Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants

Cette technique peut répondre à des questions clés dans les processus de régulation, tels que le rôle que jouent la dynamique et l’organisation des protéines dans l’adaptation fonctionnelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée dans des cellules vivantes, révélant ainsi la dynamique des protéines au niveau de la molécule unique. Bien que cette méthode ait été mise en œuvre à l’origine pour fournir des informations sur l’organisation spatio-temporelle des protéines membranaires mitochondriales, elle peut également être appliquée à d’autres organites et à d’autres protéines membranaires.

La démonstration de la technique sera faite par Timo Appelhans, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Après la transfection et la préparation des échantillons de cellules et du microscope selon le protocole de texte, montez l’échantillon préparé avec des billes fluorescentes dans le porte-échantillon entre l’anneau en PTFE et l’anneau en caoutchouc rouge. Démarrez le microscope, tous les composants matériels et tous les logiciels nécessaires à la microscopie.

Utilisez un mouchoir frais non pelucheux vaporisé d’isopropanol pour nettoyer la lentille de l’objectif et le bas de la lamelle. Placez ensuite une gouttelette d’huile d’immersion sur la pupille de la lentille de l’objectif. Ensuite, placez le porte-échantillon avec l’échantillon de bille sur la platine du microscope de sorte que le bas de la lamelle entre en contact avec l’huile.

Ensuite, concentrez-vous sur les billes à l’aide d’une lumière de transmission ou d’une ligne laser. Ajustez la puissance des deux lasers d’excitation pour obtenir une densité de signal similaire dans les deux canaux de fluorescence. Recherchez ensuite une zone avec de nombreux signaux fluorescents distincts.

Générez une vue fusionnée des canaux fluorescents à l’aide du logiciel de contrôle de la caméra. Ensuite, utilisez les vis du séparateur d’image pour incliner manuellement le séparateur d’image optique interne afin d’obtenir la meilleure superposition des signaux des deux canaux fluorescents. Démarrez le logiciel de contrôle du microscope TIRF et choisissez d’afficher les canaux individuels en mode de diffusion en direct.

Prenez une image instantanée, excitant les fluorescents dans tous les canaux. Utilisez ensuite cette image pour produire la matrice de transformation. Démarrez le plug-in d’analyse logicielle et chargez les images bicolores précédemment enregistrées de billes fluorescentes dans le logiciel.

Choisissez l’orientation utilisée des canaux fluorescents. Cliquez sur Oui lorsque vous êtes invité à calibrer les images, puis sélectionnez l’instantané précédemment pris. Ouvrez le gestionnaire d’unités pour définir les facteurs de conversion d’unités, puis ouvrez le gestionnaire de localisation.

Pour déterminer la fonction d’étalement de points, ou PSF, appuyez sur le bouton PSF Radius. Dans la fenêtre de l’estimateur PSF qui s’ouvre, définissez l’ouverture numérique et le maximum d’émission. Cliquez ensuite sur Estimer le rayon PSF.

Ensuite, acceptez la PSF expérimentale obtenue. Définissez la boîte d’évaluation, le nombre de boucles de déflation et le nombre de cœurs de l’ordinateur utilisés pour le calcul. Appuyez ensuite sur Localiser pour commencer à ajuster la distribution d’intensité des particules uniques, à l’aide d’une fonction gaussienne symétrique 2D.

Ouvrez le gestionnaire d’étalonnage. Dans l’image rendue et fusionnée des deux canaux, le signal d’origine et les centres localisés seront affichés. Choisissez le mode Fine.

Ensuite, connectez manuellement les paires correspondantes de centres localisés dans les deux canaux, qui proviennent de la même perle fluorescente, en traçant une ligne de connexion. Connectez les signaux correspondants répartis sur le champ de vision. Appuyez ensuite sur Accepter et enregistrez la matrice de transformation.

Pour effectuer une imagerie moléculaire unique des protéines de la membrane mitochondriale, montez la lamelle de l’échantillon entre les anneaux en caoutchouc et en PTFE. Remplissez ensuite la chambre avec 0,5 à 0,8 millilitre de support d’imagerie. Nettoyez l’objectif et le bas de la lamelle.

Utilisez ensuite une lumière de transmission ou une ligne laser pour faire la mise au point sur les cellules, après avoir ajouté une goutte d’huile dans la lentille. Ajustez ensuite la puissance des deux lasers d’excitation pour obtenir une intensité similaire, et recherchez une zone avec de nombreux signaux fluorescents. Ajustez l’angle d’éclairage dans le logiciel de contrôle du microscope TIRF pour créer un angle d’incident plus petit que l’angle critique, ou le mode TIR, afin d’exciter la région d’intérêt spécifique via une feuille HILO.

L’adaptation de l’éclairage du microscope TIRF à l’excitation des organites cellulaires à l’aide de l’éclairage HILO nécessite un jugement rapide du rapport signal/bruit de fond et une expérience de la microscopie TIRF, ainsi qu’une connaissance de la morphologie cellulaire. Réglez le gain EM et choisissez un temps d’exposition adapté à l’expérience qui recueille suffisamment de photons par image. Ajustez ensuite la puissance du laser afin d’obtenir un rapport signal/bruit élevé, car ce rapport correspond directement à la précision de localisation.

Trouvez une zone à la périphérie cellulaire avec des mitochondries allongées qui ne se chevauchent pas et des signaux monomoléculaires. Si aucun signal unique n’est visible dans l’un ou les deux canaux, attendez que le blanchiment entraîne l’apparition de signaux à molécule unique. Dans le cas où un seul canal doit être blanchi, éteignez le laser de l’autre canal, pour éviter le blanchiment, avant d’enregistrer ce canal.

Enregistrez jusqu’à ce que le nombre de signaux soit trop faible pour une continuation raisonnable. Démarrez le logiciel de traitement d’imagerie et vérifiez les structures mitochondriales en générant une image cumulée d’au moins 1 000 images enregistrées. Démarrez le plug-in d’analyse logicielle.

Pour effectuer le traitement des données pour la localisation et le suivi, chargez les données brutes. Cochez multicolore. Choisissez l’orientation correcte des deux canaux.

Lorsqu’on vous demande d’étalonner les images, chargez la matrice de transformation. Les chaînes seront affichées séparément. Ouvrez les données brutes à partir du conteneur d’images en cliquant sur Afficher.

Ouvrez ensuite le gestionnaire d’unités dans l’onglet supérieur et définissez les facteurs de conversion d’unités dans chaque canal. Ouvrez le gestionnaire de localisation dans l’onglet supérieur et définissez la zone d’évaluation et le nombre de boucles de déflation. Cliquez sur Rayon PSF pour ouvrir l’estimateur PSF.

Réglez l’ouverture numérique et le maximum d’émission pour obtenir la valeur PSF théorique. Appuyez sur Accepter. Répétez cette opération pour toutes les chaînes.

Appuyez ensuite sur Localiser pour lancer la localisation d’une seule particule pour les signaux enregistrés dans les deux canaux. Attendez la fin du logiciel. Maintenant, une image super-résolue pour chaque canal est obtenue dans le conteneur d’images du plugin d’analyse logicielle.

PINK1 est un facteur important garantissant la fonctionnalité mitochondriale. Pour déterminer la localisation de PINK1 par rapport à Tom20 dans les mitochondries fonctionnelles et dysfonctionnelles, une série chronologique de 1 000 images a été enregistrée. L’image cumulative de tous les signaux au fil du temps provenant d’un canal a montré que PINK1 était localisé dans le cytosol, au niveau de la membrane externe et à l’intérieur des mitochondries dans des conditions normales, mais préférentiellement dans la membrane externe des mitochondries dépolarisées.

Comme le montrent les images additionnées de particules localisées, PINK1 est distribué principalement à l’intérieur des mitochondries polarisées, tandis que Tom20 est localisé dans la membrane mitochondriale externe. Cela devient encore plus clair dans l’image fusionnée des particules localisées de Tom20 et PINK1, qui montre que la distribution de la protéine de la membrane externe Tom20 est beaucoup plus large. Pour vérifier la localisation de PINK1 à l’intérieur des mitochondries, la sous-unité de 30 kilodaltons du complexe respiratoire un a été fusionnée à une GFP photoactivable et enregistrée par microscopie de localisation par photoactivation par fluorescence.

L’image tricolore cumulative et la distribution de la section transversale montrent la superposition du complexe et de PINK1, confirmant l’importation de PINK1 pleine longueur. Ces données démontrent que les sous-populations de PINK1 occupent plusieurs micro-compartiments mitochondriaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 heures, y compris l’enregistrement et le post-traitement des données, si elle est bien faite.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de tester le mouvement des organites. À la suite de cette procédure, la localisation relative des protéines peut être déterminée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du suivi des protéines mitochondriales à une seule particule pour observer leur comportement dans Z2, et dans différentes conditions métaboliques, et sous stress.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une microscopie à double colonne des protéines mitochondriales pour révéler leur position et leur trafic de sous-organites.