Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’endocrinologie, ainsi que dans le domaine des neurosciences, comme notre recherche visant à examiner les réponses du cerveau aux signaux endocriniens. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’examiner les effets directs des signaux endocriniens sur le cerveau séparés des autres tissus. Pour commencer cette procédure, utilisez une pince pour gratter le centre inférieur d’une boîte de culture en plastique afin de créer une bosse pour faciliter le montage du ganglion ventral du cerveau larvaire après la dissection.

À l’aide d’un cure-dent, placez une petite goutte de superglue de chaque côté de la bosse et fixez une tige de tungstène à la colle. Ensuite, à l’aide d’un petit morceau d’adhésif réutilisable semblable à du mastic, faites une paroi circulaire autour de la bosse. Pour disséquer le cerveau larvaire, 90 à 120 heures après la ponte, prélevez les larves et lavez-les au moins trois fois avec de l’eau distillée pour éliminer les débris alimentaires adhérents.

Ensuite, placez une larve sur un verre de montre carré d’un pouce et demi rempli de PBS glacé. À l’aide d’une paire de pinces, saisissez doucement la partie centrale de la larve. Utilisez une autre paire de pinces pour saisir et tirer doucement les crochets buccaux afin de séparer la partie antérieure de la larve contenant le cerveau du reste du corps.

Ensuite, tenez l’extrémité antérieure avec la pince et retournez la larve. Retirez les tissus étrangers attachés au cerveau, tels que les disques imaginaux, les corps adipeux et la glande annulaire. Séparez doucement le cerveau des pièces buccales.

Ensuite, appliquez 200 microlitres de PBS à l’intérieur de l’anneau adhésif préparé plus tôt dans la chambre d’imagerie. Aspirez doucement le cerveau disséqué avec du PBS dans une pipette Pasteur et transférez-le dans la chambre d’imagerie. Dans la chambre d’imagerie, saisissez les fibres musculaires qui s’étendent des ganglions ventraux et insérez doucement le cerveau dans la bosse sous le fil de tungstène.

Ensuite, tirez légèrement le fil de tungstène vers le haut pour placer le cerveau à la bonne position pour l’imagerie. Pour acquérir des images par fluorescence calcique, placez la chambre d’imagerie contenant l’explant cérébral sous le microscope. Abaissez la lentille de l’objectif jusqu’à ce qu’elle touche le PBS et, sous un éclairage en champ clair, positionnez le cerveau et faites-le la mise au point.

Passez à la lumière fluorescente et ajustez la mise au point sur les cellules marquées GCaMP success. Démarrez l’acquisition à 250 ms/image, à une résolution de 512 x 512 pixels en mode refroidi à l’eau. Ensuite, ajustez le temps d’exposition pour obtenir les valeurs de fluorescence dans la plage dynamique de la caméra CCD, mais pas inférieures à 1000 unités arbitraires avec des images de 16 bits.

Une fois les paramètres d’imagerie déterminés, prenez les images pendant une minute avant l’administration du peptide pour détecter l’intensité du signal de base. Par la suite, appliquez directement le peptide d’essai, en pipetant 100 microlitres de la solution peptidique préparée dans le bain larvaire. Enregistrez l’émission de succès GCaMP pendant quelques minutes.

Pour analyser les données, ouvrez le logiciel d’analyse et utilisez la première image qui était avant l’application du peptide comme image de référence. Ensuite, sélectionnez Plugins, TurboReg. Choisissez le fichier d’image de série comme source et l’image de référence comme cible.

Ensuite, vérifiez Corps rigide et Précis pour la méthode de traitement et la qualité, respectivement. Ensuite, cliquez sur Lot pour démarrer le traitement de l’image. Sélectionnez plusieurs régions d’intérêt à l’aide d’Analyser, d’Outils, du Gestionnaire de retour sur investissement, dans la barre d’images.

Ensuite, mesurez l’intensité des pixels en cliquant sur Plus, Multi Mesure, OK, dans la fenêtre du Gestionnaire de retour sur investissement. Dans cette expérience, le cerveau de type sauvage a été exposé à la CCHa2, à la ghréline et à la nociceptine, tandis que le cerveau mutant du récepteur CCHa2 a été exposé à la CCHa2. Les signaux GCaMP6 dans les cellules productrices d’insuline ont été détectés par microscopie confocale à 250 ms/image, et voici les images fixes des points temporels sélectionnés.

Le rapport entre la variation de l’intensité du retour sur investissement et l’intensité du signal de référence à chaque point temporel a été tracé. Les retours d’intérêt étaient définis sur des corps cellulaires détectés dans le même plan focal. Les lignes pleines indiquent la moyenne de cinq à 10 échantillons, et les lignes pointillées indiquent les limites supérieure et inférieure de l’erreur-type de la moyenne.

Les zones ombrées indiquent la variation des signaux dans les expériences. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, si elle est correctement préformée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer rapidement l’échantillon de cerveau, pour éviter de l’endommager.

Cette procédure peut être combinée avec la génétique afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la spécificité des récepteurs. Le système utilisé dans ce protocole est facile à préparer et réutilisable. Ainsi, ce protocole sera utile, comme dans le dépistage.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’endocrinologie et des neurosciences pour explorer les réseaux hormonaux qui contrôlent le fonctionnement du cerveau chez la drosophile.