Name: Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez la localisation multicolore de protéines membranaires uniques dans les organites de cellules mammifères vivantes. Cette méthode atteint une précision d'environ 18 nm pour étudier la dynamique protéique.

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Les auteurs aimeraient remercier le groupe de biophysique et Jacob Piehler à l’Université d’Osnabrück pour un soutien continu, Wladislaw Kohl pour assistance technique et la préparation du matériel et le Conseil de CellNanOs pour fournir des microscopes pour utilisation. Le projet a été financé par la 944 SFB.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences ">https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences </a> (2016).</li>
<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
<li>Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+mobility+in+mitochondrial+membranes+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Graham, F. L., van der Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52 (2), 456-467 (1973).</li>
<li>Wedeking, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+Controlled+Reorganization+of+Signaling+Complexes+in+the+Plasma+Membrane+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells.</a> Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).</li>
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<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth1171">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159).</a> Nature Methods. 5 (5), 455(2008).</li>
<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, une technique pour la localisation seule molécule bicolore des protéines membranaires mobile a été présentée. Suivant le protocole, les protéines membranaires sont fondues à étiquetage automatique des protéines qui réagissent avec les colorants rhodamine TMR et SiR conjugué à leurs substrats respectifs. Rhodamine dyes sont lumineuse et photostable et permettent ainsi répétitifs d’imagerie1. Pour une performance réussie, plusieurs conditions et des sujets critiques doivent garder à l’esprit.</...

Le but du présent protocole est de fournir une méthode d’imagerie pour localiser et suivre les protéines de la membrane unique à l’intérieur des cellules vivantes. Nous appelons cette méthode de suivi et de localisation microscopie (TALM)1,2. Comme la microscopie de Reconstruction optique stochastique (tempête)3 et la microscopie de Fluorescence Photoactivation localisation ((F) PALM)4,5, TALM est une technique de localisation unique axée sur la molécule de fluorescence. Toutefois, il est distinct de la manière que la mobilité des protéines de la membrane en combinaison avec l’imagerie répétitive du même étiqueté molécule à différentes positions révèle le microcompartiment qui est accessible pour la protéine mobile. En d’autres termes, les localisations possibles de la protéine sont définies par l’architecture de l’organite et par la mobilité de la protéine1. La méthode est complémentaire à divers autres super-résolution techniques6,7,8 , parce qu’il révèle la localisation et la trajectoire des cartes par des protéines d’imagerie mobiles. L’étiquetage est basé sur l’utilisation des protéines de fusion génétiquement modifiées qui sont en soi non fluorescent. Ces protéines de fusion sont étiquetage automatique d’enzymes qui réagissent de façon covalente avec un substrat conjugué à un colorant. Cette procédure a l’avantage que le degré d’étiquetage peut être contrôlées par la quantité de substrat ajouté. En outre, il permet de varier la couleur de la fluorescence, selon le colorant choisi conjugué. Plusieurs étiquettes enzyme étiquetage automatique sont disponibles9. Un autre avantage d’utiliser l’étiquetage automatique des balises enzyme est, que les colorants conjugués sont généralement plus stable et plus brillante que protéines fluorescentes1 et protéines individuelles par conséquent peuvent être enregistrés plus et plus précisément jusqu'à ce qu’ils sont blanchis. Cela permet l’enregistrement des trajectoires des protéines mobiles et l’extraction des coefficients de diffusion10,11.
Ici, nous avons démontré la faisabilité de TALM avec des protéines de la membrane mitochondriale, mais il peut aussi être appliqué aux autres protéines de la membrane intra - et extra-cellulaires, y compris les cellules différents types12,13. Nous montrons que multi-couleur TALM plus permet la distinction simultanée des protéines dans différents sous-compartiments en complémentation existants Super-résolution fluorescence microscopy techniques14,15, 16. TALM est compatible avec17d’imagerie de cellules vivantes. La photo-physique des rhodamines choisis tétraméthylrhodamine (TMR) et silicium-Rhodamien (SiR), en particulier leur luminosité et leur stabilité, permet aux protéines de la membrane unique record sur plusieurs périodes de fourniture de cartes de localisation (et trajectoire). Cependant, TALM est limitée pour la localisation des protéines solubles avec les coefficients de diffusion élevée car le flou est trop élevé et les photons recueillis par image sont trop faibles pour la localisation correcte. En outre, TALM nécessite moins d’énergie que par exemple tempête ou émission de stimulé l’appauvrissement (STED) microscopie6,7, excitation réduisant effets phototoxiques. C’est important, car le stress phototoxique affecte souvent morphologie organellar18 et, partant, mobilité analyse19. En somme, nous présentons TALM multicolore dans les cellules vivantes comme une technique qui comble une lacune entre les méthodes de microscopie de localisation STORM/STED/PALM (F) et les techniques qui analysent la mobilité des protéines telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)20 ,21, corrélation de fluorescence spectroscopy (FCS)22et fluorescence croisent corrélation spectroscopie (SCCC)11,23.

<table><tbody><tr><td>(Acide 2-(4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl)-éthanesulfonique, 1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1 : séparateur de faisceau dichoïde&nbsp ;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2 : Miroir polychronique, séparateur de faisceau</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>discontinué</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute ; s Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x (sans Ca & Mg)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>Earle&acute ; MEM sans rouge de phénol, sans L-Glutamine et sans NaHCO3 contenant 1 % de FBS, 0,1 % d’HEPES, 0,1 % de NEAA, 0,1 % d’Alanyl-L-Glutamine et 34,78 % d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3 0,75g/l)</td><td></td><td></td><td>Médium d’imagerie</td></tr><tr><td>Earle&acute ; s milieu essentiel minimum (MEM) avec rouge de phénol, contenant 1 % de sérum de veau fœtal supérieur (FBS), 0,1 % d’HEPES (acide 2-(4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl)-éthanesulfonique, 1 M) et 0,1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td></td><td></td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>EF : Filtre d’émission quadbandpass</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>Caméra EMCCD</td></tr><tr><td>Filtre d’émission Cubes de filtre QuadView, orange</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637 passe-bande</td><td>582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Filtre d’émission Cubes de filtre QuadView, bande passante Chroma</td><td></td><td></td> rouge <td>655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal) supérieur</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Perles fluorescentes : TetraSpeck&trade ; Microsphères, 0,1 & micro ; m, bleu fluorescent / vert / orange / rouge foncé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>microsphères fluorescentes</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>cellules HeLa&nbsp ;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Cellules de carcinome cervical de la patiente Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Cellules Hela CI ::p aGFP, stable</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellules Hela CV g ::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellules Hela Tom20 ::Halo7-Tag, stable</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Séparateur d’images</td><td>Photometrics</td><td>Dual-View QV2</td><td>séparateur d’image</td></tr><tr><td>émission Logiciel de traitement d’image&nbsp ;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>freeware</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence inversée</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm</td></tr><tr><td>émission Laser 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm émission</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>version R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM avec solution saline équilibrée Earle’s 2,2 g/L de NaHCO3, glutamine stable sans PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM avec solution saline équilibrée Earle’s avec 2,2 g/L de NaHCO3, glutamine stable, Phenolred</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg ; Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>colorant</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg ; Vert FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>colorant</td></tr><tr><td>Polarisation optique multimode maintien fibre monomode</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp ;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml ; Revêtement de</td><td>lamelle</td>de bingen <td></td></tr> acides <tr><td>aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (polyéthylène glycol) 10 %</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art No. 0263.1</td><td>revêtement de lamelle</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pour l’expression de PINK1-Halo7-Tag</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (1,2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>N° de cat. N°P9155</td><td>revêtement de lamelle</td></tr><tr><td>RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>Système de carottage Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>revêtement de lamelle / Motif de récepteur Intergrin</td></tr><tr><td>Silicone Rhodamine lié à HaloTag&reg ;-Ligand (SiRHTL)&nbsp ;</td><td>don personnel de Kai Johnson</td><td></td><td>dye</td></tr><tr><td>Software analysis plugin</td><td>auto-écrit C. P. Richter, Biophysik Osnabr&uuml ; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine / SNAP-Cell&reg ; TMR-Star lié à SNAP-Ligand (TMRstar)&nbsp ;</td><td>Biolab de la Nouvelle-Angleterre&reg ;</td><td>Colorant S9105S</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine liée à HaloTag&reg ;-Ligand (TMRHTL)&nbsp ;</td><td>Condenseur</td>TIRF à colorant <td>Promega</td><td>G8251</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO System</td><td>Condenseur TIRF</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle de microscope</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif TIRF Objectif à</td> huile <td>Olympus</td><td>150x (N.A. 1.45 ; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Eau H2O 99,5 % Rotipuran&reg ; Faible bio&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art. Non. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie multicolore localisation des protéines de la membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Connaissance de la localisation des protéines cellulaires sous-compartiments est crucial de comprendre leur fonction spécifique. Nous présentons ici une technique de Super-résolution qui permet pour la détermination de la microcompartments qui sont accessibles pour les protéines en générant la localisation et le suivi des cartes de ces protéines. En outre, par microscopie de localisation multi-color, la localisation et le suivi des profils des protéines dans différents sous-compartiments sont obtenus simultanément. La technique est spécifique pour les cellules vivantes et est basée sur l’imagerie répétitive des protéines membranaires mobile unique. Protéines d’intérêt sont génétiquement fusionnées avec des tags auto étiquetage spécifiques, ce que l'on appelle. Ces balises sont des enzymes qui réagissent avec un substrat de manière covalente. Conjugué à ces substrats sont des colorants fluorescents. Réaction des protéines enzymatiques-tag avec la fluorescence étiqueté résultats de substrats en protéines marquées. Ici, tétraméthylrhodamine (TMR) et silicium Rhodamine (SiR) sont utilisés comme colorants fluorescents attachés aux substrats des enzymes. En utilisant des concentrations de substrat dans la MP à éventail nM, Sub stoechiométrique d’étiquetage est réalisé qui se traduit par des signaux distincts. Ces signaux est localisés avec ~ 15 – 27 précision nm. La technique permet d’imagerie multicolore de molécules simples, auquel cas le nombre de couleurs est limité par les colorants disponibles membrane perméable et le répertoire de l’étiquetage automatique des enzymes. Nous montrer la faisabilité de la technique de déterminer la localisation de l’enzyme de contrôle de la qualité (Pten)-induite par la kinase 1 (PINK1) dans différents compartiments mitochondriales au cours de son traitement par rapport à d’autres protéines de la membrane. Le critère de véritables interactions physiques entre les protéines simples différemment étiquetées par seule molécule frette ou suivi Co est limité, cependant, parce que les degrés d’étiquetage faibles réduisent la probabilité d’avoir deux protéines adjacentes marquées en même temps. Alors que la technique est forte pour l’imagerie des protéines dans les compartiments de la membrane, dans la plupart des cas il n’est pas appropriée pour déterminer la localisation des protéines solubles très mobiles.

Analyse de l’imagerie et la colocalisation multicolore peut aider à déterminer la localisation sup-organites des protéines. Nous l’a démontré plus haut avec la phosphatase cytosolique et tensine homologue, PINK1, qui a différents endroits sub-mitochondriale en raison de son traitement par les protéases mitochondrial17. PINK1 est un facteur important de garantir la fonctionnalité mitochondriale34,35. Pour dé...

Nous présentons ici un protocole pour la localisation multi-couleur des protéines membranaires unique dans les organites des cellules vivantes. Pour fixer les fluorophores, étiquetage des protéines sont utilisées. Protéines, situés dans des compartiments de différentes membranes de l’organite même, peuvent être localisées avec une précision d’environ 18 nm.

Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Cette technique peut répondre à des questions clés dans les processus de régulation, tels que le rôle que jouent la dynamique et l’organisation des protéines dans l’adaptation fonctionnelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée dans des cellules vivantes, révélant ainsi la dynamique des protéines au niveau de la molécule unique. Bien que cette méthode ait été mise en œuvre à l’origine pour fournir des informations sur l’organisation spatio-temporelle des protéines membranaires mitochondriales, elle peut également être appliquée à d’autres organites et à d’autres protéines membranaires.La démonstration de la technique sera faite par Timo Appelhans, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Après la transfection et la préparation des échantillons de cellules et du microscope selon le protocole de texte, montez l’échantillon préparé avec des billes fluorescentes dans le porte-échantillon entre l’anneau en PTFE et l’anneau en caoutchouc rouge. Démarrez le microscope, tous les composants matériels et tous les logiciels nécessaires à la microscopie.Utilisez un mouchoir frais non pelucheux vaporisé d’isopropanol pour nettoyer la lentille de l’objectif et l

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JoVE Journal

Biology

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Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

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Imagerie multicolore simultanée de structures biologiques avec microscopie de localisation par photoactivation de fluorescence

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Découvrez la localisation multicolore de protéines membranaires uniques dans les organites de cellules mammifères vivantes. Cette méthode atteint une précision d'environ 18 nm pour étudier la dynamique protéique.

Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants

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