Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut

Ce modèle est la prochaine étape dans la définition des microdirections de l’hôte pour le tube digestif supérieur. Il permet d’aborder des questions de recherche mécaniste et offre de nombreuses opportunités pour l’industrie alimentaire, pharmaceutique et nutraceutique, ainsi que pour la toxicologie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine un modèle du système gastro-intestinal avec la micro-interface de l’hôte comprenant une communauté microbienne complexe.

Il est très applicable et il est également très flexible. Cette méthodologie peut être adoptée en utilisant d’autres types de cellules pour évaluer la viabilité des agents pathogènes et les informations ultérieures. Les changements peuvent également être utilisés pour aider la capacité de colonisation des mélanges de probiotiques et, en fin de compte, l’effet potentiel des bactéries sur la circulation systémique.

Pour commencer, autoclavez le milieu, puis ajoutez cinq microgrammes par millilitre de hemen et un microgramme par millilitre de menadione. Versez neuf millilitres de fluide dans des tubes Hungate et fermez les tubes avec un bouchon en caoutchouc et un capuchon en aluminium. Ensuite, rincez les tubes avec un mélange de 90 % d’azote et 10 % de dioxyde de carbone.

Utilisez la seringue pour prélever un millilitre de milieu anaérobie et transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Prélevez des colonies individuelles de chaque espèce bactérienne et mettez-les en suspension dans le milieu. Transférez ensuite les colonies dans le BHI anaérobie modifié et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après l’incubation, utilisez du PBS stérilisé filtré pour diluer les cultures à 10 à un cinquième de cellules par millilitre. Utilisez ensuite la cytométrie en flux avec le colorant à l’iodure de propidium cyber green pour mesurer le nombre de cellules. L’évaluation de la composition et de la viabilité de la communauté du microbiome est essentielle pour éviter les biais dans notre expérience.

Retirez le milieu de culture cellulaire des flacons, puis utilisez cinq millilitres de PBS sans calcium ni magnésium pour laver les cellules une fois. Ajoutez deux millilitres de solution de trypsine EDTA aux cellules. Répartissez la solution en déplaçant doucement le ballon.

Retirez ensuite 1,5 millilitre de la solution de trypsine et incubez le ballon à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir vérifié au microscope si les cellules se sont détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cellulaire supplémenté dans le ballon pour inactiver la trypsine, et pipetez de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire homogène. Mélanger immédiatement une aliquote de 50 microlitres de la suspension cellulaire avec une solution stérile de bleu de trypan à 0,4 % dans une proportion volume/volume de 1:1 pour les cellules KCO2 pour un volume de 1:5 pour HT29MTX.

Mélanger par pipetage et charger la suspension dans une chambre de comptage avant de compter les cellules au microscope. Après avoir préparé les suspensions de cellules KCO2 et HT29MTX conformément au protocole de texte, homogénéisez les suspensions et ajoutez le volume correspondant de cellules KCO2 et HT29MTX dans un récipient stérile pré-rempli de milieu de culture cellulaire supplémenté. Aspirez le milieu pré-incubé par le côté apical de la chambre préalablement préparée.

Mélangez doucement la suspension cellulaire par pipetage et transférez 1,5 millilitres dans le compartiment apical des inserts de chambre en mélangeant la suspension cellulaire tous les un à trois puits pour assurer une homogénéisation constante. Déplacez doucement les plaques d’avant en arrière, puis de droite à gauche pour répartir uniformément les cellules dans le puits. Transférez les plaques dans l’incubateur et répétez le mouvement des plaques.

L’installation des cellules doit se faire avec une homogénéisation constante de la suspension cellulaire pour assurer une répartition uniforme dans le puits. Pour mesurer l’intégrité de la barrière épithéliale avant de démarrer l’ASA, assurez-vous que l’équipement de niveau est complètement chargé avant de commencer les mesures. Débranchez l’équipement de niveau de l’alimentation électrique et couvrez-le d’un sac d’autoclave en plastique.

Faites un trou dans le sac pour introduire l’électrode dans le port d’entrée du compteur. Vaporisez ensuite le sac avec de l’éthanol à 70 % avant de transférer l’équipement à plusieurs niveaux dans l’armoire de flux. Pour désinfecter l’électrode, plongez les pointes des électrodes dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 minutes.

Laissez les pointes sécher à l’air libre pendant 15 secondes, puis utilisez un milieu de culture cellulaire pour rincer l’électrode. Laissez les cellules revenir à température ambiante à l’intérieur de l’armoire d’écoulement. Assurez-vous que le lecteur est déconnecté du chargeur, puis réglez le commutateur de mode sur Ohms et allumez l’interrupteur d’alimentation.

Mesurez la résistance de la cellule en immergeant l’électrode avec l’embout le plus court dans l’insert et l’embout le plus long hors du puits. Gardez l’électrode à un angle de 90 degrés par rapport à l’insert de la plaque. Pour simuler la digestion orale, transférez trois millilitres de la communauté bactérienne dans un tube stérile de 50 millilitres et mélangez avec trois millilitres de liquide salivaire simulé ou SSF.

Ajoutez 75 unités par millilitre d’alpha-amylase de salive humaine de type 9A et deux grammes par litre de mucine d’estomac porcin de type 2. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius et 100 tr/min pendant deux minutes. Prélever un échantillon de deux millilitres pour l’extraction de l’ADN et la quantification par cytométrie en flux.

Pour simuler la digestion gastrique, ajoutez quatre millilitres de liquide gastrique simulé ou SGF à trois millilitres de bactéries. Utilisez une molaire HCl pour ajuster le pH à trois si nécessaire. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius et 100 tr/min pendant deux minutes.

Prélevez ensuite un échantillon de deux millilitres. Pour la digestion de l’intestin grêle, ajoutez quatre millilitres de liquide intestinal simulé ou SIF aux bactéries. Utilisez de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH si nécessaire.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius et 100 tr/min pendant deux minutes. Et prélevez un échantillon de deux millilitres. Après avoir lavé et ajusté la densité cellulaire de la digestion de l’intestin grêle conformément au protocole de texte, retirez le milieu apical du système transwell et ajoutez 1,5 millilitre de suspension bactérienne.

Co-cultivez le système dans des conditions générales de culture cellulaire pendant deux heures. Après l’incubation, mesurez les valeurs des niveaux pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale, comme démontré précédemment dans la vidéo. Ajouter 0,5 millilitre de n-acétylcystéine 10 millimolaires et de HPSS pour solubiliser le mucus produit par le HT29MTX et récupérer les bactéries adhérentes.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation. Récupérez le NAC HPSS dans un tube de microcentrifugation et utilisez un millilitre de DPBS pour laver les cellules deux fois. Ajoutez 0,5 millilitre de triton-x100 à 0,5 % sur les monocouches et perturbez les cellules par pipetage.

Puis récupérez rapidement le liquide en vortex pendant une minute. La vitesse est cruciale pour éviter d’endommager les cellules bactériennes avec le détergent. Analysez les échantillons selon le protocole texte.

Comme indiqué ici, le nombre de cellules intactes des souches individuelles était d’environ 10 à huit cellules par millilitre avant la création de la communauté synthétique, tandis que le microcosme multi-espèces contenait plus de 90 % de cellules viables lors de l’établissement de la communauté. Sur la base de la quantification des morts vivants, la viabilité bactérienne diminue après chaque étape de digestion en raison du pH acide pendant le passage gastrique et des biosels contenus dans les fluides de digestion de l’intestin grêle. Les conditions difficiles de la digestion de l’estomac et de l’intestin grêle peuvent transformer les bactéries en cellules viables, mais pas en cellules cultivables, qui sont des bactéries vivantes qui ne se développent pas et ne se divisent pas.

Comme le montre cette figure, les cellules viables récupérées à partir de l’interface muqueuse sont colorées en bleu dans le graphique de cytométrie en flux. Cependant, aucune croissance n’a été observée lors de l’ensemencement de ces échantillons de mucus. La fraction dans laquelle les bactéries présentent des taux de viabilité plus élevés est celle des débris cellulaires, révélés par le comptage sur plaque.

Le nombre de colonies peut être variable, mais la présence de bactéries métaboliquement actives se retrouve dans les échantillons moins dilués. Après ce développement, cette technique pourra être utilisée par des recherches dans les domaines de la nutrigénomique ou de la pharmacomicrobiomique pour étudier l’hôte de manière microcosmique. En suivant ce protocole, d’autres techniques telles que le transcriptome ou l’analyse métabolique peuvent être effectuées pour obtenir une compréhension mécaniste dans le processus de colonisation réussi en conséquence.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un modèle in vitro complexe représentatif des processus digestifs, y compris la diaphonie entre les cellules hôtes et le reste du microbiome. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries pathogènes peut être extrêmement dangereux et qu’il est important de prendre des précautions de biosécurité.