Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis

Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.

L’objectif global de cette technique est de fournir une méthode de profilage simultané des fractions cellulaires immunitaires et cancéreuses contribuant au microenvironnement immunitaire des tumeurs solides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immuno-oncologie, telles que les changements en série immunitaires et non immunitaires qui se produisent dans la tumeur après un traitement donné. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite l’enrichissement efficace des composants immunitaires et non immunitaires de la tumeur, permettant un profilage approfondi de l’état immunologique de la tumeur.

L’objectif global de cette méthode est de profiler efficacement le microenvironnement immunitaire tumoral et d’identifier les changements induits par le traitement. Après avoir pulvérisé la souris avec de l’éthanol à 70 % pour éviter la contamination des cheveux, retirez chirurgicalement les tumeurs sous-cutanées, en veillant à ce que les tumeurs soient exemptes de tout tissu contaminant. Ensuite, placez chaque tumeur dans 1,8 millilitres de milieu de base RPMI 1640 sans sérum de bovin fœtal dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits sur glace.

Lorsque toutes les tumeurs ont été collectées, utilisez des ciseaux pour couper les échantillons en morceaux de moins d’un millimètre cube et ajoutez 200 microlitres de cocktail de dissociation 10X fraîchement préparé contenant de la collagénase-1, de la collagénase-4 et de la DNase un dans chaque puits. Après une heure à 37 degrés Celsius, dans un agitateur de plaques orbitales à 60 à 100 tr/min, neutralisez la réaction avec un millilitre de milieu RPMI 1640 complété par 5 % FBS et deux millimolaires EDTA, et utilisez une pointe de pipette modifiée d’un millilitre pour transférer chaque échantillon de boue tumorale dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres surmontés de crépines individuelles de 40 micromètres. À l’aide d’un piston de seringue de 10 millilitres, désagréger mécaniquement les morceaux de tumeur à travers les crépines, en rinçant périodiquement chaque crépine avec deux millilitres de milieu RPMI 1640 plus 5 % FBS jusqu’à ce que les passoires soient exemptes de tumeur.

Lorsque toutes les tumeurs ont été dissociées, ajoutez du milieu dans chaque tube si nécessaire pour amener tous les échantillons au même volume et granulez les cellules par centrifugation. Ensuite, utilisez une pipette sérologique de cinq millilitres pour remettre les granulés en suspension dans deux millilitres de milieu supplémenté en FBS par tube. Pour séparer les fractions de cellules immunitaires et tumorales, ajoutez trois millilitres de milieu de gradient de densité au fond d’un tube conique de 15 millilitres par échantillon et superposez lentement deux millilitres de suspension de cellules tumorales sur le côté de chaque tube sur chaque gradient.

Veillez à ce que les suspensions de cellules tumorales soient bien mélangées avant la superposition, à ce que les suspensions cellulaires soient lentement pipetées sur le côté des tubes et à ce que les tubes soient manipulés avec soin pour éviter le mélange des couches. Séparez les cellules par centrifugation à gradient de densité et collectez soigneusement le milieu supérieur et les couches de leucocytes infiltrant la tumeur dans un nouveau tube de 15 millilitres par échantillon. Jetez le milieu à gradient de densité restant et remettez en suspension les pastilles tumorales dans deux millilitres de milieu plus FBS par tube.

Ensuite, centrifugez tous les échantillons et mettez en suspension les leucocytes infiltrant la tumeur dans 200 microlitres et les cellules tumorales dans deux millilitres de milieu plus FBS par tube sur de la glace. Pour plaquer les cellules, étiquetez une plaque à fond en U de 96 puits pour chaque panneau de coloration immunitaire plus une plaque supplémentaire pour le numération cellulaire et aliquote les suspensions de cellules uniques dans chacune des plaques du panneau de coloration et la plaque anticalcaire. Lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS de Dulbecco par échantillon et bloquez les cellules avec 50 microlitres de bloc de FC par puits pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

À la fin de l’incubation bloquante, ajoutez 50 microlitres d’anticorps de ciblage extracellulaire concentré 2X et de mélange de coloration de viabilité fixable dans chaque puits pour une incubation de 30 minutes dans l’obscurité. À la fin de l’incubation de la coloration, laver les échantillons deux fois avec un tampon FACS et remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de solution de fixation et de perméabilisation pendant la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Le lendemain, recueillir les cellules par centrifugation, suivie d’un lavage avec 200 microlitres de tampon de perméabilisation par puits.

Étiquetez les cellules avec 100 microlitres de panneau de coloration d’anticorps intracellulaires dans un tampon de perméabilisation pour une incubation de 30 minutes dans l’obscurité, suivie d’un autre lavage du tampon de perméabilisation. Ensuite, lavez à nouveau les cellules avec le tampon FACS et mettez à nouveau les échantillons en suspension dans 300 microlitres de tampon FACS frais pour leur analyse par cytométrie en flux. La digestion tumorale, telle qu’elle a été démontrée, avec ou sans enrichissement en milieu de gradient de densité, permet d’obtenir une population de cellules tumorales entières viable à environ 70 à 90 %, évaluée par cytométrie en flux.

L’enrichissement en milieu à gradient de densité favorise une augmentation de plus de deux fois de la fraction leucocytaire infiltrante tumorale CD45 positive, par rapport aux digestions tumorales non enrichies, ainsi qu’à de nombreux sous-ensembles de cellules immunitaires couramment observés dans les études de microenvironnement immunitaire. La fraction de cellules tumorales CD45 négative peut également être profilée pour de nombreuses caractéristiques tumorales, telles que la viabilité tumorale globale ou l’apoptose, la capacité de prolifération et l’expression de divers marqueurs immunosuppresseurs. Pour déterminer comment les sous-ensembles immunologiques myéloïdes et lymphocytaires varient dans une seule tumeur solide, la tumeur peut être divisée en quatre parties égales de telle sorte que chaque section contienne des régions intratumorales à peu près égales, ainsi que des parties cutanées et péritonéales égales.

Chaque morceau peut ensuite être digéré séparément et analysé, comme démontré, pour détecter la présence de diverses populations de cellules immunitaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à 8 heures selon le nombre d’échantillons dont vous disposez. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de travailler rapidement mais efficacement pour préserver la viabilité cellulaire.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissociation et de séparation impliquent des techniques difficiles à apprendre par le seul texte écrit. À la suite de cette procédure, la cytométrie en flux peut être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont les populations cellulaires changent au sein d’une tumeur, à la fois en termes d’abondance et de phénotype. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de séparer et d’analyser les composants immunitaires et non immunitaires d’une tumeur murine sous-cutanée établie à l’aide des techniques de digestion et de séparation par gradient de densité démontrées.