque (plage 80-130 battements/min), la pression artérielle non invasive (moyenne pression artérielle 75-100 mmHg) et la fréquence respiratoire (10-25 respirations/min)16et vérification périodique absence de mâchoire et tonus anal. Profondeur de l’anesthésie peut également être jugée selon le degré de la relaxation musculaire et fasciculation musculaire après stimulation chirurgicale. Réflexes oculaires sont généralement d’aucune valeur16. L’analgésie peut être fournie selon les directives de la politique IACUC institutions. Dans ce cas, un opioïde, comme la buprénorphine, peut être administré pendant une intervention chirurgicale.</li>
	<li>Placez le cochon sur un coussin chauffant et restrain en décubitus dorsal pour l’intervention chirurgicale.</li>
	<li>Se raser l’abdomen ventral et de préparation à l’aide du chirurgien (solution de chlorhexidine) et l’alcool isopropylique.</li>
	<li>Faites une incision de la ligne médiane ventrale de 8-10 cm à l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton, centrée à l’ombilic à accéder à l’abdomen.</li>
	<li>Identifier l’intestin grêle (jéjunum) environ 40 cm par voie orale à la jonction iléo-caecale. Délimiter les boucles longues de 10 cm de jéjunum en circonférence ligaturant l’intestin deux fois, un cm entre chaque ligature, avant de créer les boucles 10 cm situé par voie orale (Figure 1).</li>
	<li>Créer deux boucles par point dans le temps d’ischémie adjacent à l’autre, l’un pour l’ischémie et l’autre pour ischémie avec 1h de reperfusion supplémentaires si vous le souhaitez. Pour créer une ischémie complète (pas de débit des artères ou des veines), pince ou ligaturer les vaisseaux mésentérique utilisant des clamps vasculaires bulldog, hémostatique de moustique Halstead courbe ou soie non résorbable 2-0 pour 1, 2, 3 et 4h et puis retirer les pinces pour 1h de reperfusion, si vous le souhaitez. Remarque : Les auteurs créé toutes les boucles de l’ischémie en ordre en commençant par la boucle ischémique de 4h et progressait de déplacement dans la partie proximale (minimiser le temps total de la chirurgie). Pour répondre à la possibilité que les voisins des segments intestinaux ischémiques peuvent endommager boucles adjacentes, l’ordre des boucles ischémiques peut varier. Cela peut modifier la durée chirurgicale totale. NOTE : Le délai de reperfusion peut varier selon la question de recherche d’intérêt ou si les thérapies souhaitent être contrôlées au cours de la période de reperfusion. Toutefois, comme des lésions tissulaires devient plus sévère de l’augmentation des durées d’ischémie seul, lésion de reperfusion probable ne contribue pas à une aggravation du préjudice épithélial. Reperfusion joue-t-il probablement un rôle après des périodes douces d’une lésion ischémique.</li>
	<li>Entre moments d’ischémie, garder l’abdomen couverte ou fermée à l’aide d’une serviette stérile et/ou une pince serviette. Remarque : Au sein d’un seul animal pour cette expérience, huit segments ischémiques peuvent être créés. Identifier un segment jéjunal supplémentaires, au moins 5-10 cm de proximal à la dernière boucle ischémique, qui servira de témoin interne normale.</li>
	<li>Obstruez environ trois vaisseaux mésentériques par pince vasculaire bulldog ou hémostatique de moustique Halstead courbe. Il faut lors de l’application de la pince hémostatique car les vaisseaux sont facilement traumatisés. Essayez d’empiler les vaisseaux dans les mâchoires de la pince.</li>
	<li>À la fin de l’expérience, suivant l’euthanasie avec pentobarbital 85-100 mg/kg IV, recueillir toutes les boucles du tissu à l’aide de ciseaux de metzenbaum, après que la mort a été confirmée sans auscultated du rythme cardiaque et de la perte du réflexe cornéen. Commencez par recueillir un morceau de contrôle de jéjunum normal au moins 5 - 10 cm proximaux à la dernière boucle ischémique.</li>
	<li>Trient et stockent les boucles de chaque instant de blessure dans de petits contenants de PBS de glace froide jusqu’au moment de l’isolement de la crypte. Remarque : Si vous le souhaitez, faire ischémique boucles assez longtemps pour diviser en échantillons distincts pour l’histologie et de la culture de cellules souches intestinales ; Cependant, les auteurs ont trouvé que les boucles supérieures à environ 10 cm de long sont plus susceptibles de devenir hémorragiques.</li>
</ol>3. crypte (cellules souches) Isolation d’ischémique et le contrôle des boucles
<ol><li>Il faut inverser chaque boucle de l’intestin grêle à l’aide d’un fil de calibre 20 et forceps tissue d’exposer la surface de la muqueuse. Attachez le haut et le bas de la boucle solidement au fil à l’aide de la suture (2-0 soie non résorbables ou équivalent).</li>
	<li>Après inversion, rincer chaque boucle dans du PBS froid glace pour enlever les débris luminale.</li>
	<li>Placer les échantillons immédiatement sur les tubes coniques de 50 mL contenant DR #1 sur la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Collecter les lignes commençant par contrôle et suivez avec boucles d’accroître progressivement la durée d’ischémie. Boucles de moins (c.-à-d. contrôle et 1 h tissu ischémique) les tissus endommagés peuvent être secoués vigoureusement, enclenchant le poignet pour de meilleurs résultats. Tissus de tissus gravement endommagés (3 et 4 h d’ischémie) devraient être doucement bercés ou inversés seulement car trop d’agitation provoquerait une perturbation de la crypte et la destruction des tissus supplémentaires. Tubes doivent être secoués ou inversés toutes les 5 min alors que sur la glace.</li>
	<li>Transférer les échantillons dans DR #2 pendant 10 min dans un bain-marie à 37° C. Agiter ou inverser les tubes toutes les 5 min.</li>
	<li>Après avoir transféré les tissus, centrifuger les tubes coniques contenant DR #1 des boucles de 2 à 4 h endommagé pour éliminer le surnageant EDTA (200 x g pendant 5 min). Comme ces tissus sont très endommagés, il est possible des que cryptes ont déjà devenir dissociées. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot avec un petit volume de PBS (5 mL) et passez à l’étape 3.9.</li>
	<li>Prélèvement d’échantillons de DR #2 et placer les échantillons de tissu directement dans 25 mL de PBS froid sur la glace (étiquette que lavage #1). Placer les échantillons dans un agitateur orbital sur glace à 60 tr/min. Continuer à secouer ou inverser chaque tube pendant 30 s toutes les 2 à 5 min.</li>
	<li>Après avoir transféré les tissus, spin les tubes coniques contenant DR #2 de la 2-4 h endommagé boucles pour éliminer le surnageant d’EDTA (200 x g pendant 5 min). Comme ces tissus sont fortement endommagés, il est possible que les cryptes ont devenu dissociées. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot avec un petit volume de PBS (5 mL) et passez à l’étape 3.9.</li>
	<li>Enlever une quantité de 50 µL de lavage #1 (ou de la République dominicaine) pour vérifier le degré de dissociation de la crypte et la quantité de débris. Placer le tissu dans un nouveau tube conique de 50 mL (lavage #2, #3, etc.) rempli de 25 mL de froid PBS et agiter jusqu'à ce qu’intactes cryptes sont isolés avec des débris minime et villosités. NOTE : L’objectif est de pouvoir isoler une fraction propre avec intactes cryptes et débris minime. Chaque lavage supplémentaire va nettoyer les cellules cependant trop d’agitation commence à causer des dommages secondaires de tissus/cellules. En outre, les meilleurs résultats avec moins de contamination seront fera si les cryptes sont plaqués d’une étape de lavage et non d’une étape de réactif de dissociation.</li>
	<li>Enlever le tissu restant puis centrifuger les tubes coniques de 50 mL à 200 x g pendant 5 minutes pour éliminer le liquide surnageant resuspendre restant le culot de la crypte en plus petit volume de PBS (5 mL).</li>
	<li>À l’aide d’un microscope inversé, examiner 50 µL d’extraits de chaque échantillon afin de déterminer le nombre de cryptes/fraction. L’objectif est de 50-100 µL de cryptes/50, car ce sera la taille de la galette de la matrice finale. Remarque : Si l’échantillon est trop concentrée, continuer à ajouter des PBS froide jusqu'à obtenir la concentration désirée. Si l’échantillon est trop dilué, déterminer le nombre de parties aliquotes nécessaires pour atteindre le rendement désiré crypte et ajuster.</li>
	<li>Aliquotes ou les volumes appropriés des cryptes (déterminées par des observations aliquotes) dans un tube de microcentrifuge. Par exemple, si l’échantillon contient 50 µL de cryptes/50 puis aliquote 50 µL par patty réplique X 3 = 150 µL / tubes de microcentrifuge. Si l’échantillon ne contient que 25 µL de cryptes/50 puis 2 aliquotes nécessaires / patty X 3 réplique = 300 µL/tube.</li>
	<li>Cryptes de pellet à 200 x g pendant 5 min à 4° C.</li>
	<li>Doucement remettre en suspension les cryptes granulés avec un volume approprié de mélange principal (50 µL / puits). Bien mélanger par pipetage rapidement 15 fois sans créer de bulles d’air. NOTE : Refroidir préalablement l’embout de la pipette avec froide PBS stérile avant d’aspirer le mélange principal. Cela aidera à garder les master mix d’étendage. Conseils aussi peuvent être conservés au réfrigérateur et placés dans la hotte immédiatement avant leur utilisation.</li>
	<li>Distribuer un mélange maître µL, 50 plus goutte crypte au centre de chaque puits d’une plaque bien 24 préchauffé.</li>
	<li>Incuber la plaque de culture pendant 30 min à 37 ° C.</li>
	<li>Superposer chaque galette de matrice avec 500 µL / puits de médias IESC (aucun facteur de croissance supplémentaire nécessaire au jour 0, car elles sont contenues dans le mélange maître).</li>
	<li>Ajouter 500 µL PBS stérile à n’importe quel puits inutilisés à gauche sur la plaque à maintenir l’humidité.</li>
	<li>Compter nombre de cryptes plaqués le jour 0. Remarque : Il est utile de la pré-grille, chaque cellule culture plaque en quadrants pour aider à assurer un comptage plus précis.</li>
	<li>Compter le nombre d’enterospheres toutes les 24 h et surveiller pour le développement d’enteroid tous les jours.</li>
	<li>Ajouter des facteurs de croissance pour chaque bien chaque 48 h. Retirez les médias IESC toutes les 96 h et remplacez-le par supports neufs de 500 µL (facteurs de croissance doivent ensuite être ajoutés aux médias).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’élaboration d’un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire élargit les précédents modèles murins en tenant compte de l’étude de plusieurs points dans le temps d’une lésion tissulaire dans le même animal. Il y a plusieurs points de la discussion critique du présent protocole, y compris la ligature bon navire, reperfusion tissulaire et culture cellulaire crypte réussie.
La ligature de navire adéquat est essentielle à la création d’un modèle d’ischémie complète. Si la suture est liée de façon inégale ou la pince pas vissé complètement, sang de l’artère à parois épaisses peut-être continuer à entrer dans le tissu et ne peut pas sortir en raison de l’effondrement de la veine à paroi mince. Cela se traduit par l’extravasation du sang dans la lamina propria, causant des dommages de tissu supplémentaire. Toutefois, selon le type de lésion ischémique étudiée, ischémie complète ou hémorragique peut être souhaitable. Par exemple, dans le processus de transplantation intestinale, l’intestin est complètement séparé de l’apport vasculaire (artère et veine) pendant la phase de résection de la procédure, qui se traduit par une ischémie intestinale complète. Subsidiairement, toutefois, lorsque le mésentère est tordu lors d’un événement comme un volvulus intestinal, le retour veineux est souvent obstrué tout d’abord, menant à sang supplémentaire dans les tissus avant l’apport artériel étant obstrué, créant ainsi ischémie hémorragique.
Une lésion ischémique entraîne des lésions tissulaires à la pointe de villosités et de son prolongement jusqu'à la base de la crypte3. Au cours de l’ischémie, énergie sous la forme d’adénosine triphosphate continuent d’être utilisé et génère l’hypoxanthine métabolite. Lorsque le tissu est reperfusé avec l’oxygène, l’hypoxanthine est métabolisé par la xanthine oxydase et produit des radicaux libres de superoxyde conduisant à des lésions muqueuses et attraction de tissu endommageant neutrophiles17,18. Différences entre les espèces dans la muqueuse architecture vasculaire ainsi que l’expression variable de la xanthine oxydase, aboutir à des degrés divers de reperfusion injury3. Félines et rongeurs modèles d’ischémie-reperfusion sont plus sensibles aux lésions de reperfusion du oxygénées métabolites19,20. En revanche, porcs se sont révélés pour avoir moins xanthine oxydase et par conséquent moins lésion de reperfusion, rendant ce modèle plus comparable à celle de l’ischémie intestinale humaine21. A cette époque, l’utilisation de masquage ou modèles porcins transgéniques pour étudier les lésions intestinales n'a pas été décrites, ce qui en fait une limitation majeure de ce modèle. Le choix du modèle animal approprié dépend le processus de la maladie ou condition particulière le chercheur souhaite étudier. Par exemple, les modèles porcines de lésion ischémique jusqu'à 6 h ont été décrit22, tandis que des procédures plus ischémiques dans les modèles murins sont 45-60 min23.
Réussite de l’isolement des cryptes intestinales d’intestin normal et ischémie endommagé permet l’étude de récupération épithéliale en culture. Ce système permet au chercheur de se concentrer uniquement sur l’épithélium seul, comme il y a apport non vasculaire ou composante de cellules immunitaires à envisager. Cela offre la possibilité d’étudier les interactions entre les cellules épithéliales et récupération après une blessure en plus de la réponse à différents facteurs de croissance, ou des traitements administrés au cours de la chirurgie ou l’isolement de crypte suivants en complétant les milieux de culture. Cette étape reste le plus difficile, comme l’isolement des boucles gravement endommagés nécessite agitant doucement et une suppression rapide des solutions contenant de l’EDTA dans le cas où les cryptes ont devient prématurément dissocié. Si ces boucles d’intestin ne sont pas lavés, les cryptes ont le potentiel d’être contaminée dans la culture. Ainsi, la solution antibiotique-antimycosiques a été ajoutée à ces deux solutions DR en plus des médias IESC. Un autre point de discussion se concentre sur l’intestin recueillie dans un contrôle normal. Que les animaux subissent une anesthésie avec des altérations possibles dans la perfusion tissulaire systémique, ainsi que la possibilité de circuler des médiateurs inflammatoires secondaires à l’ischémie, tissu témoin même « normal » ne représente pas un véritable contrôle. Dans ces expériences, on remarque que le tissu témoin apparu grossièrement et histologiquement comparable aux tissus d’animaux qui n’ont pas subi d’ischémie dans d’autres expériences (Gonzalez, L.M., données non publiées, 2017).
En résumé, cette méthode décrit un modèle reproductible de l’ischémie intestinale porcin, qui modélise étroitement ce qui se passe dans une lésion ischémique humaine. En outre, l’isolement des cellules souches intestinales Loops ischémique est décrite, qui sert à étudier la réparation épithéliale et réponse possible au traitement dans la culture.

Une lésion ischémique intestinale, le résultat de la disponibilité de l’oxygène diminuée en raison d’une réduction ou une occlusion complète du débit sanguin dans l’intestin, reste une cause importante de morbidité et de mortalité chez les patients humains et animaux1,2. Dommages ischémiques, ainsi que l’inflammation subséquente et infiltration cellulaire, conduit au compromis de la barrière muqueuse. La barrière muqueuse est essentielle à la prévention de la translocation bactérienne et les toxines associées dans la circulation systémique3,4. La reperfusion subséquente des tissus ischémiques peut entraîner la formation d’endommager les espèces réactives de l’oxygène qui peuvent aggraver les blessures5. Ischémie intestinale étant rarement évitable, recherches plus récentes ont porté sur l’avancement des techniques de détection précoce d’ischémie et l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques qui réduisent la reperfusion blessures ou cible muqueuse réparation.
Des modèles animaux ont servi largement à élargir nos connaissances sur les sciences fondamentales d’ischémie-reperfusion et reste indispensable pour la recherche translationnelle. Les modèles de rongeurs ont été le plus largement utilisé en raison de leur capacité à être génétiquement manipulés6. Plus récemment cependant, l’utilisation de grands modèles animaux, plus particulièrement le porc, est préconisée pour les futures études translationnelles en raison d’un certain nombre d’avantages, y compris les similitudes anatomiques et physiologiques de porcs humains7,8. Une variété de modèles de lésion ont été développés pour l’étude d’ischémie-reperfusion et comprennent une occlusion vasculaire complete, faible débit ischémie et occlusion vasculaire mésentérique segmentaire. Un examen complet de ces modèles est en dehors du domaine de cet article, toutefois les auteurs directement lecteurs à une récente révision3.
En plus des modèles in vivo , l’utilisation des systèmes de culture cellulaire ex vivo propose un outil prometteur pour étudier l’homéostasie intestinale et la réparation après une blessure. Les cellules souches intestinales sont responsables de la prolifération cellulaire et le renouvellement de la muqueuse épithéliale intestinale. Lorsque isolées de l’intestin normal ou blessé, les cellules souches intestinales peuvent être maintenues en culture et servir de modèle pour l’étude des cellules souches et biologie des cellules épithéliales ou outil. Méthodes d’isoler et de mettre en place ces trois dimensions culture systèmes (appelés enteroids et colonoids lorsqu’il est dérivé de l’intestin de petite et grande, respectivement) ont été décrites pour une variété d’espèces et orgue systèmes9,10 ,11,12,13. Plus précisément, dans le tube digestif, ces systèmes de culture ont été utilisés pour les maladies gastro-intestinales modèle dont le cancer, infection par des pathogènes et de maladies inflammatoires de l’intestin14. Pour l’instant, il n’y a pas de rapports décrivant l’isolement et l’entretien des cellules souches intestinales de réponses blessé petit intestin chez toutes les espèces. Par conséquent, nous décrivons ici le processus d’ischémie intestinale dans un modèle porcin animal roman, large qui se traduit par des blessures reproductible et la capacité à isoler des cellules souches intestinales de l’intestin normal et ischémie blessé pour l’étude supplémentaire de récupération ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate, sans Ca2+, Mg 2+ Fisher</td><td>Scientific&nbsp ;</td><td>BP-399</td><td>Dilué 1:10</td></tr><tr><td>Eau distillée désionisée (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour préparer l’EDTA et le PBS</td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamene tétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Préparer frais avant chaque expérience ; pH 7,4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine/Amphotéricine B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Solution Anti-Anti</td></tr><tr><td>Recombinant humain Wnt-3a</td><td>R & D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Revenu humain recombinant1</td><td>R & D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Noggin humain recombinant R</td><td>& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>R & D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Humain [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>eau, WFI Quality</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Appelée eau stérile (SW) ; pour les stocks de facteurs de croissance</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Plat</td></tr><tr><td>de culture 24 puits</td> sans rouge de phénol <td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique, 50 ml&nbsp ;</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>Scalpel</td><td>Handle World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale en acier au carbone, n° 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Ciseaux Metzenbaum courbés</td></tr><tr><td></td><td>ou droits World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>pinces à moustiques, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Courbes ou droites (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Soie droite</td></tr><tr><td>, 2-0&nbsp ;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Toute marque similaire est acceptable</td></tr><tr><td>Pinces à serviettes</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Suture de fil, calibre 20</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Couper et redresser avant utilisation.</td></tr><tr><td>Serviettes chirurgicales</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Tout produit similaire est acceptable.</td></tr><tr><td>Solution de sonneurs lactés</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Gommage antiseptique au chlorhex (4 %)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Toute marque similaire est acceptable</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique 70 %</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Toute marque similaire est acceptable</td></tr><tr><td>Cathéter IV, calibre 22</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>Peut nécessiter 20g ou 24g selon la taille de la veine</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Médicament contrôlé</td></tr><tr><td>Solution d’isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (solution d’euthanasie Fatal Plus (390 mg/ml))Vortech</td> <td>Pharm.</td><td></td><td>Plusieurs marques de pentobarbital sodium disponibles.</td></tr><tr><td>Coussin chauffant&nbsp ;</td>Système de réchauffement central <td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump ; d’autres sont disponibles.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Toute pièce équivalente d’équipement de surveillance acceptable</td></tr><tr><td>Vaporisateur&nbsp ;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Recommandé d’utiliser un système de cercle avec pièce en Y ; plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Pompe à fluide</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+ ; Tout fabricant similaire est recommandé.</td></tr></tbody></table>

isolement de cellules souches intestinales et de la culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Ischémie intestinale reste une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients humains et vétérinaires. De nombreux processus morbides se traduire par ischémie intestinale, l’approvisionnement en sang et donc l’oxygène est diminuée à l’intestin. Ce qui conduit à la perte de la barrière intestinale et endommager les tissus sous-jacents. Les cellules souches intestinales se trouvent à la base des cryptes de Lieberkühn et sont responsables du renouveau intestinal au cours de l’homéostasie et après une blessure. Ex vivo des techniques de culture cellulaire ont permis l’étude réussie des interactions entre cellules souches épithéliales en établissant les conditions de culture qui favorise la croissance des systèmes tridimensionnels à analogues aux organes épithéliales (appelé « enteroids » et » colonoids » de l’intestin de petite et grande, respectivement). Ces enteroids sont composées de cryptes et de villosités comme domaines et mature pour contenir tous les types de cellules dans l’épithélium. Historiquement, les modèles murins ont été utilisés pour étudier les lésions intestinales. Cependant, un modèle porcin offre plusieurs avantages, y compris la similitude de taille comme digestif anatomie et physiologie à celui des humains. En utilisant un modèle porcin, nous établissons un protocole dans lequel segmentaires boucles d’ischémie intestinale peuvent être créés au sein d’un seul animal, permettant l’étude des différents points d’une lésion ischémique du temps et réparer in vivo. En outre, les auteurs décrivent une méthode pour isoler et les cellules souches intestinales des boucles ischémiques de l’intestin, de la culture permettant l’étude continue de réparation épithéliale, modulée par les cellules souches, ex vivo.

L’ischémie intestinale complète a été créé en petites anses intestinales en utilisant une occlusion vasculaire avec suture ou pinces tel qu’illustré à la Figure 1. En libérant les pinces, une période contrôlée de reperfusion peut être effectuée, permettant une étude supplémentaire de lésion de reperfusion ultérieures si vous le souhaitez. Tous les animaux ont survécu au cours de la procédure avec complication minime jusqu'à l’euthanasie. Complication chirurgicale la plus fréquente était une hypotension, qui a résolu avec la supplémentation d’un inotrope positive comme la dobutamine.
Si fait correctement, une lésion ischémique commencera à la pointe de la villosité intestinale et migrent vers le bas, dans la crypte, comme la durée des augmentations de l’ischémie (Figure 2). Une erreur commune avec la technique chirurgicale peut se produire lorsque les vaisseaux sanguins ne sont pas ligaturées ou serrés uniformément. Il en résulte une ischémie hémorragique (Figure 3), dans lequel la veine à paroi mince s’effondre avant de l’artère, permettant de sang supplémentaire de s’infiltrer dans les tissus. Grossièrement, cela se voit comme une sombre pourpre séreuse surface (Figure 3, à gauche) par rapport à une surface plus pâle pendant l’ischémie complète (Figure 3, droite).
Après le retrait de l’anses intestinales ischémiques, des cryptes intestinales ont été avec succès isolés suivant le protocole de dissociation (Figure 4). Comme prévu, les cryptes de points plus sévèrement endommagés étaient souvent cassés (f ; fragment) et crypte fractions contiennent plus de débris cellulaires fond comparativement à ceux qui ont subi no ou dommages doux. Pendant le protocole, l’intestin grièvement blessé doit être agité doucement pour éviter d’autres dommages au tissu sous-jacent. Secouant trop gros peut entraîner dégâts supplémentaires crypte et la majorité des cryptes se retrouvent dans les solutions de DR contenant de l’EDTA, ce qui entraîne des perturbations supplémentaires.
Une fois plaqué, cryptes de tous les points dans le temps d’ischémie survivent et sont en mesure de s’établir dans la culture (Figure 5). Quand des cryptes intestinales normales et légèrement endommagés sont plaqués dans la culture, enterospheres forme sous 24-48 h. Avec les graves dommages ischémiques (3 et 4 h), les cryptes intestinales survivent mais sont endommagés, entraînant la formation de plus petites sphères au départ. Par 72-120 h, enteroids deviennent plus complexes avec des lumens centrales évidents et structures en herbe. Dans l’ensemble, il y a une efficacité de diminution de la croissance de cryptes, ainsi qu’une taille réduite d’enteroids dérivé de tissu intestinal gravement endommagé (Gonzalez, L.M., données non publiées, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figure 1 : Modèle chirurgical de l’ischémie intestinale complète dans un modèle porcin. A) normal jéjunum de porc extériorisée. B) mésentériques navires ont été ligaturés avec suture création d’ischémie intestinale. C) ischémie créée à l’aide de clamps vasculaires bulldog afin de permettre une reperfusion tissulaire si vous le souhaitez. D) intestinale vascularisation immédiatement après le retrait des clamps vasculaires. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figure 2 : Preuve histologique (hématoxyline et éosine (H &amp; E) tache) de plus en plus des lésions épithéliales suite à des durées plus longues de l’ischémie intestinale complète. Dommages commence à l’extrémité de la villosité avec perte progressive de la couche épithéliale monocellulaires, émoussant de villosités et des dommages cellulaires qui s’étend jusqu'à la crypte de base avec des blessures graves (jusqu'à 4 h durée). barre d’échelle 100 µm. J’ai = ischémie. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figure 3 : Des preuves flagrantes et histologique d’ischémie hémorragique. A) brut photo comparant l’ischémie hémorragique (boucle de gauche) et l’ischémie complète (boucle de droite). Lorsque le système vasculaire n’est pas ligaturé ou serré uniformément, sang peut continuer à s’infiltrer dans les tissus, entraînant des dommages et d’inflammation supplémentaire. B) les images H &amp; E d’ischémie hémorragique de l’augmentation de la durée de 1 à 4 h. En plus des dommages cellulaires observés avec ischémie complète, il y a preuve d’infiltration de globules rouges dans la lamina propria environnante. barre d’échelle 100 µm. J’ai = ischémie. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figure 4 : Parties aliquotes de cryptes intestinales isolées de boucles d’intestin ischémique et normale. Complets, intactes cryptes intestinales (astérisques) ont été avec succès isolés de chaque boucle de l’intestin. Comme prévu, les cryptes de plusieurs points dans le temps gravement endommagés étaient souvent brisés (f ; fragment) et crypte fractions contiennent plus de débris cellulaires fond comparativement à ceux qui ont subi no ou dommages doux. barre d’échelle 100 µm. J’ai = ischémie. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figure 5 : Évolution temporelle de la croissance de cellules souches intestinales après isolement de boucles ischémiques de l’intestin grêle. Lorsque des cryptes intestinales normales ont été cultivées dans la culture, enterospheres formé sous 24-48 h. Avec les graves dommages ischémiques (3 et 4 h), cryptes survivent mais forment des sphères beaucoup plus petites au départ. Par 72-120 h, enteroids deviennent plus complexes avec des lumens centrales évidents et structures en herbe. 20 µm échelle bar sauf indication contraire. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Facteur de croissance</td>
			<td>Diluant</td>
			<td>Concentration de stock</td>
			<td>Dilution de stock</td>
			<td>Dilution de travail</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>1 µg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caboche</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10mM d’acide acétique</td>
			<td>10 000 X</td>
			<td>500 µg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrine</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10 000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10 000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : tableau de facteur de croissance réactif. Résumé des solutions mères de facteur de croissance et des solutions de travail utilisées dans le présent protocole.

Ce protocole permettra aux lecteurs d’établir avec succès un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire et ensuite isoler et de la culture des cellules souches intestinales pour l’étude de réparation épithéliale après une blessure.

Isolement de cellules souches intestinales et de la Culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les effets de l’ischémie intestinale sur les cellules souches épithéliales intestinales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules souches, telles que la résistance des cellules souches aux lésions et leur contribution à la réparation après une lésion ischémique. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un grand modèle animal qui peut être utilisé pour l’étude des maladies intestinales cliniques et de leur réparation.Amy Stieler Stewart, une étudiante diplômée, et John Freund, un spécialiste de la recherche de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par utiliser une lame de scalpel pour faire une incision ventrale de huit à 10 centimètres sur la ligne médiane de l’abdomen centrée sur l’ombilic d’un porc croisé Yorkshire de huit à 10 semaines. Localisez le jéjunum, à environ 40 centimètres de la jonction iléo-caecale.Ligaturez l’intestin circonférentiellement deux fois pour délimiter des boucles de jéjunum de 10 centimètres de long avec un centimètre entre chaque ligature. Créez deux boucles par point temporel d’ischémie adjacentes l’une à l’autre, une pour l’ischémie et une pour l’ischémie avec une heure supplémentaire de reperfusion. Pour induire une ischémie complète réversible, utilisez des pinces vasculaires ou des hémostatiques bulldog pour obstruer environ trois vaisseaux mésentériques par pince pendant la période expérimentale appropriée.Gardez l’abdomen couvert tout au long de la période ischémique. À la fin de l’expérience, utilisez des ciseaux de Metzenbaum pour prélever d’abord un morceau de contrôle du jéjunum normal à au moins cinq à 10 centimètres à proximité de la dernière anse ischémique, puis pour collecter le reste des anses. Stockez les boucles de chaque point de blessure dans de petits récipients de PBS glacé jusqu’à l’isolement de la crypte.Pour isoler les cellules souches de la crypte, utilisez un fil de calibre 20 et une pince à tissus pour inverser chaque boucle de l’intestin grêle afin que la surface de la muqueuse soit exposée. Suturez solidement le haut et le bas de chaque boucle au fil et rincez chaque boucle inversée dans du PBS glacé. Lorsque tous les débris luminaux ont été éliminés, placez immédiatement les échantillons dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 30 millilitres de réactif de dissociation numéro un sur de la glace pendant 30 minutes avec agitation et inversion toutes les cinq minutes.À la fin de la période d’incubation, transférez les échantillons dans des tubes correspondants de 50 millilitres contenant 30 millilitres de réactif de dissociation numéro deux et granulez les échantillons de la boucle ischémique de deux à quatre heures par centrifugation. Remettez les pastilles en suspension dans cinq millilitres de PBS et utilisez une aliquote de 50 microlitres de chaque échantillon pour vérifier le degré d’association de la crypte et la quantité de débris par microscopie optique. Ensuite, placez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes en secouant ou en inversant toutes les cinq minutes.Ensuite, transférez les échantillons directement dans 25 millilitres de PBS glacé sur glace dans un agitateur orbital réglé à 60 tr/min pour deux à cinq minutes d’agitation avec agitation manuelle supplémentaire ou inversion toutes les 30 secondes. À la fin de l’incubation par agitation, vérifiez le degré d’association des cryptes et la quantité de débris et transférez les échantillons dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres contenant 25 millilitres de PBS froid pour agiter jusqu’à ce que les cryptes intactes soient isolées avec un minimum de débris et de villosités. Lorsque les anses ont été complètement dissociées, retirez le tissu restant, granulez les échantillons par centrifugation et remettez en suspension les pastilles de crypte restantes dans cinq millilitres de PBS frais.Ensuite, aliquote 150 cryptes par tube dans des tubes de microcentrifugation individuels et granulation des cryptes par microcentrifugation. À l’aide d’une pipette pré-refroidie, remettez doucement les granulés en suspension avec 50 microlitres de mélange principal par puits, puis pipetez rapidement 15 fois pour mélanger. Ensuite, versez une gouttelette de crypte de 50 microlitres au centre de chaque puits d’une plaque pré-vermifugée et quadrillée à 24 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius.Après 30 minutes, superposez chaque galette matricielle avec 500 microlitres par puits de milieu de cellules souches épithéliales intestinales, en ajoutant 500 microlitres de PBS stérile à tous les puits inutilisés pour maintenir l’humidité et compter le nombre de cryptes plaquées, jour zéro. Ajoutez des facteurs de croissance dans chaque puits toutes les 48 heures, en remplaçant le surnageant toutes les 96 heures par 500 microlitres de milieu frais supplémenté en facteurs de croissance. L’ischémie intestinale complète est créée dans les anses de l’intestin grêle en utilisant l’occlusion vasculaire avec des sutures ou des pinces, comme illustré.Si elle est effectuée correctement, la lésion ischémique commencera à l’extrémité des villosités intestinales et migrera vers le bas dans la crypte à mesure que la durée de l’ischémie augmente. Une erreur courante avec la technique chirurgicale peut se produire lorsque les vaisseaux sanguins ne sont pas ligaturés ou clampés uniformément, ce qui entraîne une ischémie hémorragique dans laquelle la veine à paroi mince s’effondre avant l’artère, permettant au sang supplémentaire de s’infiltrer dans les tissus. Suite à l’ablation des anses intestinales ischémiques, les cryptes intestinales peuvent être isolées avec succès en suivant le protocole de dissociation comme nous venons de le démontrer.Les cryptes des points temporels les plus gravement endommagés sont souvent brisées et contiennent plus de débris cellulaires de fond par rapport à celles qui ne subissent aucun dommage ou des dommages légers. Lorsque des cryptes intestinales normales et légèrement endommagées sont mises en culture, des entérosphères se forment dans les 24 à 48 heures. Avec des lésions ischémiques graves, les cryptes intestinales survivent mais sont endommagées, ce qui entraîne la formation de sphères beaucoup plus petites au départ.Au bout de 72 à 120 heures, les entéroïdes de toutes les cryptes deviennent plus complexes avec des lumières centrales évidentes et des structures bourgeonnantes, et avec une diminution globale de l’efficacité de la croissance des cryptes, ainsi qu’une diminution de la taille des entéroïdes dérivés du tissu intestinal gravement endommagé. Une fois maîtrisées, les procédures de placage isolant de la crypte peuvent être terminées en deux à trois heures environ si elles sont effectuées correctement. Il est préférable que les cryptes collectées pour le placage proviennent de lavages et non de fractions de dissociation en raison de la probabilité accrue de contamination de la culture dans la fraction de dissociation.Cette méthode peut également être utilisée pour tester l’efficacité des médicaments dans le traitement des lésions épithéliales résultant d’une ischémie plus ou moins reperfusion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie gastro-intestinale pour explorer l’impact de l’ischémie sur l’épithélium, en particulier sur les cellules souches intestinales, dans un modèle de grand animal translationnel et cliniquement pertinent. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une ischémie intestinale avec ou sans reperfusion ainsi que d’isoler les cryptes intestinales pour la culture 3D suite à des lésions in vivo.

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Cet article et la vidéo qui l'accompagne présenter notre protocole pour générer génie tissulaire intestin chez la souris, en utilisant un organoïde unités-sur-échafaudage approche.

Génie tissulaire de l&#39;intestin dans un modèle murin

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Modèle murin de Intestinal Ischémie-reperfusion

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Ici, nous présentons un protocole pour isoler le mésenchyme intestinal murin, y compris les télocytes. Ceux-ci peuvent être utilisés pour plusieurs applications, telles que la co-culture avec des organoïdes de souris ou d’origine humaine, pour soutenir la croissance et mieux refléter la situation dans le tissu d’origine.

Isolement du mésenchyme intestinal murin entraînant un rendement élevé en télocytes

Nous décrivons comment générer un modèle chirurgical largement utilisé de lésion d’ischémie-reperfusion intestinale (IRI) chez les rongeurs. La procédure implique l’occlusion de l’artère mésentérique supérieure suivie du rétablissement du flux sanguin. Ce modèle est utile pour les études portant sur les causes occlusives de l’IRI intestinale en médecine vétérinaire et humaine.

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Ici, nous décrivons un protocole de culture d’organoïdes 3D intestinaux de porc à partir de cryptes épithéliales cryoconservées. Nous décrivons également une méthode pour établir des monocouches cellulaires dérivées d’organoïdes 3D, permettant l’accès à la face apicale des cellules épithéliales.

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Nous décrivons un protocole pour isoler les cryptes de l’intestin grêle murin et cultiver des organoïdes intestinaux 3D à partir des cryptes. De plus, nous décrivons une méthode pour générer des organoïdes à partir d’une seule cellule souche intestinale en l’absence d’une niche cellulaire sous-épithéliale.

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Perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots

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Isolement de cellules souches intestinales et de la Culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit

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