Name: Suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les Cardiomyocytes induites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez la reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris en cardiomyocytes fonctionnels par surexpression de facteurs de transcription et microARNs. Cette méthode efficace permet de générer des cellules cardiaques battantes en sept jours.

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Cette recherche a été financée par des fonds de programme de la Fondation Webb-Waring Boettcher Biomedical Research, American Heart Association scientifique Development Grant (13SDG17400031), Université du Colorado et la médecine remarquable début de carrière Scholar Program, University of Colorado Division de cardiologie Nyle de Barlow endowment et R01HL133230 NIH (à kaki). A.S.R était soutenue par les NIH/NCATS Colorado CSTC Grant nombre TL1TR001081 et une bourse pré-doctorale auprès du Consortium de l’Université du Colorado pour la recherche sur la fibrose & traduction (CFReT). Cette recherche a été également pris en charge par la subvention de soutien Cancer Center (P30CA046934), la subvention du noyaux de la recherche des maladies peau (P30AR057212) et le Flow Cytometry Core à l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.

Toutes les expériences nécessitant des animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à la Campus médical d’Anschutz UC Denver et d’institutionnels animalier.
1. isolement de MEFs
<ol><li>Acheter enceintes souris C57BL/6, à E13. Navire du jour au lendemain.</li>
	<li>Euthanasier la mère selon les protocoles IACUC approuvés (ex : ~1.3 L/min CO2 jusqu'à ce que l’animal apparaît mort suivie de dislocation cervicale)</li>
	<li>La mère de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et ouvrir la cavité abdominale. Enlever la corne utérine contenant des embryons et placer dans un plat de 10 cm avec du PBS stérile.</li>
	<li>Faites une incision dans le sac embryonnaire pour libérer l’embryon. Transfert d’embryon pour nettoyer le plat de 10 cm avec du PBS stérile. Rincer à fond.</li>
	<li>Couper le corps sous le foie et jeter la tête et le haut du corps. Enlever les organes internes et jeter. Le tissu reste dans un plat propre 10 cm avec du PBS stérile et du transfert de la plaque à un niveau de biosécurité 1 ou 2 du Cabinet. Combiner les tissus de tous les embryons dans un récipient propre et sec de 10 cm et émincer en fins morceaux.</li>
	<li>Ajouter 6 mL de 0,25 % trypsine/1 mM EDTA aux embryons hachées. Triturer plusieurs fois pour briser le tissu à l’aide d’une pipette. Incuber pendant 40 min à 37 ° c avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance (tableau 1). Le volume des médias est ajusté selon le nombre d’embryons récoltés. En général, utiliser un ratio d’environ les milieux de croissance 25 mL pour 1,2 embryons.</li>
	<li>Plaque de 25 mL de cellules resuspendues dans un plat de 15 cm. Après 24h, aspirer les médias et ajouter 25 mL de milieu de croissance fraîche à chaque assiette.</li>
	<li>Après 72 h, ajouter 2 mL de 0,25 % trypsine/1 mM EDTA à chaque plat de 15 cm. Lorsque les cellules se détachement de la boîte de Petri, inactiver la trypsine avec 15 mL de milieu de croissance et de prélever des cellules dans les tubes coniques en polystyrène de 50 mL. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 160 x g à la température ambiante. Resuspendre le culot cellulaire dans le milieu de croissance et filtre à travers un tamis de cellule pore 70 µm.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et congeler les MEFs en aliquotes de 2 millions de cellules dans un milieu de gel (10 % DMSO, 25 % FBS dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) / High glucose) à-80 ° C. Cellules de transfert d’azote liquide après 24h et magasin jusqu'à utilisation. Remarque : L’expression des gènes Global en MEFs a été profilée isolé à l’aide de ce protocole par RNA-sequencing (RNA-seq) afin d’assurer l’authentification de la cellule. RNA-seq données de cellules Encoder MEF ont été téléchargées de NIH Gene Expression Omnibus (GEO) avec le numéro d’ordre GSE93454. Données d’expression génique de RNA-seq pour les MEFs nous utilisés ont été déposées au NIH GEO avec numéro d’ordre GSE71405. Ces deux ensembles de données ont été regroupés selon les symboles courants de gène. Les données d’expression ont été ensuite logarithme et un diagramme de dispersion des données expression pour notre MEFs et ENCODE MEFs ont été générés et dotée d’une ligne de régression linéaire (Figure 1 a). MEFs isolées à l’aide de ce protocole sont moléculairement semblables à ceux qui sont isolés par d’autres laboratoires.</li>
</ol>2. production de rétrovirus et Transduction de MEFs
Remarque : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées dans une armoire de 2 de niveau de biosécurité. Étant donné que ce protocole utilise transduction rétrovirale, veiller à ce que des précautions sont prises, y compris le traitement de que tous les déchets contenant des médias virales avec eau de Javel 10 % pendant au moins 20 min. Voir la Figure 1 b pour qu’une chronologie pour la reprogrammation de la sécurité.
<ol><li>
Production de rétrovirus à l’aide de la lignée cellulaire de platine E (PE)
	<ol>
<li>Maintenir les cellules disponibles dans le commerce de PE PE moyen (tableau 1) contenant blasticidine et puromycine sélection des marqueurs afin d’assurer l’expression de gag-pol et env gènes pour la production de particules rétrovirales efficace36 . Cellules de passage au 1:4 ou 1:5 tous les deux jours. Prendre soin d’éviter le surpeuplement des cellules, car cela pourrait réduire les rendements de production rétrovirale.</li>
		<li>Le jour -1, graines environ 5 x 106 cellules / plat de 10 cm dans le milieu de croissance (tableau 1), 16-20 h avant la transfection (voir le tableau 2 pour les densités pour les autres tailles de plat de culture cellulaire standard de placage). Balançant doucement des plats en arrière à plusieurs reprises et placez-la dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur afin d’assurer la répartition égale de placage (voir Figure 1 pour densité placage optimal avant la transfection). Remarque : prendre soin de cellules PE plaque dans le milieu libre de marqueurs de sélection avant la transfection d’assurer un milieu contenant des particules rétrovirales générés ne tue pas les MEFs.</li>
		<li>Le jour 0, préparer l’ADN pour la transfection. Pour la transfection de plat de 10 cm, ajouter 2 µg de chaque facteur reprogrammation — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) — dans un tube de 1,5 mL. Remarque : Reportez-vous au tableau 2 , à l’échelle de la quantité d’ADN nécessaire à transfecter autres tailles de plat de culture cellulaire standard.</li>
		<li>Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajouter 360 µL sérum réduit médias. Puis ajouter 36 µL de réactif de transfection directement aux médias de sérum réduit. Doucement effleurer le tube et laisser incuber à température ambiante pendant 5 min. Remarque : Pour éviter l’efficacité réduite de transfection, ajouter avec précaution réactif de transfection directement sur le support de sérum réduit.</li>
		<li>Ajouter sérum réduit médias/transfection réactif mélange d’ADN de GHMT2m cocktail. Doucement, mettez le tube et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Ne pas vortexer.</li>
		<li>Le mélange réactionnel, ajouter quelques gouttes de cellules PE, doucement agiter les médias pour 10-15 s et placer dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. Remarque : Selon le fabricant, les cellules PE génèrent un titre moyen de 106 107 infectieuses unités/ml. Ce protocole génère environ 2 x 106 infections unités/mL par 24h et 6 x 106 infections unités/mL de 48 h pour MOI de 4 en moyenne. Transfection de GFP/DsRed peut aussi servir comme un substitut pour l’efficacité de transfection/transduction si vous le souhaitez ; efficacité de transfection devrait dépasser 90 % en 48 h (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transduction de MEFs
	<ol>
<li>Le jour 0, enduire les plats avec le collagène et les place dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant au moins 2 h.</li>
		<li>Retirez les MEFs de dégel et de l’azote liquide. Plaque de 0,2 x 106 cellules / plat de 60 mm dans le milieu de croissance. Doucement plaques de roche pour assurer même distribution de placage et placer dans un incubateur (voir Figure 1 pour la densité optimale de placage et le tableau 2 pour placage densités pour les autres tailles de plat de culture cellulaire standard). Remarque : Ces densités d’ensemencement ont été testées sur plusieurs lots de MEFs isolés ; à moins que l’affichage MEFs compromise sensiblement la viabilité, réglage des cellules des densités de semis n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Le jour 1, transfection après 24 h, utiliser une seringue de 30 mL pour recueillir les rétroviraux moyen généré par les cellules de PE. Passez le milieu à travers un filtre à pores de 0,45 µm dans un tube conique de 50 mL. Ajoute une concentration finale de 6 µg/mL de réactif de transfection de bromure de hexadimethrine. Ajouter avec précaution 10 mL de milieu de croissance fraîche aux cellules de PE par pipetage géloses sur la paroi de la boîte de Pétri pour empêcher le déplacement des cellules.</li>
		<li>Aspirer le milieu de MEFs et ajouter 4 mL de milieu retroviral fraîchement récolté à chaque plat. Remettez les MEFs dans l’incubateur. Ajouter 10 % eau de Javel à tous les matériaux en contact avec le fluide viral pour neutraliser des particules rétrovirales.</li>
		<li>Le jour 2, transfection après 48 h, répétez les étapes 2.2.2 et 2.2.3. Cellules de PE sont éliminés suite à la collection de 2nd du milieu rétrovirale. NOTE : Ajouter 10 % eau de Javel aux cellules de PE au rebut pendant au moins 20 min neutraliser les rétrovirus indésirables.</li>
		<li>Le jour 3, aspirer moyen de MEFs et reconstituer avec 4 mL de milieu d’iCM (tableau 1) contenant 0,5 µM A-83-01, un TGF-β j’ai type inhibiteur du récepteur. Reconstituer l’iCM milieu contenant A-83-01 tous les 2 jours. NOTE : Si vous utilisez GFP comme un contrôle de transduction, l’expression devrait dépasser 90 % de ce point dans le temps (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cytométrie de flux pour les marqueurs cardiaques
<ol><li>Moyen d’aspiration du jour 9 reprogrammé MEFs et lavage (1 x) avec du PBS 1 x pour enlever les débris et les cellules mortes.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 0,25 % trypsine/EDTA pendant 5 min à 37 ° c. Vérifier les cellules à l’aide d’un microscope optique et secouez le plat ; Si les cellules restent attachées, incuber 5 min de plus à 37 ° c jusqu'à ce que les cellules se détachement.</li>
	<li>Laver les cellules dans du PBS 1 x contenant 5 % FBS et filtre à travers un tamis de cellule pore 70 µm.</li>
	<li>Centrifuger à 160 g pendant 3 min à température ambiante et aspiration liquide de la pastille. Remarque : Pour augmenter le rendement de la cellule, laisse reposer environ 50 µL liquide au-dessus le culot cellulaire.</li>
	<li>Laver les cellules avec 500 µL 1 x PBS contenant 1 % de BSA.</li>
	<li>Difficulté de 0,2 mL/1 millions de cellules solution de fixation pendant 20 min sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de glacee perm/lavage 1 x. Remarque : La solution du fabricant est 10 x.</li>
	<li>Centrifuger à 160 x g pendant 5 min à 4 ° C, les cellules et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.7 et 3.8 un délai supplémentaire. Après le lavage 2nd , passez directement à l’étape suivante ou garder les cellules à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Bloc avec 100 µL de sérum d’âne dans 1 x tampon de perm/lavage pendant 30 min à température ambiante et de 5 % de sérum de chèvre.</li>
	<li>Ajouter 100 µL d’anticorps primaire dilué. Remarque : Pour ce protocole, les cellules sont marquées avec souris troponine T (1 : 200) et souris α-actinine (1 : 200) afin de quantifier le pourcentage de cellules positives pour les composants clés de la sarcomères cardiaque. Incuber les anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 160 x g pendant 5 m à 4 ° C, les cellules, aspirer le surnageant et laver 2 x avec tampon glacee perm/cycle de lavage.</li>
	<li>Ajouter 100 µL d’anticorps secondaire dilué. Remarque : Pour ce protocole, les cellules sont marquées avec de 647 nm secondaires anticorps anti-souris (1 : 200). Incuber les anticorps secondaire pendant 45 min à température ambiante sur une coiffe de tube plus fin. Protéger les cellules de lumière en encapsulant des tubes en aluminium.</li>
	<li>Centrifuger à 160 x g pendant 5 min à 4 ° C, les cellules, aspirer le surnageant et laver 2 x avec tampon glacee perm/cycle de lavage.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 1 % de BSA dans du PBS et effectuer immédiatement des FACS. NOTE : Générer un diagramme de dispersion avant dispersion vs côté à la porte des cellules viables tout d’abord lors de l’exécution des FACS. Alternativement, utiliser une tache disponibles dans le commerce en direct/dead cell avant de fixer les cellules pour identifier direct et mort cellulaire des populations.</li>
</ol>4. Immunostaining des MEFs reprogrammés
<ol><li>Moyen d’aspiration du 14e reprogrammé MEFs et lavage (1 x) avec 1 mL 1 x PBS glacée. Remarque : Pour immunostaining, reprogrammation a été effectuée en 12 assiettes bien pour minimiser les volumes de solution d’anticorps. 24 plats peuvent également être utilisés ; simplement la moitié de tous les volumes de suite.</li>
	<li>Aspirer et fixer les cellules avec 500 µL 2 de paraformaldéhyde % pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer et laver les cellules 3 fois avec du PBS de 1 x 1 mL (5 min par lavage à température ambiante).</li>
	<li>Permeabilize cellules avec 500 µL 0,2 % perméabilisation de réactif en PBS pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer et bloquer dans 500 µL 10 % de sérum de cheval dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer et incuber avec 500 µL de l’anticorps primaire dilué pendant 1 h à température ambiante. Remarque : Pour ce protocole, les cellules ont été marqués avec souris troponine T ou α-actinine (chaque 1 : 400) et co marquées avec la connexine 43 (1 : 400) ou de la troponine I (1 : 400).</li>
	<li>Aspirer l’anticorps primaire et laver trois fois avec du PBS de 1 x 1 mL (5 min par lavage à température ambiante).</li>
	<li>Aspirer et incuber avec anticorps secondaire dilué de 500 µL pendant 1 heure à température ambiante. Remarque : Pour ce protocole, les cellules sont marquées avec l’anti-souris 555 nm anticorps secondaire (1:800) de reconnaître la troponine T ou α-actinine et anti-lapin 488 nm anticorps secondaire (1:800) de reconnaître la connexine 43 ou troponine I. en outre, les noyaux ont été colorés avec Hoechst (01:10, 000). Protéger les cellules de lumière en incubant dans l’obscurité.</li>
	<li>Aspirer l’anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS de 1 x 1 mL (5 min par lavage à température ambiante). Enrouler la plaque en aluminium pour protéger les cellules contre la lumière et conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Image à l’aide de la microscopie à épifluorescence trois canaux.</li>
</ol>5. imagerie calcique
Remarque : Si l’image à un grossissement de 10 X, assiettes et plats de culture cellulaire standard conviennent à imagerie calcique. Imagerie à un grossissement supérieur requiert que les cellules être plaqué sur couvre-objet en verre ou verre fond plats.
<ol><li>Aspirez le milieu et ajouter 2 mL (pour un 6 bien de plaque) modifié solution Tyrode (140 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2, de 10 mM de glucose, de 10 mM HEPES, BSA de 0,1 % et 1 % de pyruvate, pH 7,4) contenant 5 µM Fura-2 AM et 0,1 % Pluronique F-127 à battre (D14 t SGCI o D20). Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. NOTE : Protéger les cellules de lumière afin d’éviter la désactivation de l’indicateur fluorescent.</li>
	<li>Laver les cellules dans une solution de 2 mL Tyrode pendant 30 min à température ambiante pour permettre dé-estérification du Fura-2 AM.</li>
	<li>Image avec filature microscopie confocale disque à 340 nm et 380 nm à l’aide de Slidebook 5.5 Ca2 + logiciel d’imagerie. Effectuer l’imagerie à la température ambiante.</li>
	<li>Transitoires de calcium sont calculés en utilisant le ratio d’intensité de fluorescence à 340 nm sur l’intensité de fluorescence à 380 nm.</li>
	<li>Si vous le souhaitez, traiter du SGCI avec 1 ou 2 µM isoprotérénol ou 10 µM nifédipine pour manipuler le calcium manipulation après imagerie transitoires de calcium de référence. Ajouter localement composés de cellules et de l’image.</li>
</ol>

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<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+A+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: A source of cardiac regeneration.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li>
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<li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Enhancement+of+In+Vitro+and+In+Vivo+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming.</a> Circulation. 135, 978-995 (2017).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li>
<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+reprogramming+to+transdifferentiate+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+adenoviral+vectors%3A+Implications+for+clinical+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La présente étude décrit une stratégie hautement efficace pour reprogrammer directement des fibroblastes dans le SGCI fonctionnel via la livraison de GHMT2m reprogrammation facteurs combinés avec la suppression des voies de signalisation pro-fibreuses. À l’aide de la cytométrie en flux, imagerie par immunofluorescence, calcium d’imagerie et battant les globules, nous montrons la majorité des cellules dans le présent protocole subissent une reprogrammation réussie et adopter sort de lignée CM. Nous avons déjà montré que l...

Cardiopathie ischémique est des principales causes de décès chez les États-Unis1. Environ 800 000 américains d’expérience un premier ou récurrente infarctus du myocarde (MI) par année1. Suite MI, la mort de cardiomyocytes (CMs) et la fibrose cardiaque, déposés par les fibroblastes cardiaques activés, atteinte cardiaque fonction2,3. Progression de l’insuffisance cardiaque suite MI est largement irréversible en raison de la mauvaise capacité de régénération des adultes CMs4,5. Alors que les traitements cliniques actuels ralentissent la progression de la maladie et diminuent le risque d’événements cardiaques futurs6,7,8,9, aucune thérapie n’inverse de progression de la maladie en raison de l’incapacité de régénérer le CMs après infarctus du myocarde10. Thérapies cellulaires nouvelles font leur apparition pour traiter les patients après mi décevant, essais cliniques offrant des cellules souches au cœur après MI jusqu'à présent ont montré peu concluantes régénératrice potentiels11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
La génération de cellules souches pluripotentes induites anthropique (hiPSCs) les fibroblastes par la surexpression des quatre facteurs de transcription, d’abord démontrée par Takahashi & Yamanaka, a ouvert la porte à nouvelles percées dans cell therapy19. Ces cellules peuvent se différencier en tous les trois couches de germe19, et plusieurs méthodes très efficaces pour générer un grand nombre de CMs ont démontré antérieurement20,21. Dérivés de HiPSC CMs (hanches-CMs) offre une plate-forme puissante pour étudier cardiomyogénèse et peut avoir des implications importantes pour réparer le coeur après une blessure. Cependant, les hanches-CMs font actuellement face à des haies translationnelles en raison du risque de formation de tératome22, et leur nature immature peut être pro-arythmogène23. Reprogrammation des fibroblastes dans hiPSCs suscité l’intérêt en reprogrammation directement des fibroblastes en un autre type de cellule. IEDA et coll. ont démontré que la surexpression de GATA4, Mef2c et Tbx5 (GMT) dans les résultats de fibroblastes en reprogrammation directe à la lignée cardiaque, mais à faible efficacité24. Reprogrammation de l’efficacité a été améliorée avec l’ajout de Hand2 (GHMT)25. Depuis ces premières études, nombreuses publications ont démontré que des facteurs altérant la reprogrammation cocktail facteur avec transcription supplémentaire26,27,28,29, chromatine modificateurs30,31, microARN32,33ou petites molécules34 mène à une reprogrammation efficacité et/ou de la maturation des cellules semblables à des cardiomyocytes induites (SGIC ).
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour générer du SGCI de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) avec une grande efficacité. Nous avons montré précédemment que le GHMT cocktail est nettement améliorée avec l’ajout de miR-1 et miR-133 (GHMT2m) et est ensuite amélioré quand y compris transformant le facteur de croissance (TGF-β) de β signalisation de voies de signalisation pro-fibreuses ou associée à Rho voies de signalisation de protéine kinase (ROCK) sont inhibés35. En utilisant ce protocole, nous montrons qu’environ 60 % des cellules express cardiaque troponine T (cTnT), environ 50 % express α-actinine, et un nombre élevé de cellules de battements peut être observé dès 11 jour après transduction de reprogrammation des facteurs et traitement avec le TGF-β j’ai type inhibiteur du récepteur A-83-01. En outre, ces SGIC expriment des protéines des jonctions lacunaires dont la connexine 43 et pièce contraction spontanée et transitoires de calcium. Cette amélioration de l’efficacité par rapport aux études antérieures de la reprogrammation démontre le potentiel de régénération CMs de populations de cellules endogènes qui restent dans le post infarctus.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6</td><td>Souris Charles River’s Laboratory</td><td>027</td><td>Pour l’isolement des cellules MEF</td></tr><tr><td>Platinum E (PE) Cell</td><td>Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>Pour la production de rétrovirus</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022. FS</td><td>Composant des milieux iCM, PE et de croissance</td></tr><tr><td>Milieu 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Composant du milieu iCM</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td>Composant du milieu iCM, PE et milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>Composant du milieu iCM</td></tr><tr><td>MEM Acides aminés essentiels, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>Composant de l’iCM Milieu</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium Solution, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>Composant du milieu iCM et pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels MEM, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Composant du milieu iCM</td></tr> Solution <tr><td>vitaminique MEM, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>Composant du milieu iCM</td></tr><tr><td>Insuline-Transferrine-Sélénium</td><td></td><td>Gibco 41400045</td><td>Composant du milieu iCM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Composant du milieu iCM</td></tr><tr><td>Péniciline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Composant du milieu iCM, PE et de croissance</td></tr><tr><td>GlutaMAX (supplément de L-glutamine)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Composant du milieu iCM, PE et de croissance</td></tr><tr><td>Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>Composant du milieu PE</td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Composant d’un milieu PE</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Pour détacher les cellules des boîtes de culture</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R& D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>Traiter les cellules pour inhiber la signalisation TGF-&bêta ; - favorise une reprogrammation à haute efficacité. Utilisation à 0,5 & micro ; M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>Pour la dilution et le stockage de l’A-83-01 et du composant du milieu de congélation</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>Pour l’enrobage des plats sur plaque MEF</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Opti-MEM Milieu sérique réduit</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Réactif</td></tr> <tr><td>de transfectionpBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenant un facteur de reprogrammation</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenant un facteur de reprogrammation</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenant un facteur de reprogrammation</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenant du facteur de reprogrammation</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>Plasmide contenant facteur de reprogrammation</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>Facteur de reprogrammation contenant un plasmide</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>Facteur de reprogrammation contenant du plasmide</td></tr><tr><td>Polybrène (bromure d’hexadiméthrine)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>Pour l’induction virale. Utilisation à une concentration de 6 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Filtre à vide + bouteilles (0,22 & micro ; m pores)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp ; 569-0020° nbsp ;</td><td>Pour les médias filtrants</td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Bd Vacutainer Labware&nbsp ;</td><td>309654</td><td>Pour la filtration virale</td></tr><tr><td>0,45 & micro ; m Filtres</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>Pour la filtration virale</td></tr><tr><td>70 & micro ; crépines à cellules m</td><td>Falcon&nbsp ;</td><td>352350</td><td>Pour l’isolement MEF et la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Solution</td><td>BD</td><td>554722</td><td>Pour la fixation et la perméabilisation de cellules pour la cytométrie en flux</td></tr> tampon <tr><td>perm/wash&nbsp ;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Pour le lavage des cellules pour la cytométrie</td></tr><tr><td>en flux DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>Pour le lavage des cellules</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>Pour la cytométrie en flux et l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre Sigma&nbsp ;</td><td></td><td>G9023</td><td>Pour bloquer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>Pour bloquer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Troponine de souris T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Souris &alpha ;-actinine</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 Cytométrie</td></tr><tr><td>en flux Rabbit Connexin 43</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Rabbit Troponine I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555, souris</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647, souris</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>Cytométrie en flux 1:200</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux ZE5 27 couleurs&nbsp ;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Pour FACS</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>Pour la fixation des cellules pour IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>Pour la perméabilisation des cellules pour IF</td></tr><tr><td>EVOS&trade ; Système d’imagerie couleur FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>pour IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>Pour l’imagerie</td></tr> <tr>calcique<td>glucose</td><td>sigma</td><td>G7528-250g</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma</td><td>H4034-500g</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Fluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>Pour les transitoires calciques de rupture dans les iCM - utilisation à 10 & micro; M</td></tr><tr><td>Isoprotérénol</td><td>sigma</td><td>I6504-1g</td><td>Pour augmenter le nombre de transitoires calciques dans les iCM - utilisation à 1-2 & micro ; M</td></tr><tr><td>Marianas Spinning Disk Microscope confocal</td><td>3i</td><td></td><td>Pour l’imagerie calcique</td></tr><tr><td>éthanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>eau de Javel</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes coniques</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 227261 <tr><td>15 mL Tubes coniques</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 188271 <tr><td>15 cm Boîtes de culture cellulaire</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire de 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>de 60 mm Plaques de culture</td> cellulaire <td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 6 puits</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 12 puits</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 24 puits</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les cardiomyocytes induites

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

TRANS-différenciation d’une cellule somatique type en un autre a un potentiel énorme à modéliser et à traiter des maladies humaines. Études antérieures ont montré que la souris embryonnaires, fibroblastes dermiques et cardiaques peuvent être reprogrammés dans fonctionnelles induites cardiomyocyte-cellules (SGIC) par le biais de la surexpression des facteurs cardiogénique transcription GATA4, Hand2, Mef2c, et Tbx5 in vitro et in vivo. Toutefois, ces études antérieures ont montré une efficacité relativement faible. Afin de rétablir la fonction cardiaque après une blessure, mécanismes qui régissent la reprogrammation cardiaque doivent être élucidés afin d’accroître l’efficacité et la maturation du SGCI.
Nous avons démontré précédemment que l’inhibition de la signalisation profibrotiques considérablement augmente l’efficacité de la reprogrammation. Nous détaillons ici, les méthodes pour atteindre une efficacité de reprogrammation de jusqu'à 60 %. En outre, nous décrire plusieurs méthodes dont la cytométrie en flux, imagerie par immunofluorescence et imagerie calcique pour quantifier l’efficacité et la maturation des fibroblastes reprogrammés reprogrammation. En utilisant le protocole détaillé ici, études mécanistes peuvent être menées pour déterminer les régulateurs positifs et négatifs de reprogrammation cardiaque. Ces études peuvent identifier des voies de signalisation qui peuvent être ciblés pour promouvoir la reprogrammation de l’efficacité et de maturation, ce qui pourrait mener à des thérapies nouvelles pour traiter les maladies du cœur humain.

À l’aide de la stratégie de reprogrammation décrite ci-dessus et dans la Figure 1 b, nous avons généré SGIC avec environ 70 % des cellules exprimant cardiaque troponine T et environ 55 % de cellules exprimant cardiaque α-actinine, quantifiée par cytométrie de flux à jour 9 suite à la transduction du GHMT2m (Figure 2 a et B). En outre, la majorité des cellules expriment cardiaque troponine T, troponine I et α-acti...

Nous présentons ici une méthode robuste pour reprogrammer les fibroblastes embryonnaires primaires dans les cardiomyocytes fonctionnelles par le biais de la surexpression de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) aux côtés de l’inhibition de la signalisation TGF-β. Notre protocole génère des cardiomyocytes raclée dès transduction après 7 jours avec jusqu'à 60 % efficacité.

Suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les Cardiomyocytes induites

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la reprogrammation cardiaque, telles que l’identification des voies favorisant ou réparant la cardiomyogenèse. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons générer des cardiomyocytes induits fonctionnels, avec une efficacité supérieure à celle des méthodes publiées précédemment. Ces cardiopathies chimiques entraînent une perte de cardiomyocytes et une altération de la fonction cardiaque.Par conséquent, cette technique peut aider à une réparation élevée, en convertissant les fibroblastes en cardiomyocytes induits fonctionnels. Pour commencer la production de rétrovirus, cultivez des cellules de platine E ou PE dans un milieu PE. Complétez-le avec des marqueurs de sélection dans un plat de 10 cm, dans une armoire de bio-sécurité de niveau deux.Tous les deux jours, les cellules passent, à un à quatre, ou à une à cinquième dilusion. Un jour avant la transfection prévue, ensemencez les cellules PE dans 10 ml de milieu de croissance, dans une boîte de culture de 10 cm, puis balancez doucement les boîtes d’avant en arrière. Placez soigneusement les plats dans un incubateur, pour permettre une répartition uniforme des cellules, et incubez pendant 24 heures.Le jour de la transfection, ajoutez le cocktail GHMT2M, dans un tube de 1,5 ML. Ajoutez ensuite 360 microlitres de sérum réduit dans un tube séparé de 1,5 ML. Par la suite, ajoutez 36 microlitres de réactif de transfection au milieu sérique réduit et agitez doucement le tube pour mélanger.Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Le réactif de transfection utilisé dans cette étape se lie au plastique. Pour éviter l’efficacité de la transfection, veillez à pipeter le réactif de transfection, directement dans le milieu sérique réduit, et évitez de toucher la pointe de la pipette à la paroi du tube.Ajoutez ensuite le mélange de réactifs de transfection de milieu sérique réduit dans le tube, contenant le cocktail d’ADN GHMT2M. Agitez doucement le tube pour mélanger et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Enfin, ajoutez le mélange de réaction de transfection goutte à goutte dans les cellules PE.Agitez doucement le plat pendant 10 à 15 secondes. Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius, pendant 16 à 20 heures. Maintenant, enduisez des plats de 60 mm de collagène et incubez à 37 degrés Celsius, pendant au moins deux heures.Ensuite, distribuez des fibroblastes embryonnaires de souris fraîchement décongelés, ou MEF, dans les plats enrobés de collagène. Et ajoutez du milieu de culture dans un volume final, de 4ML par plat de 60MM. Basculez doucement les plats et placez-les dans l’incubateur.Lors du placage de MEF, il est important que les cellules soient plaquées uniformément. Évitez de faire tourner la vaisselle, cela peut entraîner un placage inégal. Au lieu de cela, balancez doucement le plat d’avant en arrière et placez-le soigneusement dans l’incubateur.24 heures après la transfection des cellules PE, utilisez une seringue de 30 ml pour recueillir le milieu rétroviral généré par les cellules. Passez le premier prélèvement de milieu rétroviral à travers un filtre de 45 micromètres, dans un tube conique de 50 ML. Ajoutez ensuite 10 ml de milieu de croissance frais sur la paroi de la parabole, en prenant soin de ne pas déplacer les cellules PE.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant encore 24 heures. Ajoutez ensuite 7,2 microlitres de 10 mg par millilitre de réactif de transduction du bromure d’hexidine et de méthrine dans le tube conique de 50 ml contenant du surnageant viral. Maintenant, aspirez le milieu des MEF et ajoutez 4 ML du milieu rétroviral fraîchement récolté dans le plat.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. 48 heures après la transfection des cellules PE, prélever le milieu rétroviral et effectuer la transduction exactement de la même manière, que pour le premier prélèvement. Jetez les cellules PE après le deuxième prélèvement de milieu rétroviral et ajoutez 10 % d’eau de Javel à tous les matériaux en contact avec le milieu rétroviral.Après l’incubation, aspirez le milieu rétroviral des MEF et ajoutez 4ML de milieu ICM, contenant 05 micromolaires, inhibiteur du récepteur TGF Beta de type 1. Tous les deux jours, changez le support ICM, jusqu’à ce que vous l’utilisiez à nouveau. Pour commencer l’immunomarquage, aspirez le milieu ICM à partir du 14e jour MEF reprogrammés.Ensuite, lavez les cellules une fois avec 1 ML de PBS 1X glacé, par puits de la plaque à 12 puits. Ensuite, aspirez le PBS, ajoutez 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % pour fixer les cellules et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir aspiré le paraformaldéhyde, lavez les cellules trois fois avec 1ML de PBS.Après avoir aspiré le PBS, ajoutez 500 microlitres de 02 % Triton X 100 et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après l’aspiration de Triton X 100, bloquez les cellules avec 500 microlitres de sérum de cheval à 10 %, pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, aspirez le sérum de cheval et ajoutez 500 microlitres d’anticorps primaire dilué. Incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir aspiré l’anticorps primaire, laver trois fois avec 1 ml de PBS.Après le dernier lavage de PBS, ajoutez 500 microlitres d’anticorps secondaires dilués. Enveloppez l’assiette dans du papier d’aluminium et incubez dans l’obscurité, pendant une heure à température ambiante. Enfin, aspirez l’anticorps secondaire et lavez-le trois fois avec 1 ML de PBS.Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’imagerie soit terminée. Cette méthode montre une conversion à haut rendement des MEF en cardiomyocytes. Une analyse cytométrique en flux représentative, ajoutée au neuvième jour après la transduction, montre l’expression de la troponine T cardiaque activée, dans environ 70 % des cellules.De même, l’expression cardiaque de l’alpha-actinine est observée dans environ 55 % des cellules, par rapport au contrôle de la transduction de la GFP. De plus, l’immuno-coloration des marqueurs cardiaques, effectuée deux semaines après la transduction, montre que la majorité des cellules expriment la troponine I, l’alpha-actinine et la troponine T. La protéine de jonction lacunaire Cx43 a également été détectée le long de la périphérie des ICM. De plus, le co-marquage des ICM avec de l’alpha-actinine, ou de la troponine T et du Cx43, révèle la formation de jonctions lacunaires entre les cellules voisines.La transduction de GHMT2M et le traitement avec A83O1 reprogramment une fraction des MEF en cellules battantes au huitième jour. Le jour 11, environ 10000 cellules de battement par centimètre carré sont observées. Les transitoires calciques spontanés sont détectés dans les cardiomyocytes battants.L’ajout d’isoprotérénol, agoniste bêta-adrénergique, augmente considérablement la fréquence des transitoires calciques spontanés. En revanche, la sédition de la nifédipine, un inhibiteur des canaux calciques de type L, diminue considérablement la fréquence des transitoires calciques. Après avoir regardé cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la façon de reprogrammer les fibroblastes, en cardiomyocytes fonctionnels et induits avec une grande efficacité.En suivant ce protocole, d’autres méthodes, y compris le séquençage de l’ARN et le séquençage par puce, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que l’expression globale des gènes et le statut de la chromatine, sont modifiées lors de la reprogrammation cardiaque. N’oubliez pas que travailler avec des rétrovirus peut être dangereux. Des précautions, telles que le travail dans une enceinte de biosécurité de niveau deux, le port d’un équipement de protection individuelle et l’élimination appropriée de tous les déchets rétroviraux, doivent toujours être mises en œuvre lors de l’exécution de ce protocole.

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