Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation de l’ADN, telles que la régulation, la formation, la localisation et la résolution des complexes de réparation de l’ADN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut détecter sans ambiguïté les changements et réparer la localisation et la cinétique complexes. En plus de ces chercheurs de premier cycle dans mon laboratoire, trois étudiants diplômés réaliseront les expériences.

Il s’agira de Changkun Hu, Dalton Dacus et Stephen Walterhouse. Pour commencer, cultivez des cellules U2OS/DR-GFP sur une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 85 à 90 %. Retirez ensuite le milieu, ajoutez trois millilitres d’EDTA et incubez les cellules à température ambiante pendant trois minutes.

Remplacez l’EDTA par un millilitre de trypsine et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq millilitres de DMEM pour neutraliser la trypsine. Après avoir compté les cellules, ensemencez six fois 10 à la troisième cellule par puits dans 200 microlitres de milieu dans une plaque à fond de verre à 96 puits.

Alternativement, ensemencez quatre fois 10 dans les six puits dans huit millilitres de milieu sur des lamelles de couverture de 12 millimètres placées dans une plaque de 10 centimètres, puis faites pousser les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour induire des cassures double brin, ou DSB, remplacez le milieu par du peroxyde d’hydrogène dilué à une concentration de 25 micromolaires avec DMEM plus 10 % FBS et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez les cellules trois fois avec 1x PBS, puis ajoutez du DMEM frais.

Pour fixer les cellules après les avoir incubées, utilisez du PBS pour laver la plaque trois fois. Ensuite, à l’aide d’une aiguille et d’une pince, retirez soigneusement une lamelle de recouvrement de la plaque de 10 centimètres pour chaque point temporel et placez-la dans un seul puits d’une plaque de 24 puits. Ajoutez 4 % de PFA et incubez les cellules pendant 15 minutes.

Ensuite, nous PBS pour laver les bordereaux de couverture trois fois. Pour perméabiliser les cellules, ajoutez 0,5 % de détergent non ionique et de PBS. Incuber les cellules à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez à nouveau les cellules avec du PBS trois fois. Ajoutez ensuite 3 % de BSA et 0,1 % de détergent non ionique dilué dans du PBS aux lamelles dans une plaque à 24 puits et incubez la plaque à température ambiante pendant une heure. Ajoutez ensuite des anticorps primaires qui ciblent la protéine de réparation d’intérêt et incubez les échantillons à température ambiante pendant une heure.

Après avoir lavé les cellules avec du PBS trois fois, ajoutez du DAPI et incubez les plaques à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, incubez les échantillons avec des anticorps secondaires. Après avoir lavé les cellules comme précédemment, utilisez un réactif de montage pour monter les cales de couverture côté cellule vers le bas sur les lames.

Appuyez délicatement sur les lamelles et utilisez une lingette pour absorber tout excès de réactif de montage. Scellez les lamelles avec un vernis à ongles transparent à séchage rapide et assurez-vous d’une étanchéité complète de la lamelle avec la lame. Prenez des images au microscope confocal en faisant la mise au point sur le canal DAPI.

Pour définir les noyaux dans les images d’immunofluorescence, ouvrez les images confocales en faisant glisser le fichier image dans la fenêtre ImageJ ou en sélectionnant importateur de bioformats dans la barre d’outils du plugin dans ImageJ. Sélectionnez ensuite Diviser les chaînes. Sous les options de couleur, sélectionnez colorisé dans le menu déroulant.

Sélectionnez OK pour ouvrir les images DAPI et H2AX d’histone en tant que fenêtres distinctes et choisissez l’image DAPI. Sélectionnez ensuite la barre d’outils de l’image dans l’option d’ajustement du seuil pour sélectionner les noyaux. Ensuite, ajustez le seuil de l’image en faisant glisser la barre inférieure de la fenêtre de seuil complètement vers la droite.

Ajustez la barre supérieure jusqu’à ce que les noyaux apparaissent complètement rouges avec des contours distincts et que l’arrière-plan soit noir. Sélectionnez ensuite la barre d’outils d’analyse et l’option Analyser les particules. Entrez la taille minimale du noyau.

Dans le menu déroulant de l’émission, sélectionnez les contours, puis sélectionnez l’option Ajouter au gestionnaire. Cliquez sur OK pour ouvrir une fenêtre de gestionnaire de retour sur investissement. Dans la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement, attribuez des numéros aux noyaux par sélection.

Pour utiliser ImageJ pour quantifier les foyers H2AX et les images de microscopie d’immunofluorescence, sélectionnez la fenêtre des foyers H2AX. Sélectionnez ensuite la barre d’outils de processus et choisissez trouver les maxima pour trouver les foyers dans les noyaux. Dans le menu déroulant du type de sortie, choisissez l’option Points uniques et sélectionnez la sélection de points d’aperçu pour visualiser les foyers maximaux.

Entrez ensuite une valeur de tolérance au bruit en fonction de l’intensité de fluorescence de l’image. Dans la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez les noyaux pour lesquels les foyers H2AX doivent être quantifiés. Sélectionner mesure pour mesurer le nombre de foyers maximaux dans les noyaux sélectionnés.

Copiez les valeurs d’intensité brutes et collez-les dans un logiciel d’analyse des données. Après avoir placé les cellules sur des plaques de 96 puits avec des lamelles de recouvrement, comme démontré précédemment dans cette vidéo, induire des cassures double brin en utilisant un agent transfectionnaire à base de lipides pour transfecter les cellules avec le vecteur d’expression I-SceI. Pour obtenir imaginer, après avoir lavé les cellules perméabilisées et bloquées comme montré précédemment, ajoutez des anticorps contre gamma H2AX et réparez la protéine d’intérêt.

Avec 1x lavage PBS, le couvercle de la plaque à 96 puits glisse trois fois. Ensuite, incubez les lamelles de couverture de plaque à 96 puits avec des anticorps secondaires. Enfin, après avoir identifié les cellules qui ont un grand foyer nucléaire gamma H2AX, comptez manuellement celles qui présentent également une colocalisation avec la protéine de réparation d’intérêt.

Cette figure montre une discrimination sonore de 90 et marque le nombre correct de foyers. Les noyaux sur le bord et les foyers à l’extérieur des noyaux ne sont pas comptés lors de la quantification. Le panneau illustré ici représente une faible tolérance au bruit de 50.

De nombreux maxima sont identifiés à l’extérieur du noyau et à l’intérieur du noyau. Une tolérance au bruit élevée de 220 se trouve dans cette cellule. Un seul foyer a été détecté.

La colocalisation d’un foyer gamma H2AX et d’une protéine de réparation d’intérêt est illustrée dans cette figure. Une cellule non transfectée est représentée ici, et une cellule avec un foyer gamma H2AX non nucléaire est illustrée en haut à droite. À un grossissement plus élevé, on peut distinguer une image plus claire d’une véritable mise au point intérieure et d’une mise au point non nucléaire ou extérieure.

Enfin, un exemple de foyer nucléaire gamma H2AX sans colocalisation d’une protéine de réparation est présenté ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques jours si elle est correctement exécutée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la précipitation co-mutor peuvent être effectuées afin d’identifier les interactions entre les protéines de réparation d’intérêt.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’observer la formation et la résolution des complexes de réparation de l’ADN en induisant des cassures transitoires double brin dans l’ADN. Vous apprendrez également à distinguer sans ambiguïté la mauvaise localisation des facteurs de réparation du recrutement retardé en induisant des lésions de longue durée.