Isolement de cellules du stroma endométriales humains pour In Vitro décidualisation

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine de la reproduction concernant les mécanismes moléculaires sous-jacents de la décidualisation et la compréhension des rôles de gènes spécifiques dans la décidualisation des cellules stromales de l’endomètre. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’isolement des cellules stromales de l’endomètre humain et la décidualisation artificielle ultérieure par la supplémentation en hormones dans le milieu de culture. L’expression des changements hormonaux, tels que la prolactine et la protéine de liaison du facteur de croissance analogue à l’insuline, peut être utilisée pour confirmer et quantifier le degré de décidualisation.

Il est important de noter que la viabilité de ce protocole pour effectuer une neutralisation spécifique d’un gène est également démontrée. Transférez la biopsie avec une pince stérilisée dans un tube de 50 millilitres contenant dix millilitres de HBSF frais, suivi d’une centrifugation à 500x G pendant 90 secondes. À l’aide d’une pipette d’un ml, retirez le support et ajoutez un support d’isolement hES préchauffé de trois ml.

Décantez la biopsie dans une boîte de 10 centimètres contenant cinq ml de produit d’isolement hES et commencez à hacher à l’aide d’une pince Dumont 5 et de ciseaux à point droit fin pendant environ 20 minutes. À l’aide d’une pipette d’un ml, transférez la biopsie hachée dans un nouveau tube de 50 ml et ajoutez sept ml supplémentaires de milieu d’isolement hES dans la boîte, pour transférer les morceaux restants dans le tube de 50 ml. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant deux minutes à 800x G et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette d’un ml.

Ensuite, filtrez le mélange de digestion DNase-1 et de collagénase à travers un filtre de 0,2 micron fixé à une seringue de 10 millilitres directement sur la pastille. Ensuite, faites tourbillonner le tube pendant 10 secondes pour remettre la pastille en suspension et incubez pendant 90 minutes au bain-marie. Toutes les 10 minutes, faites un tour dans le tube pendant 10 secondes pour vous assurer que le tissu est correctement digéré.

Après l’incubation, filtrez la suspension à travers une crépine de cellules de 40 microns empilée sur un nouveau tube de 50 millilitres pour récupérer les cellules stromales, puis centrifugez les cellules collectées à 800x G pendant 2,5 minutes. Après la centrifugation, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette d’un millilitre, en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire. Ensuite, mettez la pastille cellulaire en suspension dans 10 millilitres de milieu d’isolement hES frais, suivie d’une centrifugation à 800x G pendant 2,5 minutes.

Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans six millilitres de milieu hES frais. Ensuite, pour éliminer les cellules sanguines, superposez lentement les cellules remises en suspension sur trois millilitres de milieu à gradient de densité et centrifugez l’échantillon à 400x G pendant 30 minutes. Après la centrifugation, recueillir le surnageant sans perturber le gradient de densité du milieu.

Ajoutez ensuite un milieu hES pour porter le volume total à 10 millilitres, puis centrifugez à nouveau l’échantillon à 800x G pendant 2,5 minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans six millilitres de milieu hES. Ensuite, plaquez les cellules dans un ballon de 75 centimètres en ajoutant six millilitres de resuspension cellulaire et 10 millilitres de milieu hES dans le flacon, puis mélangez doucement en secouant le ballon.

Après le placage, vérifiez la densité cellulaire au microscope, puis cultivez les cellules dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à cinq jours, en veillant à changer le milieu hES tous les deux jours. Après 48 heures, les cellules devraient se développer en monocouche. Généralement, après cinq jours, les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % dans un ballon de 75 centimètres.

Pour la transfection de siRNA, commencez par plaquer 800 000 cellules par puits dans une plaque à six puits en trois exemplaires pour chaque condition, et incubez les cellules dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours pour préparer la transfection. Après deux jours, ajoutez 150 microlitres de milieu sans sérum Opti-MEM dans un tube de cinq ml, suivi de l’ajout de cinq microlitres de réactif de transfection. Bien mélanger par inversion et incuber pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu sans sérum Opti-MEM dans un nouveau tube de cinq ml, puis ajoutez 16 nanomoles de siRNA SRC-2. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu sans sérum Opti-MEM dans un tube de cinq ml, suivi de l’ajout de 16 nanomoles de contrôle siRNA. Après l’incubation, combinez le réactif de transfection dilué avec le siRNA SRC-2 et mélangez bien en pipetant en avant et en arrière.

Combinez ensuite le réactif de transfection dilué avec le siRNA de contrôle et mélangez bien en pipetant en avant et en arrière. Ensuite, incubez les complexes pendant cinq minutes. Au cours de cette incubation, aspirez le milieu hES et ajoutez un millilitre de milieu de changement dans chaque puits.

Après cinq minutes d’incubation, centrifugez les complexes à 500x G pendant deux minutes pour recueillir la solution. Ajoutez ensuite 250 microlitres de complexes de réactifs de transfection siRNA dans chaque puits contenant des cellules et des milieux, et mélangez par balancement doux, suivi d’une incubation dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures à 37 degrés Celsius. Après cinq heures, aspirer le milieu et passer au milieu hES, puis poursuivre l’incubation pendant deux jours en préparation d’un essai de décidualisation in vitro.

Après la transfection dans les 48 heures et avant de commencer le test de décidualisation in vitro, prélever les cellules témoins du jour zéro transfectées par des siRNA et des siRNA SRC-2. Tout d’abord, aspirez le média et lavez-le avec un mL de PBS par puits. Retirez ensuite le PBS et ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse de l’ARN par puits et incubez pendant trois minutes.

Après trois minutes d’incubation, collectez les cellules dans le tampon de lyse de l’ARN dans un tube de 1,5 ml pour une analyse ultérieure en aval. Ensuite, préparez le milieu EPC en aliquotant le volume approprié de milieu de décidualisation et ajoutez 10 nanomolaires d’œstradiol, un micromolaire d’acétate de médroxyprogestérone et 50 micromolaires d’adénosine monophosphate cyclique dans un tube de 50 millilitres. Pour les six puits du jour restant, ajoutez deux millilitres de média EPC dans chaque puits et incubez les cellules dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant six jours, en changeant le média EPC toutes les 48 heures.

Après le sixième jour, prélever les granules cellulaires transfectées du siRNA de contrôle du sixième jour et du siRNA SRC-2 du sixième jour dans un tampon de lyse de l’ARN pour une analyse en aval à l’aide de la PCR en temps réel. L’induction de la décidualisation par l’acétate de médroxyprogestérone d’œstrogène et l’adénosine monophosphate cyclique entraîne le réarrangement cytosquelettique des cellules stromales de cellules fibroblastiques allongées en cellules épithéliaïdes arrondies. La coloration à la phalloïdine des cellules stromales de l’endomètre révèle en outre la réorganisation active du cytosquelette des fibres caractéristique de la décidualisation de l’ES.

Dans les cellules hES traitées en véhicule, les cellules restent fibroblastiques en apparence, tandis que dans les cellules traitées par EPC, les hES ressemblaient à des épithélioïdes. Pour confirmer l’efficacité du test de décidualisation in vitro, les niveaux de transcrits d’ARNm des marqueurs de décidualisation prolactine et de la protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l’insuline-1 ont été évalués sur une période de 6 jours. Lors de la décidualisation des cellules stromales de l’endomètre humain, les niveaux de prolactine et d’IGFBP1 ont augmenté de manière dépendante du temps.

L’augmentation temporelle des taux de prolactine sécrétée a également été confirmée par l’examen des milieux de culture tissulaire hES via la méthode ELISA. Les effets d’inactivation spécifiques du gène sur les changements cellulaires et moléculaires de la décidualisation des cellules stromales de l’endomètre humain ont été évalués le sixième jour de culture après la transfection de siRNA de 48 heures, avec le témoin ou le co-activateur du récepteur stéroïdien 2 siRNA. Les hES transfectés par des siRNA témoins ont montré des changements cellulaires et moléculaires, compatibles avec une décidualisation correcte, y compris un changement morphologique des pavés et une augmentation des niveaux de transcription des marqueurs de décidualisation PRL et IGFBP1.

Dans l’inactivation de l’ARNi SRC-2, l’hES est resté d’apparence fibroblastique par rapport au hES transfecté par le siRNA témoin, et a montré une diminution significative des niveaux de transcrits PRL et IGFBP1. Les niveaux de transcrits SRC-2 ont été significativement diminués dans les hES transfectés par siRNA SRC-2 par rapport aux siRNA témoins, ce qui indique la viabilité de cette méthode pour le silençage génique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules stromales primaires des biopsies de l’endomètre dans le but de décidualiser in vitro et d’inhiber un gène d’intérêt spécifique en utilisant la transfection de siRNA.