Name: Intracrânienne subarachnoïdien voie d’Infection pour enquêter sur les rôles des Biofilms de Streptococcus suis en méningite dans un modèle d’Infection de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez une voie d'infection sous-arachnoïdienne intracrânienne chez la souris pour étudier le rôle des biofilms de Streptococcus suis dans la méningite bactérienne. Ce modèle permet d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key Research and Development Programme of China [2017YFD0500102] ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [31572544] ; le laboratoire clé Etat des vétérinaire biologie étiologique [SKLVEB2016KFKT005] ; l’Agriculture de Shanghai Applied Technology Development Programme, Chine [G2016060201].

Les expériences d’infection de souris ont été approuvés par le laboratoire Animal surveillance Comité de Province de Jiangsu, Chine et effectuées dans le laboratoire Animal Center of Nanjing Agricultural University (numéro de permis : SYXK (Su) 2017-0007).
1. préparation de bactéries
Remarque : S. suis souche virulente de sérotype 2 P1/7 a été isolée provenant d’un porc malade avec méningite19. Souche P1/7 a été cultivé dans le bouillon de Todd-Hewitt (THB, formule par litre de THB : Infusion de cœur, 3,1 g néopeptone, 20,0 g dextrose, 2,0 g ; Chlorure de sodium, 2,0 g ; phosphate disodique, 0,4 g ;, 2,5 g de carbonate de sodium) et plaqué sur gélose de Todd-Hewitt (THA, formule par litre de THA : Infusion de cœur, 3,1 g ; néopeptone, 20,0 g ; dextrose, 2,0 g ; chlorure de sodium, 2,0 g ; phosphate disodique, 0,4 g ; carbonate de sodium, 2,5 g ; agar, 15,0 g) à 37 ° C et 5 % de CO2.
<ol><li>Collection de souche P1/7 cellules planctoniques<ol>
<li>Collecter les 5 mL de cellules planctoniques de culture en phase logarithmique (OD600= 0,6), centrifuger pendant 3 min à 8000 × g et puis laver 3 fois avec du PBS.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de 25 % de glycérol en THB, aliquote dans des tubes de 5 et ensuite le stocker à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collection de souche de cellules d’état de biofilm P1/7<ol>
<li>Prélever 20 mL d’une culture d’une nuit ou plus et ajouter à 180 mL de THB fraîche ; Répartissez la culture diluée dans 10 plaques de culture ronde également, puis mettre les plaques dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
		<li>Après incubation, secouer la plaque doucement pour remettre en suspension les bactéries qui n’ont pas adhéré à la plaque et puis jeter le surnageant par aspiration. NOTE : Secouez la plaque et éviter resuspendant les sédiments.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de PBS de récolter les cellules État biofilm, remettre en suspension les sédiments complètement et puis transférer l’échantillon dans un nouveau tube.</li>
		<li>Laisser agir les biofilms de cellules d’état de la dernière étape avec les paramètres suivants : 60 W, 4 cycles, 5 s sur et 10 s éteint.</li>
		<li>Centrifuger pendant 3 min à 8000 × g et stocker le liquide surnageant à-80 ° C. NOTE : Le surnageant peut contenir des composants de biofilm et il peut être utilisé pour remettre en suspension les bactéries biofilm avant l’infection comme décrit dans l’expérimentation animale (étape 3).</li>
		<li>Remettre en suspension les sédiments avec 10 mL 25 % de glycérol en THB et puis stockez les biofilms de cellules d’État à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. analyse analyse de microscopie électronique (SEM)
<ol><li>Fixer les cellules État biofilm recueillies et les cellules planctoniques à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % pour les 12 à 24 heures à 4 ° C.</li>
	<li>Rincez les échantillons rapidement avec de l’eau distillée et déshydrater les échantillons dans l’ordre avec une concentration croissante d’éthanol (25 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 %) pendant 30 min dans chaque solution.</li>
	<li>Respecter les échantillons séchés titulaires avec du ruban adhésif double-face en métal et enfin de les enrober dans un évaporateur d’or et de palladium.</li>
	<li>Observer les échantillons par un microscope électronique à balayage utilisant les paramètres suivants : ISE (Extra haute Tension) = 10 kV ; WD (Distance de travail) = 7.0 ou 8.0 mm ; Grossissement = 5000 × ; A du signal = SE1.</li>
</ol>3. animal Experiments
<ol><li>Utiliser SPF 6 semaines des souris femelles BALB/c dans cette étude. Infecter toutes les souris par voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection dont point d’injection se trouve à 3,5 mm rostrale de la bregma. Les coordonnées stéréotaxiques du site d’injection ont été clairement décrits par Chiavolini et al.17.<ol>
<li>Pour une analyse histopathologique, infecter les deux groupes de souris (5 souris par groupe) à l’aide de cellules planctoniques ou biofilm état de cellules à une dose de 3 × 107 unités formant colonie (UFC), et un autre 5 souris ont été injectés avec du PBS comme un contrôle.</li>
		<li>Pour infecter de détection de l’expression de l’ARNm de TLR2 et cytokines dans le cerveau, deux groupes supplémentaires de souris (6 souris par groupe) à l’aide de cellules planctoniques ou biofilm état les cellules à une dose de 3 × 107 UFC.</li>
		<li>Déterminer le nombre de bactéries viables en ensemençant des dilutions en série sur THA.</li>
		<li>Euthanasier toutes les souris à infection après 12 h de poursuivre les recherches. Remarque : Le glycérol dans le milieu de stock doit être supprimée avant l’infection. Les cellules d’état de biofilm récupérés de-80 ° C et les cellules planctoniques sont lavés 3 fois avec du PBS. Puis, les cellules planctoniques sont remises en suspension avec du PBS et diluées à la dose appropriée pour l’infection ; biofilm État cellules sont remises en suspension avec le surnageant stocké (de l’étape 1.2.5) et dilués à la dose appropriée pour l’infection. Le volume d’infection ne devrait pas être plus de 50 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détection de l’expression de l’ARNm de TLR2 et cytokines dans le tissu cérébral<ol>
<li>Extraire l’ARN total de tissus du cerveau à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.<ol>
<li>Pour chaque souris, utiliser le tissu de cerveau entier permettant d’extraire des RNA. Diviser le tissu de cerveau entier en 5 tubes. Prendre aux tissus du cerveau 100 mg et ajouter 1 mL de solution de lyse dans chaque tube contenant la matrice lyse fournie par le kit.</li>
			<li>Traiter le tube dans un homogénéisateur pour 40 s avec une valeur de 6.0, puis centrifuger le tube à 12000 × g et 4 ° C pendant 5 min.</li>
			<li>Après centrifugation, transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de microcentrifuge.</li>
			<li>Incuber l’échantillon transféré pendant 5 min à température ambiante ; Ajouter 300 µL de chloroforme, Vortexer pendant 10 s et puis incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
			<li>Centrifuger le tube à 12000 × g et 4 ° C pendant 5 min. transfèrent la phase supérieure dans un nouveau tube.</li>
			<li>Ajouter 500 µL d’éthanol absolu froid dans le tube, avant de ce coucher pour 5 fois et ensuite stocker l’échantillon à-20 ° C pendant au moins 1 h.</li>
			<li>Centrifuger le tube à 12000 × g et 4 ° C pendant 15 minutes et enlever le surnageant. Laver le culot avec 500 µL d’éthanol froid à 75 % en exempte de RNase H2O.</li>
			<li>Supprimer l’éthanol, l’air sec le granule pendant 5 min à température ambiante et remettre l’ARN dans 100 µL d’exempte de RNase H2O.</li>
			<li>Incuber l’ARN pendant 5 min à température ambiante et déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un bioanalyzer RNA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuer la synthèse de cDNA, notamment l’élimination de l’ADN génomique (ADNg), en utilisant un thermocycleur avec un kit de réactif de transcription inverse (RT).<ol>
<li>Ajouter 1 µg d’ARN à un tube contenant 2 µL de tampon d’élimination 5 x gDNA, 1 µL d’enzyme élimination ADNg et exempte de RNase H2O jusqu'à ce que le volume atteint 10 µL. Incuber pendant 2 min à 42 ° C.</li>
			<li>Ajouter 10 µL du mélange principal (1 µL d’enzyme RT Mix I, 1 µL du mélange Primer RT, 4 µL de 5 x 2 de tampon et 4 µL d’exempte de RNase H2O) à la solution de réaction de la dernière étape et puis mélanger doucement. Procéder immédiatement à la réaction de RT : 37 ° C pendant 15 minutes et puis 85 ° C pendant 5 s.</li>
			<li>Effectuer l’analyse quantitative de PCR (RT-qPCR) en temps réel à l’aide d’une machine de PCR en temps réel avec un kit du RT-qPCR SYBR. Ajouter 10 µL de 2 x enzyme, 0,8 µL d’apprêt avant, 0,8 µL d’apprêt inverse, 0,4 µL de 50 x ROX référence Dye II, 2 µL de matrice d’ADNc et exempte de RNase H2O jusqu'à un volume total de 20 µL.</li>
			<li>Exécuter chaque échantillon en triple exemplaire, en utilisant les paramètres thermiques suivantes : 30 s à 94 ° C, suivie de 40 cycles de 5 s à 95 ° C et 34 s à 60 ° C, avec une phase finale de 15 s à 95 ° C, 1 min à 60 ° C et 15 s à 95 ° C. Amorces pour la RT-qPCR sont énumérés au tableau 1. Gènes domestiques B2m et 18 s ARNr ont été utilisés comme contrôles internes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calculer la variation de pli relative basée sur la méthode 2-ΔΔCt .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observation de coupes histologiques
	<ol>
<li>Après fixation 24h avec 10 % de formol, reconstruire le tissu cérébral fixe en grandeurs appropriées de morceaux de tissus à 2-3 mm.</li>
		<li>Mettez les morceaux de tissus dans une cassette d’encastrement et plongez dans une nouvelle solution de fixateur pour déshydratation avec un déshydrateur automatique sous vide.</li>
		<li>Retirez le tissu fixe et il déshydrate séquentiellement dans l’augmentation des concentrations d’éthanol (70 %, 80 %, 95 %, 95 % et 100 %) pendant 30 min dans chaque solution.</li>
		<li>Transparentize l’échantillon avec le xylène pendant 15 min, trempez-le dans la paraffine liquide à 60 ° C pendant 90 min et ensuite incorporer à l’aide d’une machine d’enrobage.</li>
		<li>Couper le tissu de bloc intégré de paraffine en tranches de 3 µm, tuile de la tranche sur l’eau à 45 ° C et puis le sécher à l’air.</li>
		<li>Incuber la section pendant 3 h à 60 ° C, détachant à l’aide de l’hématoxyline et éosine (HE) méthode et scellez-la avec la gomme neutre.</li>
		<li>Observer les changements histopathologiques du cerveau avec un microscope optique. Un système de classement de quatre points a été utilisé pour évaluer les changements histologiques. Utiliser un test de non-appariés t pour l’analyse statistique. Congestion/hémorragie : absent, marquez 0 ; petite zone de congestion focal/hémorragie, note 1 ; grande zone de congestion/hémorragie focale, ou plusieurs sites de petite zone de congestion focal/hémorragie, note 2 ; jusqu'à trois sites grande congestion/hémorragie focale, note 3 ; diffuse la congestion/hémorragie, Marquez 4. Nécrose : absent, marquez 0 ; nécrose focale, note 1 ; diffuse la présence de 1-10 cellules nécrotiques, note 2 ; foyers de nécrose confluente, note 3 ; une nécrose étendue confluente, note 4. Une infiltration cellulaire inflammatoire : absent, marquez 0 ; les infiltrations peu et focales, note 1 ; infiltration multifocale ou infiltrations avec formation d’agrégats, note 2 ; jusqu'à trois agrégats, note 3 ; et plus de quatre agrégats, note 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
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<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
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<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection décrite ici a des avantages évidents sur les autres voies d’infection. Il permet aux chercheurs d’étudier l’interaction hôte-bactérie et l’effet des composantes bactériennes sur les réponses immunitaires hôte directement dans le cerveau, qui miment l’entrée bactérienne dans le système nerveux central. Ainsi, cette voie d’infection peut être étendue pour étudier les mécanismes de la méningite causée par d’autres bactéries. En outre, il peut également être utilisé pour tes...

Streptococcus suis (S. suis) est un bactérie pathogène majeur de porcs dans le monde, provoquant des maladies graves, y compris la méningite, pneumonie, septicémie, endocardite et arthrite1. C’est aussi un agent zoonotique émergent. Jusqu’ici, on a signalé que les neuf sérotypes peuvent provoquer une infection chez l’homme, y compris les sérotypes 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 et 312,3,4. Chez les humains et les porcs, la méningite est l’un des principaux signes cliniques des infections à S. suis . Au Vietnam et en Thaïlande, S. suis est la principale cause de méningite chez les adultes,5. Biofilms microbiens sont des micro-organismes qui adhèrent les uns aux autres et sont concentrent à l’interface. ils sont essentiels pour la virulence bactérienne, la survie dans des environnements variés et5de la résistance aux antibiotiques. Biofilms sont généralement entourés d’une matrice extracellulaire qui généralement contient des polysaccharides, protéines et ADN6. Ce dernier est capable de susciter des réactions inflammatoires de l’hôte et cytokine production7. La formation de biofilm a signalé de participer à streptocoque méningite lors d’études antérieures. Biofilms contribuent à Streptococcus agalactiae méningite dans un modèle de poisson tilapia et la formation de biofilm a été révélée dans les tissus du cerveau et autour méningée surfaces in vivo par inoculation intra-abdominale8. Au cours de la méningite, Streptococcus pneumoniae est dans un état semblable au biofilm et de bactéries dans un tel état de biofilm ont été plus efficaces dans l’induction de méningite chez une souris infection modèle9. En outre, dans notre précédente étude, l’état de biofilm associé de S. suis dans le cerveau de souris contribue à la virulence bactérienne en analyse de survie10. Toutefois, une preuve directe pour implication de biofilm dans S. suis méningite exige davantage enquête.
Des modèles animaux de l’infection à S. suis ont été développés chez les souris en utilisant la voie intrapéritonéale11, par voie nasale (i.n.)12, par voie intraveineuse (i.v.)13et les routes intracisternale (i.c.) d’infection14, 15 , 16. Toutefois, les itinéraires i.p., i.n. et i.v. d’infection ne conviennent pas pour étudier les rôles des composantes de la surface S. suis méningite directement dans le cerveau. Il s’agit d’une matrice extracellulaire de biofilms. Bien que l’inoculation i.c. a été utilisée pour infection à S. suis , le site d’injection précise n’a pas été décrit dans ces documents. En revanche, les coordonnées stéréotaxiques du site d’injection pour l’inoculation intracrânienne subarachnoïdien a clairement été décrit dans une précédente étude17. Cela a permis de reconnaissance simple du point d’inoculation et plan expérimental plus simpliste. En outre, la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection imite entrée bactérienne dans le système nerveux central du sinus ou l' oreille moyenne17et la relation entre l’oreille moyenne et la méningite causée par S. suis a été démontrée par Madsen et al.18. En outre, en appliquant la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection chez la souris, nous avons démontré que S. suis petit RNA rss04 contribue à la méningite dans notre précédente étude10.
Dans la présente étude, la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection a été utilisée chez les souris pour étudier les rôles des biofilms dans S. suis méningite. Souris ont été infectées avec des cellules planctoniques ou de biofilms de cellules état de S. suis par cette voie d’infection. Analyse histopathologique et expression de l’ARNm accrue de TLR2 et cytokines du tissu de cerveau de souris injectées avec des cellules d’État biofilm a clairement indiquent que S. suis biofilm contribue à la méningite.

<table><tbody><tr><td>Bouillon Todd Hewitt(THB)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>Dissoudre 30 g de poudre dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>Dissoudre 15 g de poudre dans 1 L de THB. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min.</td></tr><tr><td>Système de purification d’eau de référence Milli-Q</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>sans Dnase/ Rnase</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td><td>Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td><td>Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td><td>Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td><td>Dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO3, 0,27 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121&deg ; pendant 15 min. Utilisez le KOH pour ajuster le pH à 7,4.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Dilué avec un volume égal d’eau purifiée, autoclave à 121&deg ; pendant 15 min</td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25 % de glutaraldéhyde</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>30092436</td><td>10 fois dilué avec de l’eau purifiée pour la fixation.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrophotometre</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11+</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur de cellules à ultrasons</td><td>NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur</td><td>Aucma Co., Ltd</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Zeiss</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green Kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>#6045-050</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Instrument pour PCR</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs PrimeScript RT avec effaceur</td> <td>d’ADNgTakara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>Processeur de tissus entièrement fermé</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>Module d’enrobage de paraffine chauffée</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif semi-automatisé</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie pour sections de paraffine</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

intracrânienne subarachnoïdien voie d’infection pour enquêter sur les rôles des biofilms de streptococcus suis en méningite dans un modèle d’infection de souris

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus suis est non seulement un bactérie pathogène majeur de porcs dans le monde entier, mais aussi un agent zoonotique émergent. Chez les humains et les porcs, la méningite est une manifestation importante des infections à S. suis . Un modèle adapté de l’infection est un outil essentiel pour comprendre les mécanismes des maladies causées par des pathogènes. Plusieurs voies d’infection chez les souris ont été développés pour étudier la pathogenèse de l’infection à S. suis . Cependant, les voies intrapéritonéales, par voie nasale et par voie intraveineuse d’infection ne conviennent pas pour étudier les rôles des composantes de la surface S. suis méningite directement dans le cerveau, comme la matrice extracellulaire de biofilms. Bien que l’inoculation intracisternale a été utilisée pour infection à S. suis , le site d’injection précise n’a pas été décrit. Ici, la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection a été décrite dans un modèle murin d’enquêter sur le rôle des biofilms dans S. suis méningite. S. suis cellules planctoniques ou biofilm État cellules ont été injectées directement dans l’espace sous-arachnoïdien de souris par le biais du site d’injection situé rostrale de la bregma 3,5 mm. Analyse histopathologique et une expression de l’ARNm de TLR2 et cytokines des tissus cérébraux de souris injectées avec des cellules d’État biofilm a clairement indiquent que S. suis biofilm joue un rôle définitif dans S. suis méningite. Cette voie d’infection présente des avantages évidents sur les autres voies d’infection, ce qui permet l’étude de l’interaction hôte-bactérie. En outre, il permet l’effet des composantes bactériennes sur les réponses immunitaires hôte directement dans le cerveau pour être évalués et imite l’entrée bactérienne dans le système nerveux central. Cette voie d’infection peut être étendue pour étudier les mécanismes de la méningite causée par d’autres bactéries. En outre, il peut également être utilisé pour tester l’efficacité des médicaments contre la méningite bactérienne.

SEM analyse a été réalisée afin d’examiner la formation du biofilm dans les conditions expérimentales. Comme illustré à la Figure 1, il y a une différence significative dans la formation de biofilm entre cellules planctoniques (Figure 1A) et biofilm État (Figure 1B). SEM analyse a montré que les biofilms bactéries étaient en touffes et plusieurs couches et ils ont en...

Nous décrivons ici la voie intracrânienne subarachnoïdien d’infection chez les souris pour étudier les rôles des biofilms dans Streptococcus suis méningite. Ce modèle d’infection est également adapté pour l’étude de la pathogenèse de l’autre une méningite bactérienne et l’efficacité des nouveaux médicaments contre la méningite bactérienne.

Intracrânienne subarachnoïdien voie d’Infection pour enquêter sur les rôles des Biofilms de Streptococcus suis en méningite dans un modèle d’Infection de souris

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle des composants de streptococcus suis dans de nombreux sites, tels que la matrice extracellulaire de ses biofilms. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier les composants bactériens qui affectent la façon dont les réponses immunitaires directement dans le cerveau et imitent l’entrée des bactéries dans le système nerveux central. La démonstration de la procédure sera faite par Monsieur Shouming Zhang, un étudiant diplômé de mon laboratoire.Pour collecter des cellules planctoniques de souche P1/7, prélevez d’abord cinq millilitres de cellules à partir d’une culture en phase de mi-verrouillage. Centrifugez pendant trois minutes à 8000 fois G avant de laver les cellules trois fois dans du PBS. Remettez les cellules en suspension avec cinq millilitres de glycérol à 25 % dans du THB et aliquote dans cinq tubes.Alternativement, pour prélever des cellules d’état de biofilm de la souche P1/7, prenez 20 millilitres d’une culture de nuit et ajoutez-les à 180 millilitres de THB frais. Divisez également la culture diluée en 10 plaques de culture rondes, puis incubez les plaques à 37 degrés Celsius d

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Zhang, S., et al. Voie subarachnoïde intracrânienne de l’infection pour l’étude des rôles de Streptococcus suis biofilms dans la méningite dans un modèle d’infection murine. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo montre la détection de l’expression génique cible dans le cerveau d’une souris infectée par des bactéries. L’ARN est extrait, traité avec une enzyme dégradant l’ADN, puis rétrotranscrit en ADNc. L’ADNc est amplifié par cycle thermique avec des amorces spécifiques à chaque gène,...

Détection de l’expression du gène cible dans un cerveau de souris infecté par des bactéries

Source : Lenhard, A. et al. Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à agent pathogène après une co-infection virale récapitule une maladie aggravée par l’âge. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo présente un modèle de co-infection chez la souris dans lequel le virus de la grippe déclenche la transition de Streptococcus pneumoniae d’un colonisateur à un agent pathogène. Il décrit les étapes impliquées dans la colonisation bactérienne, l’infection virale et la...

Un modèle murin pour étudier la transition pathogène de Streptococcus pneumoniae après une co-infection virale

Dans cette vidéo, nous démontrons l’administration intracisternale de Neisseria meningitidis dans un modèle murin pour générer une infection par méningite.

Administration intracisternale de méningocoques dans des modèles murins pour induire une méningite à méningocoques

Neisseria meningitidis est un agent pathogène humain spécifique qui infecte les vaisseaux sanguins. Dans ce protocole, les microvaisseaux humains sont introduites dans une souris par greffage de peau humaine sur les souris immunodéprimées. Les bactéries adhèrent largement aux navires humains, entraînant des dommages et le développement vasculaire du purpura généralement observée dans des cas humains.

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Les modèles animaux se sont révélés être des outils précieux dans la définition de mécanismes spécifiques hôtes et pathogènes qui contribuent au développement de l'inflammation chronique. Nous décrivons ici un modèle murin d'infection par voie orale avec l'agent pathogène humain Porphyromonas gingivalis et méthodologies de détail pour évaluer la progression de l'inflammation au niveau des sites locaux et systémiques.

Un modèle de souris pour l&#39;inflammation chronique induite par pathogène sur les sites locaux et systémiques

Ici, un procédé est décrit pour la mise en place d'une infection systémique chez le rat nouveau-né avec des cultures d'Escherichia coli K1. Cette procédure non invasive permettant la colonisation du tractus gastro-intestinal, de la translocation de l'agent pathogène dans la circulation systémique, et l'invasion du système nerveux central chez le plexus choroïde.

Modèle non-invasive de neuropathogènes Escherichia coli Maladies infectieuses chez le rat nouveau-né

Streptococcus pneumoniae forme des lésions microscopiques discrètes non purulentes dans le cœur. Le protocole pour un modèle murin de formation de microlésions cardiaques est décrit. Des instructions sont fournies sur la visualisation des microlésions à l’aide de la microscopie, la discrimination entre les microlésions précoces et tardives et les méthodes de détection du remodelage cardiaque dans le cœur des animaux convalescents.

Visualisation des<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dans les microlésions cardiaques et le remodelage cardiaque ultérieur

Ici, nous décrivons une méthode pour induire la méningite méningococcique par une voie intracisternal d'infection chez les souris adultes. Nous présentons un protocole étape par étape de l'infection méningococcique de la préparation de l'inoculum à l'infection intracisternal ; enregistrez ensuite la survie animale et évaluez les charges bactériennes dans les tissus murines.

Induire la méningite méningococcique Sérogroupe C chez les souris par l'intermédiaire de la livraison intracisternal

Cet article décrit un nouveau modèle murin pour la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Ce modèle peut être facilement adapté pour étudier les interactions polymicrobiennes et hôte-pathogène au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre divers hôtes.

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Modèle animal d’infections associées à des implants chez la souris

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle d’immunosuppression de la septicémie chez la souris via une instillation intranasale de Klebsiella pneumoniae et validons le modèle à l’aide de divers indicateurs.

Établissement d’un modèle d’immunosuppression induite par septicémie chez la souris par instillation intranasale de bactéries

Découvrez une voie d'infection sous-arachnoïdienne intracrânienne chez la souris pour étudier le rôle des biofilms de Streptococcus suis dans la méningite bactérienne. Ce modèle permet d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements.

Intracrânienne subarachnoïdien voie d’Infection pour enquêter sur les rôles des Biofilms de Streptococcus suis en méningite dans un modèle d’Infection de souris (Vidéo) | JoVE Journal

Intracrânienne subarachnoïdien voie d’Infection pour enquêter sur les rôles des Biofilms de Streptococcus suis en méningite dans un modèle d’Infection de souris

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