Name: Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez une méthode in vitro combinant digestion gastro-intestinale et communauté microbienne synthétique pour évaluer l'invasion cellulaire par des pathogènes et la viabilité des probiotiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient le soutien financier de la Fondation de recherche de Flandre à Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria est doctorant pris en charge par la Flandre Innovation et entrepreneuriat (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, transport fluvial).

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+estimates+for+the+number+of+human+and+bacteria+cells+in+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body.</a> PLoS Biology. 14, e1002533(2016).</li>
<li>Kelly, D., King, T., Aminov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+microbial+colonization+of+the+gut+in+early+life+to+the+development+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research-Fundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity.</a> Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1349007915001073">Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment.</a> Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).</li>
<li>Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9495612">Microbial complexes in subgingival plaque.</a> Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).</li>
<li>Haffajee, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgingival+microbiota+in+healthy%2C+well-maintained+elder+and+periodontitis+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects.</a> Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).</li>
<li>Venema, K. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.27.1_supplement.643.12">Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host.</a> The FASEB Journal. 27, (2013).</li>
<li>Marzorati, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24884540">The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro.</a> BMC Microbiology. 14, 133(2014).</li>
<li>Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+displacement+of+mutans+streptococci+and+inhibition+of+tooth-decay+by+Streptococcus-Salivarius+Tove-R%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R.</a> Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).</li>
<li>Slomka, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+stimulation+of+commensal+oral+bacteria+suppresses+pathogens%3A+the+prebiotic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept.</a> Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).</li>
<li>Hernandez-Sanabria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+increased+respiratory+activity+of+selected+oral+bacteria+may+explain+competitive+and+collaborative+interactions+in+the+oral+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235(2017).</li>
<li>Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+quantify+live+and+dead+cells+in+multi-species+oral+biofilm+by+real-time+PCR+with+propidium+monoazide%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide.</a> AMB Express. 3, (2013).</li>
<li>Ehsani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evenness+determines+diversity+and+cell+density+dynamics+in+synthetic+microbial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems.</a> Scientific Reports. 8, 340(2018).</li>
<li>Hernandez-Sanabria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+particular+bacterial+PCR-denaturing+gradient+gel+electrophoresis+patterns+with+bovine+ruminal+fermentation+parameters+and+feed+efficiency+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).</li>
<li>Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+inorganic+arsenic+in+intestinal+epithelial+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines.</a> Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).</li>
<li>Minekus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardised+static+in+vitro+digestion+method+suitable+for+food+-+an+international+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus.</a> Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).</li>
<li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE%2FDEAD+BacLight+kit+in+combination+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).</li>
<li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/2041-210X.12607">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).</li>
<li>Yamashita, Y., Takeshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+microbiome+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">The oral microbiome and human health.</a> Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).</li>
<li>Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The oral microbiome in health and disease.</a> Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+cell+line+authentication%2C+annotation+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A resource for cell line authentication, annotation and quality control.</a> Nature. 520, 307(2015).</li>
<li>Pelaseyed, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucus+and+mucins+of+the+goblet+cells+and+enterocytes+provide+the+first+defense+line+of+the+gastrointestinal+tract+and+interact+with+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system.</a> Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).</li>
<li>Bengoa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulated+gastrointestinal+conditions+increase+adhesion+ability+of+Lactobacillus+paracasei+strains+isolated+from+kefir+to+Caco-2+cells+and+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin.</a> Food Research International. 103, 462-467 (2018).</li>
<li>Kleiveland, C. R., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/978-3-319-16104-4.pdf">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).</li>
<li>Laparra, J. M., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+models+to+study+bacterial+adhesion+to+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium.</a> Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).</li>
<li>Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Caco-2%2C+HT-29+and+the+mucus-secreting+HT29-MTX+intestinal+cell+models+to+investigate+Salmonella+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion.</a> Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).</li>
<li>Großkopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369527414000198">Synthetic microbial communities.</a> Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Le microbiome oral est un élément clé dans la santé humaine, comme l’a récemment rapportée par plusieurs auteurs20,21. Résultats antérieurs indiquent que l’ingestion de la salive contenant de grosses charges de bactéries peut influencer l’écosystème microbien de l’intestin grêle, qui est l’un des principaux sites pour amorcer la pompe système immunitaire. La combinaison d’un modèle de la digestion gastro-intestinale supérieure statique avec l’interface de l’hôte ...

Les êtres humains cohabitent avec des bactéries qui sont présentes sur le même nombre que les cellules humaines1. Donc, il importe de crucial afin d’obtenir une compréhension globale du microbiome humain. La cavité buccale est un environnement unique, car il est divisé en plusieurs petits habitats, donc contenant une grande variété de bactéries et de biofilms dans ces différents endroits. Étant un écosystème ouvert, certaines espèces dans la bouche peut être transitoires visiteurs. Toutefois, certains micro-organismes colonisent peu après que la naissance et la forme organisée de biofilms2. Ceux-ci sont présents dans la surface des dents au-dessus de la crevasse gingivale, la crevasse sous-gingival, muqueuses et prothèses dentaires et de garnitures3. Les bactéries peuvent également être présents comme les flocons et les cellules planctoniques dans la lumière du canal dentaire, soit mélangés entre eux avec tissu de pulpe nécrotique ou en suspension dans une phase fluide.
Il est active et continue la diaphonie entre les cellules de l’hôte et la microflore résidente4. Les bactéries communiquent au sein et entre les espèces, et seule une faible proportion des colonisateurs naturels peut adhérer aux tissus, tandis que les autres bactéries attachent à ces colonisateurs primaires. Par exemple, liaison de cellules entre micro-organismes est la clé pour intégrer les colonisateurs secondaires biofilms par voie orale et construction de réseaux complexes d’interaction des cellules microbiennes4. Environ 70 % des agrégats bactériens dans un échantillon de salive sont formés par Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. et non identifiés Bacteroidetes. F. nucleatum est un colonisateur intermédiaire dans le biofilm sous-gingival et agrégats avec les colonisateurs fin P. gingivalis, T. denticola et Tannerella forsythia, qui sont impliqués dans la parodontite5. En outre, Streptococcus mitis occupe les habitats les muqueuses et dentaires, tandis que S. sanguinis et S. gordonii préfèrent à coloniser les dents3. Ainsi, S. sanguinis est présente dans moins incisives et canines, Actinomyces naeslundii a retrouvé en dents antérieures supérieures6.
En outre, le microbiome autochtone joue un rôle dans le maintien de la santé humaine2. Microbiote résident participe à l’éducation immunitaire et pour prévenir l’expansion de l’agent pathogène. Cette résistance de colonisation se produit parce que les bactéries indigènes peuvent être mieux adaptés à attacher aux surfaces et plus efficace à la métabolisation des nutriments disponibles pour la croissance. Bien que les souches probiotiques survivent le passage gastro-intestinal et restent actives, la persistance de bactéries autochtones avalé d’une situation supérieure du tube digestif n’a pas été entièrement décrit. Ainsi, nous avons soumis une communauté artificielle, représentant de l’écosystème par voie orale, aux conditions du transit gastro-intestinal simulée. La viabilité des cellules bactériennes a été évaluée en utilisant un modèle de compartiments ressemblant à l’épithélium du tube digestif. Simulateurs de gut actuel offrent reproductibilité adaptée en termes d’analyse de la communauté microbienne luminale7. Cependant, adhérence bactérienne et l’interaction hôte-microbe séparément s’adressent, comme la combinaison de lignées cellulaires avec des communautés microbiennes est difficile8. En revanche, nous présentons un cadre qui fournit une explication mécaniste potentielle de colonisation réussie rapportées sur l’interface de l’intestin. En effet, ce modèle peut être utilisé conjointement avec un modèle statique gut pour évaluer l’impact des communautés microbiennes sur signalisation surface hôte.

<table><tbody><tr><td><FORTES>SOUCHES</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggregatibacter actinomycetemcomitans </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 43718</td><td></td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 10953</td><td></td></tr><tr><td>Porphyromonas gingivalis </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 33277</td><td></td></tr><tr><td>Prevotella intermedia </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25611</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mutans </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25175</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus sobrinus </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 33478</td><td></td></tr><tr><td>Actinomyces viscosus </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15987</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus salivarius&nbsp ; TOVE-R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mitis </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 49456</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus sanguinis </td><td>BCCM/LMG Bacteria Collection</td><td>LMG 14657</td><td></td></tr><tr><td>Veillonella parvula </td><td>Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td>DSM 2007</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus gordonii </td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 49818</td><td></td></tr><tr><td>CELL LINES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées</td><td>86010202</td><td></td></tr> cellules <tr><td>HT29-MTX</td><td>Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées</td><td>12040401</td><td></td></tr><tr><td><FORT>RÉACTIFS ET CONSOMMABLES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>bouillon Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Blood Agar 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0055</td><td>Blood Agar medium</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma</td><td>M9429</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>5 % stérile defibinated horse</td><td>blood E& O Laboratories</td> <td>Ltd,P030</td><td></td></tr><tr><td>InnuPREP PCRpure Kit</td><td>Analytik Jena</td><td>845-KS-5010250</td><td>Kit de purification PCR</td></tr><tr><td>Big Dye</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337454</td><td>colorant pour le séquençage</td></tr><tr><td>ABI Prism BigDye Terminator v3.1 kit de séquençage de cycle</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337456</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp ; Vert I</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>T25 flacons de culture non enrobés, traités par culture cellulaire, ventilés, stériles</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0,4 %, liquide, stérile</td><td>filtré Sigma-Aldrich</td><td>T8154&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture cellulaire PBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, avec les technologies GlutaMAX et Pyruvate</td><td>Life</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire à membrane polyester Corning Transwell</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3450-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Mucine d’estomac porcin Type II&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin inactivé</td><td>Greiner Bio One</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100 pour la biologie moléculaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sans calcium, magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LDH Kit de dosage de cytotoxicité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88953</td><td></td></tr><tr><td>Corning HTS Transwell-24 puits, taille des pores 0,4 & micro ; m</td><td>Corning Costar Corp</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Serva Électrophorèse</td><td>28539010</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer chambre de comptage améliorée</td><td>Carl Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Cytomètre</td><td>en flux BD Biosciences</td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td> <td>PowerLyzer 24MoBio</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>Système de chasse d’eau</td><td>Custom</td> <td>made-InnOva</td><td></td></tr> <tr><td>4080 Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>8261-30-1007</td><td>Agitateur pour 2.10</td></tr><tr><td>Memmert CO2</td><td>incubateur Memmert GmbH & Co.</td><td>ICO150med</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS (système de résistance électrique)</td><td>EMD Millipore, Merck KGaA</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Milli-Q académique, système d’eau ultra pure</td><td>Millipore, Merck KGaA-Shaker</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(ROCKER 3D basic)</td><td>IKA</td><td>4000000</td><td>Shaker pour 6.10</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique sur l’interface hôte-microbe in vitro gut

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

L’interaction entre l’hôte et de la flore microbienne a été reconnue depuis longtemps et largement décrite. La bouche est semblable à d’autres sections du tractus gastro-intestinal, comme résident microbiote se produit et empêche la colonisation par des bactéries exogènes. En effet, plus de 600 espèces de bactéries sont trouvent dans la cavité buccale, et une seule personne peut transporter environ 100 différents à tout moment. Bactéries orales possèdent la capacité de respecter les divers créneaux dans l’écosystème par voie orale, donc s’intégrer dans les communautés microbiennes et qui favorise la croissance et la survie. Cependant, le débit des bactéries dans l’intestin lors de la déglutition a proposé à perturber l’équilibre de la microflore intestinale. En fait, l’administration orale de P. gingivalis décalé la composition bactérienne de la microflore iléale. Nous avons utilisé une communauté synthétique comme une représentation simplifiée de l’écosystème naturel par voie orale, pour élucider la survie et la viabilité des bactéries orales soumises à des conditions de transit gastrointestinal simulée. Quatorze espèces ont été sélectionnés, soumis à in vitro salivaires, gastriques et les processus de la digestion intestinale et présentés à un modèle de cellule compartiments contenant des cellules Caco-2 et HT29-MTX pour simuler l’épithélium muqueux du tube digestif. Ce modèle a servi à éclaircir l’impact des bactéries avalés sur cellules impliquées dans la circulation entéro-hépatique. À l’aide des communautés synthétiques permet de contrôlabilité et reproductibilité. Ainsi, cette méthode peut être adaptée pour évaluer la viabilité de l’agent pathogène et les changements ultérieurs associée à l’inflammation, la capacité de colonisation des mélanges de probiotiques, et en fin de compte, bactérien potentiel impact sur la circulation presystemic.

Ce protocole entraîne la génération d’un modèle approprié pour élucider la survie et la viabilité des bactéries orales soumises à des conditions de transit gastrointestinal simulée. Les comtes de cellules intactes de souches individuelles est d’environ 108 piles avant-1 mL de la création de la communauté synthétique, tandis que le microcosme multi-espèces figurant au-dessus de 90 % des cellules viables durant l’établissement de la Communauté ( Fi...

Interactions hôtes-microorganismes gut ont été évaluées à l’aide d’une nouvelle approche combinant une communauté orale synthétique, in vitro digestion gastro-intestinale et un modèle de l’épithélium de l’intestin grêle. Nous présentons une méthode qui peut être adaptée pour évaluer l’invasion des cellules des agents pathogènes et des biofilms multi-espèces, ou même de tester la capacité de survie des probiotiques formulations.

Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Ce modèle est la prochaine étape dans la définition des microdirections de l’hôte pour le tube digestif supérieur. Il permet d’aborder des questions de recherche mécaniste et offre de nombreuses opportunités pour l’industrie alimentaire, pharmaceutique et nutraceutique, ainsi que pour la toxicologie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine un modèle du système gastro-intestinal avec la micro-interface de l’hôte comprenant une communauté microbienne complexe.Il est très applicable et il est également très flexible. Cette méthodologie peut être adoptée en utilisant d’autres types de cellules pour évaluer la viabilité des agents pathogènes et les informations ultérieures. Les changements peuvent également être utilisés pour aider la capacité de colonisation des mélanges de probiotiques et, en fin de compte, l’effet potentiel des bactéries sur la circulation systémique.Pour commencer, autoclavez le milieu, puis ajoutez cinq microgrammes par millilitre de hemen et un microgramme par millilitre de menadione. Versez neuf millilitres de fluide dans des tubes Hungate et fermez les tubes avec un bouchon en caoutchouc et un capuchon en aluminium. Ensuite, rincez les tubes avec un mélange de 90 % d’azote et 10 % de dioxyde de carbone.Utilisez la seringue pour prélever un millilitre de milieu anaérobie et transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Prélevez des colonies individuelles de chaque espèce bactérienne et mettez-les en suspension dans le milieu. Transférez ensuite les colonies dans le BHI anaérobie modifié et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Après l’incubation, utilisez du PBS stérilisé filtré pour diluer les cultures à 10 à un cinquième de cellules par millilitre. Utilisez ensuite la cytométrie en flux avec le colorant à l’iodure de propidium cyber green pour mesurer le nombre de cellules. L’évaluation de la composition et de la viabilité de la communauté du microbiome est essentielle pour éviter les biais dans notre expérience.Retirez le milieu de culture cellulaire des flacons, puis utilisez cinq millilitres de PBS sans calcium ni magnésium pour laver les cellules une fois. Ajoutez deux millilitres de solution de trypsine EDTA aux cellules. Répartissez la solution en déplaçant doucement le ballon.Retirez ensuite 1,5 millilitre de la solution de trypsine et incubez le ballon à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir vérifié au microscope si les cellules se sont détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cellulaire supplémenté dans le ballon pour inactiver la trypsine, et pipetez de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire homogène. Mélanger immédiatement une aliquote de 50 microlitres de la suspension cellulaire avec une solution stérile de bleu de trypan à 0,4 % dans une proportion volume/volume de 1:1 pour les cellules KCO2 pour un volume de 1:5 pour HT29MTX.Mélanger par pipetage et charger la suspension dans une chambre de comptage avant de compter les cellules au microscope. Après avoir préparé les suspensions de cellules KCO2 et HT29MTX conformément au protocole de texte, homogénéisez les suspensions et ajoutez le volume correspondant de cellules KCO2 et HT29MTX dans un récipient stérile pré-rempli de milieu de culture cellulaire supplémenté. Aspirez le milieu pré-incubé par le côté apical de la chambre préalablement préparée.Mélangez doucement la suspension cellulaire par pipetage et transférez 1,5 millilitres dans le compartiment apical des inserts de chambre en mélangeant la suspension cellulaire tous les un à trois puits pour assurer une homogénéisation constante. Déplacez doucement les plaques d’avant en arrière, puis de droite à gauche pour répartir uniformément les cellules dans le puits. Transférez les plaques dans l’incubateur et répétez le mouvement des plaques.L’installation des cellules doit se faire avec une homogénéisation constante de la suspension cellulaire pour assurer une répartition uniforme dans le puits. Pour mesurer l’intégrité de la barrière épithéliale avant de démarrer l’ASA, assurez-vous que l’équipement de niveau est complètement chargé avant de commencer les mesures. Débranchez l’équipement de niveau de l’alimentation électrique et couvrez-le d’un sac d’autoclave en plastique.Faites un trou dans le sac pour introduire l’électrode dans le port d’entrée du compteur. Vaporisez ensuite le sac avec de l’éthanol à 70 % avant de transférer l’équipement à plusieurs niveaux dans l’armoire de flux. Pour désinfecter l’électrode, plongez les pointes des électrodes dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 minutes.Laissez les pointes sécher à l’air libre pendant 15 secondes, puis utilisez un milieu de culture cellulaire pour rincer l’électrode. Laissez les cellules revenir à température ambiante à l’intérieur de l’armoire d’écoulement. Assurez-vous que le lecteur est déconnecté du chargeur, puis réglez le commutateur de mode sur Ohms et allumez l’interrupteur d’alimentation.Mesurez la résistance de la cellule en immergeant l’électrode avec l’embout le plus court dans l’insert et l’embout le plus long hors du puits. Gardez l’électrode à un angle de 90 degrés par rapport à l’insert de la plaque. Pour simuler la digestion orale, transférez trois millilitres de la communauté bactérienne dans un tube stérile de 50 millilitres et mélangez avec trois millilitres de liquide salivaire simulé ou SSF.Ajoutez 75 unités par millilitre d’alpha-amylase de salive humaine de type 9A et deux grammes par litre de mucine d’estomac porcin de type 2. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius et 100 tr/min pendant deux minutes. Prélever un échantillon de deux millilitres pour l’extraction de l’ADN et la quantification par cytométrie en flux.Pour simuler la digestion gastrique, ajoutez quatre millilitres de liquide gastrique simulé ou SGF à trois millilitres de bactéries. Utilisez une molaire HCl pour ajuster le pH à trois si nécessaire. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius et 100 tr/min pendant deux minutes.Prélevez ensuite un échantillon de deux millilitres. Pour la digestion de l’intestin grêle, ajoutez quatre millilitres de liquide intestinal simulé ou SIF aux bactéries. Utilisez de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH si nécessaire.Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius et 100 tr/min pendant deux minutes. Et prélevez un échantillon de deux millilitres. Après avoir lavé et ajusté la densité cellulaire de la digestion de l’intestin grêle conformément au protocole de texte, retirez le milieu apical du système transwell et ajoutez 1,5 millilitre de suspension bactérienne.Co-cultivez le système dans des conditions générales de culture cellulaire pendant deux heures. Après l’incubation, mesurez les valeurs des niveaux pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale, comme démontré précédemment dans la vidéo. Ajouter 0,5 millilitre de n-acétylcystéine 10 millimolaires et de HPSS pour solubiliser le mucus produit par le HT29MTX et récupérer les bactéries adhérentes.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation. Récupérez le NAC HPSS dans un tube de microcentrifugation et utilisez un millilitre de DPBS pour laver les cellules deux fois. Ajoutez 0,5 millilitre de triton-x100 à 0,5 % sur les monocouches et perturbez les cellules par pipetage.Puis récupérez rapidement le liquide en vortex pendant une minute. La vitesse est cruciale pour éviter d’endommager les cellules bactériennes avec le détergent. Analysez les échantillons selon le protocole texte.Comme indiqué ici, le nombre de cellules intactes des souches individuelles était d’environ 10 à huit cellules par millilitre avant la création de la communauté synthétique, tandis que le microcosme multi-espèces contenait plus de 90 % de cellules viables lors de l’établissement de la communauté. Sur la base de la quantification des morts vivants, la viabilité bactérienne diminue après chaque étape de digestion en raison du pH acide pendant le passage gastrique et des biosels contenus dans les fluides de digestion de l’intestin grêle. Les conditions difficiles de la digestion de l’estomac et de l’intestin grêle peuvent transformer les bactéries en cellules viables, mais pas en cellules cultivables, qui sont des bactéries vivantes qui ne se développent pas et ne se divisent pas.Comme le montre cette figure, les cellules viables récupérées à partir de l’interface muqueuse sont colorées en bleu dans le graphique de cytométrie en flux. Cependant, aucune croissance n’a été observée lors de l’ensemencement de ces échantillons de mucus. La fraction dans laquelle les bactéries présentent des taux de viabilité plus élevés est celle des débris cellulaires, révélés par le comptage sur plaque.Le nombre de colonies peut être variable, mais la présence de bactéries métaboliquement actives se retrouve dans les échantillons moins dilués. Après ce développement, cette technique pourra être utilisée par des recherches dans les domaines de la nutrigénomique ou de la pharmacomicrobiomique pour étudier l’hôte de manière microcosmique. En suivant ce protocole, d’autres techniques telles que le transcriptome ou l’analyse métabolique peuvent être effectuées pour obtenir une compréhension mécaniste dans le processus de colonisation réussi en conséquence.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un modèle in vitro complexe représentatif des processus digestifs, y compris la diaphonie entre les cellules hôtes et le reste du microbiome. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries pathogènes peut être extrêmement dangereux et qu’il est important de prendre des précautions de biosécurité.

assessing-viability-synthetic-bacterial-consortium-on-vitro-gut-host

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

La conception d'un encodage opéron synthétique à la fois l'appareil sécrétoire et les monomères de fibres structurelles curli est décrite. Surproduction de ces amyloïdes et les polymères adhérentes permet un gain mesurable de l'adhésion de...

Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

Source : Arroyo, M. C., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro . J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre l’évaluation de la viabilité d’une communauté microbienne orale synthétique lors d’une digestion orale, gastrique et intestinale simulée. La survie bactérienne est quantifiée après chaque phase, révélant un déclin progressif dû au stress digestif.

Exposer une communauté bactérienne orale synthétique à des phases simulées de digestion

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et...

Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie de mise en place d’un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions entre des fragments de tissu intestinal de souris et des bactéries intestinales spécifiques. Le dispositif se compose de deux paires de ports d'entrée-sortie, le premier connectant la lumière du tissu intestinal et y fournissant la suspension bactérienne spécifique, et le second fournissant en permanence des fluides aux puits du dispositif pour...

Un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions hôte-microbiote

Nous décrivons un protocole in vitro de co-culture gut microbiome et villosités intestinales pendant une période prolongée en utilisant un système microphysiological humain gut-on-a-chip.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Nous présentons ici un protocole pour cultiver le microbiote intestinal du côlon in vitro, à l’aide d’une série de bioréacteurs qui simulent les conditions physiologiques du tractus gastro intestinal.

Appliquer des avancées In Vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine

Ce protocole décrit un système in vitro de fermentation par lots-culture du microbiote fécal humain, utilisant l'inuline (un prébiotique bien connu et l'un des modulateurs de microbiote les plus largement étudiés) pour démontrer l'utilisation de ce système dans l'estimation des effets de sur la composition du microbiote fécal et les activités métaboliques.

Un modèle de culture de lots in vitro pour estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain

Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.

Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

Ce protocole détaille l’assemblage de réseaux de mini-bioréacteurs à utiliser pour la culture en flux continu de communautés fécales complexes dans des conditions anaérobies. Nous discutons également des méthodes d’assemblage, d’inoculation et d’échantillonnage des réacteurs pour une analyse plus approfondie.

Ensemble de bioréacteur pour la culture continue de communautés fécales complexes

Découvrez une méthode in vitro combinant digestion gastro-intestinale et communauté microbienne synthétique pour évaluer l'invasion cellulaire par des pathogènes et la viabilité des probiotiques.

Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut

Explorer plus de vidéos