Name: Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez une méthode simple et évolutive pour générer des progéniteurs cardiaques et des cardiomyocytes ventriculaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette technique utilise Activin A et la surexpression d'Id1 pour faciliter la recherche en biologie cardiaque.

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Nous remercions les membres du laboratoire Colas pour discussions utiles et critiques du manuscrit. Cette étude a été financée par le NIH/NIEHS R44ES023521-02 et CIRM DISC2-10110 accorde aux Dr Colas.

1. infection et préparation de Virus Id1
<ol><li>Générer des lentivirus sur-exprimant Id1 par transfection co pCMVDR8.74, pMD2.G et pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene : plasmide #107735) dans les cellules HEK293T. Recueillir des particules virales, filtrer, purifier du surnageant et stocker à-80 ° C comme Kitamura et al. (2003) 19. vous pouvez également produire Id1 lentivirus commercialement en envoyant pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR à un fournisseur produisant des lentivirus. ATTENTION : Veuillez suivre les consignes des gènes et des protocoles de fonctionnement standard. Note : IMPORTANT : titre virus optimale doit être au moins 108 à 109 Transducing unités/mL (TU/mL).</li>
	<li>Avant l’infection, enduire un puits d’une plaque 96 puits 50 µl de réactif de revêtement, généralement un mélange de protéines gélatineuse sécrété par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (voir Table des matières).</li>
	<li>Dissocier un puits de cultivé dans une plaque 6 puits en ajoutant 1 mL de PBS avec 0,5 mM EDTA et sans Ca2 + et Mg2 + des cellules souches pluripotentes. NOTE : Le temps de Dissociation varie de 3 à 10 min. Lorsque plus de 80 % des cellules sont détachés du fond de la plaque, passez à l’étape suivante.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire avec pipette stérile dans tube à centrifuger en plastique 15 mL.</li>
	<li>Neutraliser le réactif de dissociation avec 5 mL de PBS contenant Ca2 + et Mg2 +.</li>
	<li>Pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).</li>
	<li>Éliminer le surnageant et effleurer doucement le tube afin de déloger le culot.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de cellules souches médias.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisés suivant les instructions du vendeur.</li>
	<li>Cellules viables plaque 20 000 / enduit bien (plaque à 96 puits) dans 50 µL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK (voir tableaux 1 et 2).</li>
	<li>Après 24h, surveiller pour la fixation des cellules et de remplacer le support avec 100 µl cellules souches médias additionnés de 2 inhibiteur de voie de RHO/ROCK µM et le bromure de hexadimethrine 6 ng/mL (voir tableaux 1 et 2), 1 heure avant l’infection des gènes. Remarque : Les cellules doivent être fermement fixés au fond de la plaque.</li>
	<li>Décongeler l’Id1-lentivirus sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 3 µL de lentivirus purifiée par puits (titre de virus doit être comprise entre 108 à 109 TU/mL), puis transférer la plaque arrière d’incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2, 20 % O2).</li>
	<li>infection virale après 24 h, ajouter 100 µL de milieux frais souches cellulaires dans les cellules infectées.</li>
	<li>infection après des gènes de 48 h, remplacer les virus contenant les médias avec 200 µL de cellules fraîches de souches milieux supplémentés avec 1 puromycine µg/mL.</li>
	<li>Actualiser les médias tous les jours avec 200 µL de cellules souches milieux supplémentés avec 1 puromycine µg/mL.</li>
	<li>Quand les cultures atteignent 80 % confluence, dissocier les cellules à l’aide de 200 µL de PBS sans Ca2 + et Mg2 + + 0,5 mM EDTA (pour un puits d’une plaque de 96 puits).</li>
	<li>Recueillir suspension de cellules dans un tube à centrifuger.</li>
	<li>Neutraliser le réactif de dissociation avec 5 mL de PBS contenant Ca2 + et Mg2 +.</li>
	<li>Pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).</li>
	<li>Éliminer le surnageant et effleurer doucement le tube afin de déloger le culot.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.</li>
	<li>Toutes les cellules (1 mL) de transfert à un enduit bien d’une plaque de 12 puits.</li>
	<li>Après 24h, moniteur pour la fixation des cellules aux médias puits et remplacer avec 1 mL de cellules souches médias additionné d’inhibiteur de voie de RHO/ROCK 2 µM et bromure de hexadimethrine de 6 ng/mL, 1 heure avant la transduction.</li>
	<li>Décongeler l’Id1-lentivirus sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 5 µL de virus purifié par puits (plaque de 12 puits).</li>
	<li>infection après des gènes de 24h, remplacer les virus contenant les médias avec 1 mL de frais cellules souches milieux supplémentés avec 3 puromycine µg/mL.</li>
	<li>48 h après l’infection des gènes, remplacer le virus contenant des médias avec 1 mL de cellules fraîches de souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL.</li>
	<li>Quand les cultures atteignent 80 % confluence, dissocier les cellules à l’aide de 500 µL de PBS avec 0,5 mM EDTA et sans Ca2 + et Mg2 + (pour un puits d’une plaque de 12 puits).</li>
	<li>Transférer la moitié (250 µL) de la suspension cellulaire à un puits d’un réactif de revêtement enduit plaque 6 puits contenant 2 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.</li>
	<li>Utiliser l’autre moitié (250 µL) de l’échantillon pour l’extraction de l’ARN et qRT-PCR afin de déterminer l’Id1 LENTIVIRAUX médiée par les niveaux d’expression, comme Colas et al. (2012) 4. NOTE : IMPORTANT : si Id1 ARNm expression est inférieures à 0,005 pli GAPDH des niveaux d’expression (voir tableau 3 pour amorces qRT-PCR), répétez les processus d’infection comme décrit ci-dessus jusqu'à ce que les niveaux d’expression Id1 dépassent la seuil.</li>
</ol>2. hPSCs entretienId1
<ol><li>Culture hPSCsId1 dans enduit 6-plats et croître dans 3 mL par puits de cellules souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL.</li>
	<li>Quand hPSCsId1 atteignent 80 % confluence, les cellules comme agrégats (rapport de 1:6 split) utilisant le réactif de dissociation sans enzymes suivant directives du vendeur de passage et croître dans 3 mL par puits de cellules souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL.</li>
</ol>3. préparation des hPSCsId1 de différenciation
<ol><li>Recouvrir une plaque de 12 puits avec 500 µL / puits de réactif de revêtement.</li>
	<li>Lorsque hPSCsId1 atteignent 90 % confluence dissocient les cellules en ajoutant 1 mL de PBS avec 0,5 mM EDTA / puits et sans Ca2 + et Mg2 + pour 5 à 10 min. vérifier le processus de dissociation chaque minute, et une fois les 80 % des cellules sont dissociées de la plaque , passez à l’étape suivante.</li>
	<li>Recueillir suspension de cellules dans un tube à centrifuger.</li>
	<li>Neutraliser le réactif de dissociation avec 5 mL de PBS contenant Ca2 + et Mg2 +.</li>
	<li>Pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).</li>
	<li>Éliminer le surnageant et effleurer doucement le tube afin de déloger le culot.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 2 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.</li>
	<li>Cellules de plaque 300 000 / puits dans 1 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK et 6 µg/mL puromycine et plaque de transfert dans l’incubateur de culture de tissus.</li>
	<li>Actualiser les médias tous les jours avec 2 mL de cellules souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL cultures jusqu'à confluence de 90 %. Ouvrir à ce stade, la différenciation cardiaque (étape suivante).</li>
</ol>4. différenciation des hPSCsId1 en premier coeur comme champ progéniteurs cardiaques (FHF-L CPs)
<ol><li>Pour le format de la plaque de 12 puits, initier la différenciation (jour 0) en remplaçant les cellules souches médias avec 1,5 mL de médias d’induction (tableau 1) additionné l’activine A (100 ng/mL) (voir tableau 2 pour les volumes et l’activine A les concentrations recommandées pour plaque de différents formats).</li>
	<li>Jour 1 (24 h après que la différenciation est lancée), remplacer les médias avec 2 mL de médias d’induction sans activine A (/ puits d’une plaque de 12 puits).</li>
	<li>Le jour 3, remplacer les médias avec 2 mL de médias d’induction sans activine A (/ puits d’une plaque de 12 puits).</li>
	<li>Le jour 5, recueillir FHF-L CPs pour la cryoconservation (étape suivante). NOTE : IMPORTANT : Cryopreservation est préférable à ce stade, car elle permet de découpler la génération de progéniteurs cardiaques de myocytes cardiaques subséquentes production et biobanque importants lots de cellules. Notez que vous pouvez également jour 5 CPs FHF-L peut être passé à une plaque fraîchement enduite à la différenciation de continuer, s’il vous plaît se référer aux étapes 5.1 – 5,5 à passFHF-L CPs et passez à l’étape 6.5 de différenciation.</li>
</ol>5. cryoconservation du CPs FHF-L
<ol><li>Aspirez tous les médias de puits contenant des J5 FHF-L CPs et rapidement ajouter 1 mL de tiède (37 ° C) 1 x réactif de dissociation enzymatique contenant (voir Table des matières). Placer la plaque dans l’incubateur de culture de tissus.</li>
	<li>Après 1 min, secouer la plaque côté à l’autre dans l’incubateur.</li>
	<li>Après 2 min (temps total), retirer la plaque de l’incubateur et ajouter 1 mL de médias FBS de 10 %.</li>
	<li>Doucement pipette cellules de haut en bas avec une pipette de 5 mL pour faciliter le détachement des cellules de la plaque.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire à une centrifugeuse tube granules des cellules et par centrifugation à 200 x g pendant 3 min</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 2 mL de réactif de cryoconservation.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.</li>
	<li>Ajouter le réactif de cryoconservation (voir Table des matières) à un volume suffisant de cryopréserver des cellules à la concentration désirée (en général 5 à 10 x 106 cellules/mL).</li>
	<li>Cellules de transfert pour les flacons de cryoconservation et placer les flacons dans ventilation tangentielle (1 ° C/min) et placer le dispositif de refroidissement dans le congélateur-80 ° C du jour au lendemain.</li>
	<li>Après 24h, transfert des flacons congelés à l’azote liquide pour le stockage à long terme. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.</li>
</ol>6. FHF-L CP différenciation dans les Cardiomyocytes ventriculaires-like
<ol><li>Transfert flacons FHF-L CPs congelés J5 de stockage d’azote liquide dans le récipient de glace sèche.</li>
	<li>Placer les flacons dans le bain-marie à 37 ° C pendant 2 à 3 min, jusqu'à ce que la suspension cellulaire est complètement décongelée. NOTE : IMPORTANT : la décongélation est sensible au temps. Exposer les médias de la cryoconservation des cellules pour une quantité excessive de temps (c.-à-d., 10 min) diminue la viabilité des cellules.</li>
	<li>Cellules de transfert de 15 ou 50 mL tube à centrifuger, selon le nombre de flacons décongelés.</li>
	<li>Verser goutte à goutte (5 gouttes toutes les 30 secondes) cardiogénique préchauffé (37 ° C) médias (tableau 1) à la solution de la cellule. Continuez ce processus jusqu'à ce qu’un média de cryoconservation de 1:3 : ratio de médias cardiogénique est atteint. À ce stade, augmenter le taux d’addition de médias cardiogénique jusqu'à un 01:10 médias de cryoconservation : ratio de médias cardiogénique est atteint. NOTE : IMPORTANT : les changements rapides d’osmolarité augmentera la mort cellulaire durant la décongélation ; Ajouter goutte à goutte cardiogénique médias tel que décrit ci-dessus est donc fortement recommandé.</li>
	<li>Centrifuger suspension et pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).</li>
	<li>Éliminer le surnageant et effleurer doucement tube à centrifuger pour déloger le culot cellulaire.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules avec cardiogénique milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK. Remarque : La viabilité cellulaire peut varier de dégel de dégel et, en général, > 65 % viabilité prédit placage bonne efficacité.</li>
	<li>Diluer concentrée suspension cellulaire avec cardiogénique milieux supplémentés avec 2 inhibiteur de la voie µM RHO/ROCK pour obtenir la concentration de la cellule souhaitée pour le placage (voir le tableau 2 pour les formats de plaque différente). NOTE : IMPORTANT : Notez que l’efficacité de différenciation cardiaques peut refuser si les cellules sont ensemencées trop faiblement.</li>
	<li>Cellules de semence sur la plaque.</li>
	<li>Maintenir la plaque dans la hotte de vitroplants pendant 20 min avant de transférer à l’incubateur de culture de tissus.</li>
	<li>Jour 6 de différenciation, contrôler la fixation des cellules. Remarque : Les progéniteurs cardiaques sont cryoconservés jour 5 de la différenciation. 24h après décongélation des cellules serait le jour 6 de la différenciation. Remarque : La présence de flottants (mortes) est fréquente.</li>
	<li>Jour 7, aspirer 50 % des médias et remplacer par une quantité égale de supports cardiogénique neufs. Remarque : L’ajout de l’inhibiteur voie RHO/ROCK aux médias cardiogénique n’est pas nécessaire après ce point.</li>
	<li>Remplacez 50 % des médias par cardiogénique médias tous les deux jours.</li>
	<li>Remarque spontanée battant qui apparaît entre 11 et 13 de jour.</li>
	<li>Le 15e jour, quantifier l’efficacité cardiaque différenciation par immunofluorescence à l’aide de DAPI (tache de noyau) et ACTC1 (pan-cardiaque marqueur).</li>
</ol>7. transfert et Maintenance des Cardiomyocytes ventriculaires-like
Remarque : Par jour 14 – 16, une monocouche de contracter spontanément des cardiomyocytes ventriculaires semblable devrait être obtenue. À ce stade, il est suggéré de se dissocier et re-plaque de cardiomyocytes afin d’homogénéiser la culture et empêcher les cellules de détacher de la plaque.
<ol><li>Aspirer tous les médias de puits et rapidement ajouter 1 mL de pré chauffé (37 ° C) 1 x enzyme contenant des réactifs de dissociation. Remarque : 1 x volumes de réactifs contenant des enzymes dissociation varient en fonction du format de la plaque, mais doit couvrir complètement le fond de la surface du bien.</li>
	<li>Plaque de transfert dans un incubateur de culture de tissus.</li>
	<li>Secouer doucement plaque côté à l’autre toutes les 2 min à l’intérieur de l’incubateur pour accélérer le processus de détachement.</li>
	<li>Après 5 à 15 min, lorsque 80 à 100 % des cellules sont détachés du fond de la plaque, retirez la plaque de l’incubateur et inhiber 1 x activité de réactif de dissociation enzymatique contenant en ajoutant un volume égal de médias FBS de 10 %. NOTE : Temps d’Incubation avec dissociation d’enzyme contenant x 1 pour ce processus changeront de lot à lot.</li>
	<li>Recueillir des suspension de cellules dans un tube à centrifuger.</li>
	<li>Suspension cellulaire se mêlent pipette et nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.</li>
	<li>Diluer la suspension cellulaire à concentration cellulaire désiré (voir tableau 2 pour les formats de plaque différente) avec les médias de maintenance complétée avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.</li>
	<li>Après l’ensemencement des cardiomyocytes dans l’assiette, répartir les cellules et permettre les cellules attacher pendant 10 à 20 min avant de transférer la plaque à l’incubateur de culture de tissus.</li>
	<li>24h après modification des plaques, surveiller la récupération et fixation des cellules. Remarque : La présence de flottants (mortes) est fréquente. 48 à 72 h après modification des plaques, cardiomyocyte devrait reprendre la contraction spontanée.</li>
	<li>Afin de maintenir la culture cardiomyocyte, remplacez 50 % des médias avec les médias d’entretien tous les deux jours jusqu'à l’utilisation des cardiomyocytes ventriculaires-comme pour les expériences ultérieures.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour les différenciations réussies, assurez-vous de suivre attentivement les instructions indiquées ci-dessus. En outre, ici nous mettons en évidence les paramètres clés qui influencent les résultats de la différenciation. Avant de commencer une différenciation, les trois paramètres morphologiques suivantes doivent être respectées : une morphologie de la tige de hPSCsId1, un compactage cellulaire élevé et une confluence élevée (> 90 %) de la culture au jour 0. À cet égard, des conditions optimales de différenc...

Production à grande échelle des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs)-dérivées de cellules souches cardiaques et les cardiomyocytes est une condition sine qua non pour les thérapies basées sur les cellules souches1, modélisation2,3 et la caractérisation rapide de la maladie nouvelles voies réglementant la différenciation cardiaque4,5,6 et physiologie7,8. Bien qu’un certain nombre d’études9,10,11,12,13,14,,,15 ont décrits précédemment très efficace protocoles de différenciation cardiaques de hPSCs, aucune a abordé l’origine domaine de cœur des cardiomyocytes qui en résulte, en dépit de l’identification des importantes différences moléculaires entre gauche (premier champ du coeur) et droite (second champ de coeur) cardiomyocytes ventriculaires16 et l’existence de maladies cardiaques congénitales par coeur domaine spécifique ; c'est-à-dire, hypoplasie du coeur gauche syndrome17 ou arythmogène dysplasie ventriculaire droite18. Ainsi, la génération des progéniteurs cardiaques et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur de hPSCs devient une nécessité afin d’augmenter leur pertinence en tant que thérapeutique et outils de modélisation de la maladie.
Ce protocole repose sur la surexpression constitutive ID1, récemment identifié5 premier cœur en spécifiant le champ repère qui, en combinaison avec l’activine A, est nécessaire et suffisante pour initier cardiogenesis dans hPSCs. Notamment, Cunningham et al. (2017) 5 démontrent que les progéniteurs induite par l’Id1 spécifiquement premier champ de cœur (HCN4, TBX5) mais pas second marqueurs de champ de cœur (SIX2, ISL1) car ils subissent une différenciation cardiaque. En outre, les auteurs montrent également que des embryons de souris transgéniques dépourvus de toute la famille de gènes (Id1-4), de Id développe sans former premier cœur champ cardiaque progéniteurs, en plus des progéniteurs cardiaques médial et postérieur ( deuxième champ de cœur) peut encore former, ce qui laisse croire que les protéines Id sont essentiels d’initier une première heart champ cardiogenesis in vivo. Idéalement, les progéniteurs induite par l’Id1 peut être cryoconservés et spontanément se différencient en cardiomyocytes ventriculaires-comme caractéristiques, notamment de l’expression des marqueurs spécifiques ventriculaire (IRX4, MYL2) et potentiels d’action ventriculaire-like.
Nous décrivons ici une méthode simple et évolutive pour générer des premier cœur comme champ (FHF-L) cardiaques progéniteurs et cardiomyocytes ventriculaires ressemblant de Id1 sur-exprimant hPSCs. Une caractéristique importante de ce protocole est la possibilité de découpler la génération de progéniteurs cardiaques du cardiomyocyte ultérieures de production utilisant une étape pratique de cryoconservation. En résumé, ce protocole détaille les étapes nécessaires pour (1) générer Id1-surexprimant hPSCs, (2) générer des cellules souches cardiaques FHF-L de hPSCs, (3) cryoconservé progéniteurs qui en résulte et (4) reprendre la différenciation des progéniteurs cardiaques FHF-L et générer hautement enrichi (> 70 – 90 %) battant cardiomyocytes ventriculaires-like.

<table><tbody><tr><td>Anticorps ACTC1</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique Antimycosique (Anti-Anti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>supplément B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>supplément B27 sans insuline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27 sans vitamine A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CDH5</td><td>R& D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7930</td><td>Réactif de cryoconservation</td></tr><tr><td>DMEM high Glucose</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS avec Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt membrane potential kit&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, veuillez vous référer à McKeithan et al. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Coating reactive</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>media kit Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp ;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>Réactif de dissociation sans enzyme</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps TAGLN</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72254</td><td>Inhibiteur de la voie RHO/ROCK</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X réactif de dissociation contenant</td></tr><tr><td>des enzymes Tyrodes sachets de mélange de solution&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td> <td>(Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, veuillez consulter McKeithan et al. 2017)</td></tr></tbody></table>

génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

La génération de grandes quantités de pluripotentes humaines fonctionnels dérivés de cellules souches cardiaques progéniteurs et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur est une condition sine qua non pour la modélisation de la maladie et les thérapies cellulaires cardiaques. Nous avons récemment démontré que les gènes Id sont à la fois nécessaire et suffisante pour spécifier la premières progéniteurs de champ de cœur au cours du développement des vertébrés. Ce protocole de différenciation s’appuie sur ces constatations et utilise Id1 surexpression en combinaison avec l’activine A comme puissants repères indiquant pour produire des progéniteurs de (FHF-L) premiers cœur comme champ. Ce qui est important, résultant des progéniteurs différencient efficacement (~ 70 – 90 %) dans les cardiomyocytes ventriculaires ressemblant. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour 1) générer Id1-surexprimant hPSCs et 2) se différencient des quantités évolutives des progéniteurs de FHF-L cryopreservable et des cardiomyocytes ventriculaires ressemblant.

Génération de hPSCs ID1 lignes hPSCs sont infectés par un lentivirus médiation surexpression Id1 (Figure 1A). Une fois que hPSCId1 sont générés, expression du transgène est quantifiée par qRT-PCR (Figure 1B). HPSC uniquement les lignes deId1 exprimant Id1 ARNm à des concentrations supérieures à 0,005 p...

Nous décrivons ici une méthode évolutive, en utilisant une combinaison simple d’activine A et induite par le lentivirus Id1-surexpression, pour générer des premiers progéniteurs cardiaques de coeur comme champ et cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines.

Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Le principal avantage de cette technique simple est de générer des progéniteurs cardiaques et des cardiomyocytes d’origine et de sous-types de champ cardiaque définis. À leur tour, les cellules résultantes peuvent être utilisées pour un large éventail d’applications de recherche, y compris la biologie du développement de base, la thérapie cellulaire de preuve de concept et les études de modélisation des maladies cardiaques. Sean Spiering et Michael Yu de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, enduire suffisamment de puits d’une plaque de 96 puits avec 50 microlitres de réactif d’enrobage pour permettre les étapes ultérieures d’ensemencement cellulaire et d’infection virale, puis ajouter un millilitre de réactif de dissociation à un puits dans la plaque à six puits pour détacher les cellules souches pluripotentes ensemencées. Ensuite, à l’aide d’une pipette stérile, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger en plastique de 15 millilitres. Dans le tube, ajoutez cinq millilitres de PBS contenant du calcium et du magnésium pour neutraliser le réactif de dissociation.Ensuite, centrifugez les cellules à 200 fois g pendant trois minutes. Après la centrifugation, jetez le surnageant, puis agitez doucement le tube pour que la pastille soit délogée. Dissoudre ensuite la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de cellules souches.Ensuite, utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter le nombre de cellules. Une fois le comptage terminé, ensemencez 20 000 cellules viables dans chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant 50 microlitres de milieu de cellules souches complété par un inhibiteur de la voie RHO/ROCK à deux micromolaires. Après 24 heures, surveillez l’attachement des cellules, puis remplacez le milieu par 100 microlitres de milieu de cellules souches une heure avant l’infection lentivirale.Ensuite, décongelez le lentivirus Id1 sur de la glace, puis ajoutez trois microlitres de lentivirus purifié par puits. Après avoir ajouté le lentivirus, transférez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. 24 heures après l’infection virale, ajoutez 100 microlitres de milieu de cellules souches fraîches aux cellules infectées.Après 48 heures, remplacez le milieu contenant le virus par 200 microlitres de milieu de cellules souches fraîches complété par un microgramme par millilitre de puromycine. Chaque jour, continuez à changer le milieu avec 200 microlitres de milieu de cellules souches frais complétés par un microgramme par millilitre de puromycine. Démarrez le processus de différenciation le jour 0 en remplaçant le milieu de cellules souches par 1,5 millilitres de milieu d’induction avec de l’Activine A dans une plaque à 12 puits.24 heures après le début de la différenciation, remplacer le milieu par deux millilitres de milieu d’induction sans Activine A.Le troisième jour, remplacer par deux millilitres de milieu d’induction sans Activine A.Le cinquième jour, aspirer tout le milieu du puits contenant les CP FHF-L, puis ajouter immédiatement un millilitre de réactif de dissociation chaud contenant des enzymes dans le puits, incubez ensuite la plaque de culture à 37 degrés Celsius. Au bout d’une minute, secouez la plaque à l’intérieur de l’incubateur et retirez-la de l’incubateur après deux minutes, puis ajoutez un millilitre de milieu contenant 10 % de sérum bovin fœtal dans le puits. Détachez les cellules de la plaque en les pipetant doucement de haut en bas.Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et soumettez-la à la centrifugation. Après la centrifugation, dissolvez la pastille cellulaire dans deux millilitres de réactif de cryoconservation, puis comptez le nombre de cellules. Transférez ensuite les cellules dans les flacons de cryoconservation et laissez les flacons dans le dispositif de refroidissement.Transférez ensuite l’appareil à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Après 24 heures, transférez les flacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Juste avant de décongeler les CP FHF-L, enduire les puits de la plaque à 12 puits avec deux millilitres de réactif de revêtement.Ensuite, transférez les CP FHF-L de cinq jours de l’azote liquide dans un récipient de glace sèche. À partir de la glace sèche, transférez le flacon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux minutes pour assurer une décongélation complète. Une fois les cellules complètement décongelées, transférez-les dans un tube à centrifuger, puis pipetez 10 gouttes de milieu cardiogénique préchauffé toutes les 30 secondes dans la solution cellulaire.Continuez à ajouter le milieu cardiogénique jusqu’à ce que le rapport entre la cryoconservation et le milieu cardiogénique atteignent un à trois. Ensuite, soumettez les cellules à la centrifugation. Après la centrifugation, retirez le surnageant et effleurez soigneusement le tube, puis dissolvez la pastille cellulaire dans un milieu cardiogénique complété par un inhibiteur de la voie RHO/ROCk à deux micromolaires.Diluez davantage la suspension cellulaire avec un milieu cardiogénique pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée. Ensuite, ensemencez les cellules sur la plaque de culture contenant deux millilitres de milieu cardiogène. Laissez la plaque dans le capot de culture tissulaire pendant 20 minutes avant de la transférer dans l’incubateur.Surveillez l’attachement cellulaire au sixième jour de la différenciation. Le septième jour, aspirez la moitié du milieu cardiogénique et remplacez-la par un milieu frais. À partir de maintenant, remplacez 50 % du milieu cardiogénique tous les deux jours, puis, le 15e jour, quantifiez la différenciation cardiaque.Ici, le niveau d’expression de l’ARNm Id1 est quantifié dans les lignées cellulaires hESC et hPSC. Seules les lignées hPSC exprimant l’ARNm Id1 à des niveaux supérieurs à 0,005 fois GAPDH sont utilisées pour la différenciation. Voici des images en fond clair post-différenciation des hPSC optimales, sous-confluentes et sur-confluentes au jour 0.Lors d’une différenciation plus poussée, la confluence cellulaire atteint 75 % après 24 heures. Au jour 3, les cellules en différenciation forment un cluster et, au jour 5, les cellules restent en groupes étroitement connectés avec une morphologie homogène. Au jour 6, les PC FHF-L couvrent plus de 90 % de la surface des puits.En fait, au 12e jour, les cardiomyocytes commencent à battre et à afficher des contractions cardiaques. Plus loin dans le processus de différenciation, il y a une augmentation des niveaux d’expression de l’ARNm de MYL2 et IRX4 après le 15e jour. Les deux protéines représentent des marqueurs spécifiques du ventricule dans les cardiomyocytes.Ici, la trace du potentiel d’action représente les vitesses rapides de montée et de descente ainsi que le plateau ventriculaire. Ces taux étaient caractéristiques des cardiomyocytes de type ventriculaire au jour 25 de la différenciation. En résumé, il faut environ deux semaines pour générer des cellules souches pluripotentes humaines surexprimant Id1, puis il faut environ cinq jours pour générer les premiers progéniteurs semblables à un champ cardiaque et environ 10 jours pour générer des cardiomyocytes de type ventriculaire.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

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