Name: Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez l'analyse du répertoire des anticorps anti-glucides circulants chez les petits animaux par la technologie de microarray de glycanes imprimés. Cette méthode hautement sensible permet de mesurer simultanément des centaines de cibles glycaniques avec un volume minimal d'échantillon.

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Ce travail a été soutenu par « Fondo de Investigaciones Sanitarias » (FIS) accorder PI13/01098 d’Institut de santé Carlos III, ministère espagnol de la santé. DB-G a bénéficié d’un poste de chercheur postdoctoral financé par l’Union européenne septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) en vertu de la subvention accord 603049 (TRANSLINK). Travail des NK, NS, NB a été soutenu par grant #14-50-00131 de fondation de la Science russe. DB-G veut exprimer sa gratitude à Marta Broto, J. Pablo Salvador et Ana Sanchis pour l’excellente assistance technique Alexander Rakitko d’assistance dans l’analyse statistique. Avec le soutien de la « Pla de Doctorats industriels de la Secretaria universitats i Recerca del Departament rotatif j’ai Coneixement de la Generalitat de Catalunya (octroyer le numéro 2018 DI 021). Nous remercions CERCA Programme / Generalitat de Catalunya d’appui institutionnel.

1. Glycochips Production
<ol><li>
Préparation de microarray
	<ol>
<li>Imprimer les glycanes (50 mM) et polysaccharides (10 µg/mL) dans une solution saline tamponnée (PBS, pH 8,5) à 6 réplique sur lames de verre N-hydroxysuccinimide-dérivatisés, utilisant le phosphate 300 mM sans-contact arrayer robotique (drop volume ~ 900 pL). Chaque diapositive contient 4 blocs de sous-tableaux (Figure 1 a, en couleurs) répétés 6 fois. Chaque sous-tableau unique est formé par 112 glycane différentes taches, y compris les contrôles (8 lignes × 14 colonnes) (Figure 1 b). Remarque : Informations relatives à glycane sont fournies dans le tableau1 supplémentaire. La bibliothèque de glycane utilisée pour les puces d’impression est le résultat d’un effort à long terme synthétique de l’équipe de IBCh ; exemples de synthèse sont décrits dans les publications s’y rapportant29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. La bibliothèque de glycane inclus des antigènes de groupe sanguin et parmi les plus fréquents des oligosaccharides terminales, ainsi que des motifs de base des mammifères N - et O-glycoprotéines liées et des glycolipides, antigènes d’hydrates de carbone associées à la tumeur, et polysaccharides de bactéries pathogènes.</li>
		<li>Incuber les lames dans la boîte de l’humidité (humidité relative ~ 70 %) à température ambiante (25 ° C) pendant 1 h.</li>
		<li>Blocage des microarrays : incuber les lames pendant 1,5 h avec un tampon de blocage à la température ambiante (acide borique 100 mM, éthanolamine 25 mM, 0,2 % (v/v) de Tween 20 dans l’eau ultrapure).</li>
		<li>Laver le glycochip avec de l’eau ultrapure et sécher par voie aérienne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glycochip contrôle de la qualité
	<ol>
<li>Analyser les deux puces à partir de chaque lot à l’aide de 1mg/mL de solution de préparation complexe immunoglobuline (CIP, contenant des IgG, IgM et IgA), 10 µg/mL de solution de biotinylé immunoglobulines de chèvre anti-humain comme un anticorps secondaire (IgM, IgG + IgA), suivie de 1 µg/mL solution du conjugué streptavidine fluorescent correspondant (via le protocole décrit ci-dessous, reportez-vous à l’étape 2).</li>
		<li>Scanner et analyser la glycochips (voir l’étape 3, l’analyse du tableau de glycan).</li>
		<li>Utiliser des lots de microarray avec intra - et inter - chip corrélation supérieure à 0,9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. glycane tableau Technique
<ol><li>
Préparer les solutions aqueuses suivantes (dans l’eau ultrapure) et les stocker à température ambiante (25 ° C) :
	<ul>
<li>Tampon-1 : 1 % (p/v) sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS, 1 % (v/v) de Tween 20 et 0,01 % (p/v) NaN3
</li>
		<li>Tampon-2 : 1 % (p/v) : BSA dans du PBS, 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 0,01 % (p/v) NaN3.</li>
		<li>Tampon-3 : 0,1 % (v/v) de Tween-20 dans du PBS.</li>
		<li>Tampon-4 : 0,001 % (v/v) de Tween-20 dans du PBS.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Préparation Glycochip et échantillon
	<ol>
<li>Mettre la boîte de rangement avec les lames sur la table jusqu'à ce qu’ils atteignent la température ambiante (25 ° C). Remarque : Utilisez des gants en latex sans poudre. Le glycochip doit avoir été manipulé par la partie inférieure de la lame de verre, où se trouve le code à barres. Le code à barres vous aidera à identifier la partie de droite, en évitant le contact avec la surface où les glycanes sont imprimés.</li>
		<li>Ouvrir la boîte, prendre la glycochip et le placer dans la chambre d’incubation (25 ° C), déjà conditionnée avec papier filtre mouillé à garder une humidité constante à l’intérieur de la chambre.</li>
		<li>Pendant ce temps, diluer le sérum de souris avec tampon-1 (01:20) dans des tubes de 1,5 mL. Homogénéiser la solution de sérum (5 s) avec un vortex. Remarque : Le volume nécessaire pour recouvrir complètement une surface unique de glycochip est d’environ 1 mL.</li>
		<li>Après l’homogénéisation, incuber le sérum dilué à 37 ° C pendant 10 min dans un bain d’eau pour éviter l’agrégation de l’immunoglobuline. Centrifuger les tubes pendant 3 min à 10 000 x g et 25 ° C, recueillir le surnageant et jeter n’importe quel matériel précipité.</li>
		<li>Placez délicatement le glycochip dans la chambre d’incubation. Il incuber pendant 15 min à 25 ° C avec 1 mL de tampon-3 afin d’éliminer tout matériau résiduel sur la surface de la glycochip.</li>
		<li>Tenez la glycochip en position verticale et il relaver avec quelques gouttes de tampon-3 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Retirer soigneusement le tampon de la surface de la glycochip à l’aide de papier filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Réaction : anticorps contraignant
	<ol>
<li>Placer le glycochip dans la chambre d’incubation. Étalez l’échantillon de sérum dilué sur la surface de la glycochip à l’aide d’une micropipette. Incubez avec agitation orbitale (30 tr/min) à 37 ° C pendant 1,5 h. veiller à ce que tous les endroit sec de la surface glycochip est couvert par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de l’embout de la pipette.</li>
		<li>Retirer tout excédent d’échantillon et y plonger le glycochip pendant 5 min dans le tampon-3 à 25 ° C. Ensuite, déplacer le glycochip vers un conteneur avec tampon-4 (5 min) et enfin laver (5 min) le glycochip avec de l’eau ultrapure. Centrifuger le glycochip pendant 1 min à 175 x g et 25 ° C pour éliminer le liquide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Détection : anticorps secondaire
	<ol>
<li>Placer le glycochip dans la chambre d’incubation. Étaler sur la surface de glycochip une solution (5 µg/mL) de chèvre anti-souris (IgG + IgM) conjugué à la biotine dans la mémoire tampon-2. Incubez avec agitation orbitale (30 tr/min) à 37 ° C pendant 1 h.</li>
		<li>Enlever la fraction libre et répéter les étapes de lavage.</li>
		<li>Après la centrifugation, incuber le glycochip dans l’obscurité à 25 ° C pendant 45 min (30 tr/min) avec 2 µg/mL de la solution de streptavidine marquée fluorochrome correspondante (dans la mémoire tampon-2).</li>
		<li>Dans l’obscurité, retirer la fraction libre et répétez les étapes de lavage.</li>
		<li>Sécher le glycochip par voie aérienne. Remarque : Glycochip devrait être analysé dès que possible. Mais si il est impossible d’analyser immédiatement après la coloration, les glycochips peuvent être stockées dans un endroit frais et sec dans l’obscurité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analyse du tableau de Glycan
<ol><li>
Analyse du tableau
	<ol>
<li>Laisser le glycochip sur la table jusqu'à ce qu’il atteigne la température de la pièce dans l’obscurité. Dans le même temps, allumer le scanner de diapositives et le laser (onde d’excitation de 633 nm).</li>
		<li>Tenant la biopuce, glisser le glycochip dans la fente jusqu'à ce qu’il touche le dos.</li>
		<li>Numériser le glycochip (« exécution easy scan ») et enregistrer l’analyse comme un «. Fichier TIFF ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantification de tableau
	<ol>
<li>Quantifier le tableau à l’aide d’un système d’analyse ScanArray. Ouvert précédemment les images numérisées, en cliquant sur « Fichier » dans le « groupe configurer & fichier » dans la fenêtre principale (Figure 1 b-D)</li>
		<li>Charger le modèle de fichier de tableau correspondant au format de GAL (disposition des glycanes imprimées sur la lame de verre) (Figure 1).</li>
		<li>Ajuster le modèle de liste d’adresses globale en alignant soigneusement le tableau (grilles) avec les points dans l’image et ouvrir la quantification (Figure 1).</li>
		<li>Sélectionnez les paramètres de quantification :<ul>
<li>Type de quantification : Run Quant facile.</li>
			<li>Méthode de quantification : fixe cercle</li>
			<li>Auto trouver Spots : décochez toutes les options</li>
			<li>Méthode de normalisation : LOWESS (localement pondérée Scatter Plot lissage).</li>
		</ul>
</li>
		<li>Enregistrer les données chiffrées comme «. Fichier CSV » (Figure 1). Transférer ces données dans un fichier commun de la feuille de calcul à l’aide de Microsoft Excel ou une autre application appropriée.</li>
		<li>Utiliser l’intervalle interquartile (IQR) comme la principale méthode statistique : calcul de la médiane (2 Quartile) de tous les signaux pour chaque ligand et l’écart interquartile (75e et 25e percentiles ou quartiles supérieurs et inférieurs Q3 et Q1, respectivement).</li>
		<li>Effectuer une exploration interactive des données en utilisant une application explorateur de Clustering hiérarchique.</li>
		<li>Utilisation de paramètres de cluster : liaison moyenne (UPGMA) et la distance euclidienne comme similitude distance mesure. Effectuer un regroupement hiérarchique par rangées sans normalisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Nailya Khasbiullinaet Alexey Nokel sont des employés de Semiotik LLC, qui est le fournisseur de la glycochips utilisée dans cette étude.

Glycan microarrays sont devenus des outils indispensables pour l’étude des interactions de protéine-glycane40. Les auteurs décrivent un protocole basé sur la technologie de la PGA pour étudier le répertoire consistant à diffuser des anticorps anti-glucides chez des souris BALB/c. Puisque PGA offre la possibilité à l’écran un grand nombre de glycanes biologiquement inconnu, c’est une découverte très pratique outil13,15,<sup class...

Les anticorps jouent un rôle central dans notre défense contre l’invasion des agents pathogènes en neutralisant directement les virus1,2 et bactéries2,3, en activant le système de complément4,5 et l’amélioration de la phagocytose,6. En outre, ils sont des éléments essentiels en ciblant le cancer et l’élimination des cellules malignes7et homéostasie entretien8,9.
Troubles du système immunitaire peuvent provoquer des maladies auto-immunes et inflammatoires cancer et10 11. Toutes ces conditions pathologiques idéalement exigent un diagnostic rapide pour un traitement efficace. Dans le cas de maladies auto-immunes, la présence sérologique d’auto-anticorps dans la plupart des cas est un facteur prédictif pour le diagnostic de l’auto-immunité10,12. Ces anticorps réagissent avec la surface cellulaire et extracellulaire auto-antigènes et, ils sont souvent présentes pendant plusieurs années avant la présentation d’une maladie auto-immune10,12. Cancer et déficits immunitaires sont aussi diagnostiqués avec les analyses de sang que soit mesurer le niveau d’éléments immunitaires comme les anticorps ou leur activité11.
L’identification du répertoire des anticorps et leur niveau sérologique en circulation sont primordiales pour définir un pronostic et d’évaluer la progression de l’ensemble des conditions pathologiques mentionnées. Nous avons déjà démontré le potentiel de PGA technique pour l’analyse des anticorps dans différentes espèces animales13–16, circulants réduisant au minimum l’utilisation de grands volumes d’échantillons sérologiques, évitant le problème associés de réaction croisée des anticorps17 et profilage de haut débit permettant d’un vaste répertoire d’anticorps15.
Glycan immunologiques sont principalement conditionnées, entre autres facteurs, par l’origine et la production d’hydrates de carbone, qui déterminent l’affinité et la liaison des ligands15,18,19,20 ,21. Glycan immunologiques peuvent être développées en suspension (microsphères)15,21,22 ou en surfaces activées plat15,21,22, 23,24. Le dernier comprennent PGA et ELISA (le plus classique de ces méthodes). Il n’y a pas beaucoup de données comparant ces méthodologies dans le même cadre expérimental15,25,26,27. Précédemment, nous avons comparé l’efficacité et la sélectivité de ces tests immunologiques aux anticorps anti-glycane profil dans des échantillons de plasma humain individuel15. Pour certains anticorps comme ceux groupe ciblage de sang anti-A/B, tous les tests immunologiques pourraient détecter avec une signification statistique et ils en corrélation positive avec l’autre15,18,21. Pendant ce temps, des anticorps anti-P1 étaient principalement détectées par PGA le pouvoir discriminatif plus élevé, et il n’y avait pas de corrélation dans les décisions rendues par les différents immunologiques glycane15,18, 21. ces différences entre les méthodes étaient principalement liées à l’antigène/anticorps ratio et glycan orientation15. ELISA et suspension sont plus susceptibles à la liaison non-spécifique que PGA parce qu’il y a un excédent d’antigène anticorps dans ces méthodes15. En outre, l’orientation des glycanes dans la PGA est plus restreinte que l’ELISA et suspension de tableaux15. ELISA est commode quand l’étude inclut un panneau limité des glycanes. Ainsi que des baies de la suspension, ELISA offre une flexibilité plus large au sujet de la reconfiguration de l’essai. PGA est privilégiée pour la découverte des approches15,18,21,28. Malgré ces avantages et les inconvénients, les immuno-essais mentionnés trois pourraient servir à étudier les différents aspects des interactions anticorps-glycane. L’objectif final de l’étude est que celle guideront le choix de la méthodologie plus approprié.
Le présent travail vise à étendre l’utilisation de la technologie de la PGA pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glycanes chez de petits animaux en circulation. Comme un résultat représentatif, nous présentons ici un protocole détaillé afin d’évaluer le répertoire des anticorps anti-glucides naturels chez la souris BALB/c adulte par PGA.

<table><tbody><tr><td>Anticorps Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinylated goat anti-human Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Réf. # : 31782</td><td></td></tr><tr><td>chèvre biotinylée anti-souris IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. # : 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp ;</td><td>Scienion AG, Berlin, Allemagne</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Plateau de teinture (chambre d’incubation de lames)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Canada</td><td>Réf. # : M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf, Hambourg, Allemagne&nbsp ;</td><td>Réf. # : 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Scanner de diapositives&nbsp ;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, États-Unis</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Royaume-Uni</td><td>Réf. # : SI50</td><td></td></tr><tr><td>Biological samples</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c mice sera</td><td>Cet article</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparation (CIP)</td><td>Immuno-Gem, Moscou, Russie</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><Puissants>Produits chimiques, réactifs et glycanes" </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycan library</td><td>Institut de chimie bioorganique (IBCh), Moscou, Russie</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp ;</td><td>Réf. # : A9418</td><td></td></tr><tr><td>Éthanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. # : 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Espagne</td><td>Réf. # : 655204</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte Sérum physiologique tamponné (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelone, Espagne</td><td>Réf. # : E404</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. # : S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. # : S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 conjugué</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Royaume-Uni</td><td>Réf. # : PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide-dérivatisé lames de verre H&nbsp ;</td><td>Schott-Nexterion, Iéna, Allemagne</td><td>Réf. # : 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. # : WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>tubes de 1,5 mL</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>Réf. # : 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Software and algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Microarray Microarray Analysis System</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hierarchical Clustering Explorer application</td><td>University of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

tableau de glycan imprimé : une technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Le répertoire d’anticorps anti-hydrate de carbone d’un individu donné circulants est souvent associé à son statut immunologique. Non seulement l’état immunitaire individuel détermine le succès dans la lutte contre les signaux de menace potentiels internes et externes, mais aussi l’existence d’un modèle particulier consistant à diffuser des anticorps anti-glycane (et leur variation niveau sérologique) pourrait être un marqueur important de l’apparition et la progression de certaines conditions pathologiques. Nous décrivons ici une méthodologie axée sur l’imprimé glycane Array PGA qui offre la possibilité de mesurer des centaines de glycane cibles à très haute sensibilité ; à l’aide d’une quantité minimale de l’échantillon, qui est une restriction des animaux présents lors de petites commune (rats, souris, hamster, etc.) sont utilisés comme modèles pour portent sur des aspects des maladies humaines. Comme un exemple représentatif de cette approche, nous montrons les résultats obtenus par l’analyse du répertoire des anticorps naturels anti-glycanes chez des souris BALB/c. Nous démontrons que chaque souris BALB/c participent à l’étude, tout en étant génétiquement identique et entretenu dans les mêmes conditions, développe un modèle particulier des anticorps anti-glucides naturels. Ce travail se veut étendre l’utilisation de la technologie de la PGA pour enquêter sur le répertoire (spécificités) et les taux d’anticorps anti-hydrates de carbone, tant en santé au cours de n’importe quel état pathologique en circulation.

Nous présentons ici un résumé des résultats représentatifs provenant de la quantification du répertoire d’anticorps naturels anti-glycanes chez une population de 20 souris BALB/c. La glycochips utilisée dans cette étude contenait 419 glycane différentes structures. La plupart des glycanes ont été synthétisés comme -CH2CH2CH2NH2 entretoise bras O-glycosides, dans plusieurs cas comme glycosides2NH2 ou NHCOCH -2<...

Ce travail montre le potentiel de la technologie de baies (PGA) de glycan imprimées pour l’analyse des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation.

Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

L’objectif global de ce protocole est d’étudier le profil des anticorps anti-glycan circulants dans le sérum des petits animaux à l’aide d’une technologie imprimée à base de tableau glycan. Cette approche a un potentiel dans le diagnostic tôt et le bon traitement dans quelques conditions pathologiques où les anticorps contre des structures glycan jouent un rôle important. Le principal avantage de cette technique, est la possibilité de mesurer dans le même cadre expérimental des centaines de cibles glycan avec une sensibilité très élevée en utilisant une quantité minimale d’échantillon.Pour préparer le micro-tableau, utilisez un tableau robotisé sans contact. Imprime six répliques de glycanes millimolaires et de 10 microgrammes par millilitre polysaccharides et 300 millimolaires PBS, pH 8,5 sur n-hydroxy 6 diapositives en verre dérivés cinnamiques. Chaque diapositive contient quatre blocs différents de sous-arras répétés six fois.Chaque sous-array est formé par 112 taches glycanes différentes, y compris les contrôles. Incuber les glissières dans une boîte d’humidité à température ambiante pendant une heure. Pour bloquer les micro-tableaux, incuber les diapositives pendant 1 1/2 heure avec tampon bloquant à température ambiante.Lavez ensuite la puce de glycol avec de l’eau ultra pure et séchez-la à l’air libre. Préparez tampon un par tampon quatre tel que décrit dans le protocole de texte. Pour préparer les copeaux et les échantillons de glycol, placez la boîte de rangement avec les glissières sur la table jusqu’à ce qu’elles atteignent la température ambiante.Ouvrez la boîte et transférez la puce de glycol dans la chambre d’incubation qui devrait déjà être conditionnée avec du papier filtre humide pour maintenir l’humidité constante à l’intérieur de la chambre. Pendant ce temps, diluer le sérum souris avec tampon un dans des tubes de 1,5 millilitre. Homogénéiser la solution sérique pendant cinq secondes à l’aide d’un mélangeur vortex.Après l’homogénéisation, incuber le sérum dilué à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain d’eau pour éviter l’agrégation d’immunoglobuline. Puis centrifuger les tubes pendant trois minutes à 10 000 fois G et 25 degrés Celsius. Recueillir le surnatant et jeter tout matériau précipité.Placer soigneusement la puce de glycol dans la chambre d’incubation. Incubez-le avec un millilitre de tampon trois pour éliminer tout matériau résiduel à la surface de la puce glycol. Pendant 15 minutes, à 25 degrés Celsius.Maintenez la puce de glycol dans une position verticale, et la lavée avec quelques gouttes de tampon trois à l’aide d’une pipette pasteur en plastique. Ensuite, retirez soigneusement le tampon de la surface de la puce glycol à l’aide de papier filtre. Remettre la puce de glycol dans la chambre d’incubation.Étendre l’échantillon de sérum dilué sur la surface de la puce glycol à l’aide d’une micro pipette. Assurez-vous que toutes les zones sèches de la surface des copeaux de glycol sont couvertes par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la pointe de la pipette. Incuber avec agitation orbitale à 37 degrés Celsius pendant 1 1/2 heures.Après l’incubation, retirer tout excès d’échantillon et plonger la puce de glycol pendant cinq minutes dans le tampon trois à 25 degrés Celsius. Passer la puce de glycol dans un récipient avec tampon quatre et enfin, laver la puce de glycol avec de l’eau ultra pure. Centrifuger la puce de glycol pendant une minute à 175 fois G et 25 degrés Celsius pour enlever le liquide.Après avoir remis la puce de glycol dans la chambre d’incubation, étendre une solution d’anti-souris de chèvre conjuguée à la biotine sur la surface des copeaux de glycol. Incuber avec agitation orbitale à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez la fraction non lédée et répétez les étapes de lavage.Après centrifugation, incuber la puce glycol dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 45 minutes avec deux microgrammes par millilitre de la solution de streptavidine étiquetée fluorochrome correspondante dans le tampon deux. Après avoir travaillé dans l’obscurité pour enlever la fraction non lié et répéter les étapes de lavage, sécher la puce de glycol par l’air. Pour numériser le tableau, laissez la puce glycol sur la table jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante dans l’obscurité.En même temps, allumez le scanner de diapositives et le laser. En tenant le micro tableau, faites glisser la puce glycol dans la fente jusqu’à ce qu’elle touche le dos. Scannez la puce glycol en exécutant EasyScan et enregistrez l’analyse sous forme de fichier tif.Quantifier le tableau à l’aide d’un système d’analyse ScanArray. Ouvrez les images précédemment numérisées en cliquant sur le fichier dans le configurer et le groupe de fichiers sur la fenêtre principale. Chargez le modèle de fichier de tableau correspondant au format GAL qui représente la disposition des glycanes imprimés sur la diapositive en verre.Ajustez le modèle GAL en alignant soigneusement le tableau avec les taches de l’image et initiez la quantification. Sélectionnez les périmètres de quantification comme type de quantification exécuter facile quant et la méthode de quantification cercle fixe. Délectez toutes les options pour les taches de recherche automatique et sélectionnez lowess pour la méthode de normalisation.Enregistrez les données quantifiées sous forme de fichier csv. Transférez ces données dans un fichier de feuille de calcul commun à l’aide de Microsoft Excel ou d’une autre application appropriée. Les souris génétiquement identiques ne devraient pas être considérées comme des équivalents immunologiques parce qu’elles ont développé différents modèles d’anticorps anti-glucides naturels.Comme indiqué ici, seulement 12 spécificités glycan ont été conservées. Montré ici, est un exemple représentatif des images obtenues à partir de micro puces de numérisation à l’aide d’un scanner florescent. La grille est ensuite alignée sur les taches de chaque sous-tableau.Le florescent est détecté pour chaque endroit et les résultats sont transférés dans un fichier de feuille de calcul commun. Après incubation avec le sérum de souris, les puces de glyco ont été scannées utilisant un lecteur de tableau de balayage. Les données ont été analysées avec un système d’analyse de micro-tableau et les résultats ont été exprimés dans RFU comme médiane plus de moins l’écart absolu médian.Les couleurs bleues et blanches représentent des signaux de liaison de fond inférieurs à 4000 RFU. La couleur rouge représente des signaux de liaison positifs supérieurs ou égaux à 4000 RFU. La plupart des structures glycan exposées dans les puces de glycol n’ont pas été reconnues par le répertoire des anticorps anti-glycan circulants des souris de balp C.Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en cinq heures et 45 minutes si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la technologie de tableau glycon imprimante pour étudier le répertoire et les niveaux d’anticorps anti-glucides circulants dans les échantillons de sérum. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la puce glyco doit être manipulée par une partie inférieure de la lumière des verres.Où se trouve le code à barres. Afin d’éviter tout contact avec les glycanes imprimés. Assurez-vous également que toute la zone sèche de la puce glyco est couverte par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la pointe de la pipette.Le volume nécessaire pour couvrir totalement une seule surface d’une puce glyco est d’environ un millilitre. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le tableau de suspension de base de microsphère peuvent être faites afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la détection multiplexe flexible du profil anticorps anti glycan. Après son introduction, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des molécules biomacrales et de l’immunologie pour explorer une interaction non protéique glycol chez l’ensemble des petits animaux.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette étude, nous décrivons un protocole amélioré pour une puce anticorps à haut débit multiplexées avec la méthode de détection lectine qui peut être utilisé dans le profilage de glycosylation des protéines spécifiques. Ce protocole propose de nouveaux réactifs fiables et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire par rapport à la procédure précédente.

Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

Cette vidéo présente la technologie de matrice de glycanes imprimée pour l’analyse des anticorps antiglycanes circulants dans le sérum de souris. Les anticorps contenus dans le sérum interagissent avec des glycanes spécifiques sur la puce, ce qui est confirmé par immunomarquage suivi d’un balayage par fluorescence.

Détection d’anticorps antiglycanes circulants à l’aide d’une matrice de glycanes imprimée

À l’aide d’une stratégie de microréseau de glycanes imprimée, un test conventionnel sur plaque à 96 puits a été miniaturisé pour l’analyse de l’avidité de l’hémagglutinine du virus de la grippe A et de la spécificité des récepteurs contenant de l’acide sialique.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Nous décrivons ici une méthode pour générer des microréseaux d’antigènes personnalisables qui peuvent être utilisés pour la détection simultanée d’auto-anticorps IgG et IgM sériques chez l’homme et la souris. Ces réseaux permettent une détection quantitative et à haut débit d’anticorps contre tout antigène ou épitope d’intérêt.

Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

Une approche modulaire de la synthèse des N- glycans à fixer sur un verre recouvert d’oxyde d’aluminium glisser (slide NOC) comme un microréseau glycane a été mis au point et son utilisation pour la détermination des caractéristiques d’un VIH largement anticorps neutralisant a été démontrée.

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Un dosage de microarray de sialoglycane peut être utilisé pour évaluer les anticorps anti-Neu5Gc dans des sérums humains, ce qui en fait un test de diagnostic potentiel à haut débit pour le cancer et d'autres maladies chroniques à médiation par inflammation chronique.

Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

Un protocole détaillé pour la purification et l'analyse suivante d'un anticorps monoclonal du fluide de culture cellulaire récolté (HCCF) des microbioréacteurs automatisés a été décrit. L'utilisation de l'analyse pour déterminer les attributs de qualité critiques (CqA) et la maximisation du volume limité de l'échantillon pour extraire des informations vitales sont également présentées.

Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

Le schéma de glycosylation d’un anticorps détermine ses performances cliniques, de sorte que les efforts industriels et académiques pour contrôler la glycosylation persistent. Étant donné que les campagnes typiques de glyco-ingénierie nécessitent beaucoup de temps et de main-d’œuvre, la génération d’un protocole rapide pour caractériser l’impact des gènes de glycosylation à l’aide d’un silence transitoire s’avérerait utile.

Glycoingénierie rapide des anticorps dans les cellules ovaires du hamster chinois

Le profilage des polymères par puces à ADN (MAPP) est une technique à haut débit pour l’analyse de la composition des glycanes dans les échantillons biologiques.

Profilage des polymères par puce à ADN (MAPP) pour l’analyse des glycanes à haut débit

Une méthode simple fente blot a été développé pour la quantification de l'hémagglutinine de la grippe virale et la neuraminidase utilisant des anticorps ciblant universelle leurs séquences les plus conservées identifiées par l'analyse bioinformatique. Cette approche innovatrice pourrait fournir une alternative utile pour la détermination quantitative de tous hémagglutinine et la neuraminidase virale.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Découvrez l'analyse du répertoire des anticorps anti-glucides circulants chez les petits animaux par la technologie de microarray de glycanes imprimés. Cette méthode hautement sensible permet de mesurer simultanément des centaines de cibles glycaniques avec un volume minimal d'échantillon.

Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation (Vidéo) | JoVE Journal

Tableau de Glycan imprimé : Une Technique sensible pour l’analyse du répertoire des anticorps anti-glucides chez de petits animaux en circulation

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