Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette
19 avril 2018
Nous présentons une méthode automatisée pour une reconstruction tridimensionnelle de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans . Notre méthode détermine le nombre et la position de chacun des noyaux dans les cellules germinales et l’analyses germline PROTÉINE distribution et la structure du cytosquelette.
L’objectif global de cette méthode est d’automatiser l’analyse d’une lignée germinale de Caenorhabditis elegans afin d’étudier ses noyaux, ses protéines et sa distribution cytosquelettique. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de C. Elegans sur le nombre de noyaux et de spermatozoïdes, la distribution nucléaire et la structure cytosquelettique de la lignée germinale. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle réduit le temps d’analyse, augmente la taille de l’échantillon et élimine l’erreur humaine associée à l’analyse manuelle.
Pour imager les échantillons, placez les lames avec des germlines colorées dans le support de lames au-dessus de l’objectif 63X d’un microscope confocal, et localisez une lignée germinale. Concentrez-vous sur le haut de la lignée germinale et marquez-la avec le logiciel du microscope confocal. Lorsque l’épaisseur totale de la lignée germinale a été établie, définissez l’épaisseur de chaque tranche jusqu’à 0,5 micromètre et marquez la lignée germinale complète.
Ensuite, lancez l’acquisition, en scannant chaque tranche huit fois et en faisant la moyenne des valeurs pour améliorer la qualité de l’image. Une fois toutes les images obtenues, importez-les dans un logiciel d’analyse d’images approprié et utilisez l’outil de fonction de surface pour sélectionner la région mitotique. Une image de l’extrémité distale de la lignée germinale apparaîtra.
Annulez l’assistant de création automatique de surface et dessinez manuellement une région d’intérêt autour de la région mitotique au niveau de la première et de la dernière tranche de l’image à partir de la pile tridimensionnelle. Cliquez sur Créer une surface, puis sur Masquer un canal pour masquer tous les canaux, à l’exception du canal DAPI. À l’aide de l’outil Fonction Spot, définissez les paramètres de taille de la région mitotique avec un diamètre XY de deux micromètres et avec le diamètre Z indéfini.
Cliquez sur Soustraire l’arrière-plan pour soustraire l’arrière-plan. Pour définir le seuil minimum, augmentez le seuil minimum de rendu 3D sur une lignée germinale de type sauvage colorée DAPI jusqu’à ce que la première tache apparaisse en dehors de la lignée germinale, puis générez un modèle 3D pour chaque région. Après avoir enregistré les images, cliquez sur le tableau pour afficher le nombre de noyaux, tel qu’il est généré automatiquement par le logiciel, et exportez les images sous forme de fichiers TIFF.
Pour la zone de transition, créez une surface comme expliqué précédemment. Ensuite, cliquez sur Masquer le canal pour masquer tous les canaux à l’exception du canal DAPI. À l’aide de la fonction spot, définissez un diamètre XY de deux micromètres et un diamètre Z de 1,5 micromètre, puis cliquez sur Soustraire l’arrière-plan pour soustraire l’arrière-plan.
Pour définir le seuil minimum, augmentez le seuil minimum de rendu 3D sur une lignée germinale de type sauvage colorée DAPI jusqu’à ce que la première tache apparaisse en dehors de la lignée germinale, puis générez un modèle 3D pour chaque région. Après avoir enregistré les images, cliquez sur le tableau pour afficher le nombre de noyaux, tel qu’il est généré automatiquement par le logiciel, et exportez les images sous forme de fichiers TIFF. Pour noter le nombre de spermatozoïdes, sélectionnez la spermathèque comme région d’intérêt, comme démontré pour les régions des noyaux, et utilisez l’outil de fonction ponctuelle pour définir le diamètre XY entre 0,75 et un micromètre avec un diamètre Z indéfini pour détecter chaque spermatozoïde.
Cochez la case Soustraire l’arrière-plan et utilisez les valeurs de correction d’arrière-plan calculées par le logiciel pour soustraire l’arrière-plan. Ensuite, ajustez le seuil de rendu 3D pour détecter tous les spermatozoïdes colorés au DAPI dans le spermathèque. Pour le comptage des chromosomes dans les ovocytes, sélectionnez les ovocytes et définissez le diamètre XY comme inférieur à 0,75 micromètre, et définissez le seuil avant de développer les modèles 3D.
Ensuite, enregistrez les images pour les exporter sous forme de fichiers TIFF. Pour la reconstruction germinale cytosquelettique, identifiez la région mitotique d’intérêt dans la lignée germinale et créez un masque de surface comme démontré précédemment. Cliquez sur Masquer les canaux pour masquer tous les canaux, à l’exception du canal phalloïdine, et utilisez l’outil de fonction de surface pour définir un détail de surface de 0,25 micromètre.
Après avoir soustrait l’arrière-plan, ajustez le seuil de rendu 3D pour enregistrer l’image 3D développée pour l’exportation sous forme de fichier TIFF. La distribution des noyaux dépend du stade de différenciation. Par exemple, au niveau de la région mitotique, l’actine interne apparaît comme une masse solide sur laquelle les noyaux sont organisés.
Dans une lignée germinale de type sauvage, la région mitotique contient environ 250 noyaux et est étroitement remplie de noyaux par rapport au reste de la lignée germinale. Cependant, à mesure que les noyaux s’éloignent de l’extrémité distale, ils apparaissent plus près de la circonférence de la lignée germinale, le changement de distribution commençant dans la zone de transition et se terminant lorsque les noyaux entrent dans la troisième étape de la prophase de la méiose. Au niveau de la zone de transition, l’actine interne de la lignée germinale prend une structure plus cylindrique, devenant un cylindre creux lorsqu’elle atteint le pachytène.
La deuxième couche d’actine recouvre la couche interne, donnant forme à la ligne germinale. Ce cylindre à l’intérieur d’une structure d’actine cylindrique disparaît vers la région de l’ovocyte, à ce moment-là, l’actine apparaît sous forme de fibres épaisses recouvrant les ovocytes. Dans la spermathèque, l’actine se forme également en épais faisceaux de fibres, bien que ces fibres semblent être plus serrées que dans la région de l’ovocyte.
Le rendu tridimensionnel de l’extrémité proximale de la lignée germinale, tel qu’il a été démontré, révèle une moyenne de 151 spermatozoïdes dans chaque spermathèque. Une fois maîtrisée, cette analyse peut être réalisée en 10 minutes par lignée germinale. Lors de cette tentative, il est important de ne pas oublier de définir les paramètres d’analyse en fonction du grossissement de l’objectif utilisé pour visualiser la lignée germinale dans votre expérience.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse automatique d’une lignée germinale, d’étudier la structure du cytosquelette et de noter le nombre de noyaux dans la lignée germinale.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente une méthode automatisée de reconstruction tridimensionnelle de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans, en se concentrant sur l'analyse des noyaux, de la distribution des protéines et de la structure du cytosquelette. Cette méthode vise à améliorer l'efficacité et la précision de l'analyse de la lignée germinale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie du développement
Contexte
- Comprendre la structure de la lignée germinale de C. elegans est essentiel pour les études du développement.
- L'analyse manuelle des échantillons de la lignée germinale est longue et sujette aux erreurs.
- Les méthodes automatisées peuvent simplifier ce processus.
- Les techniques antérieures manquaient d'efficacité pour analyser de grands volumes d'échantillons.
Objectif de l'étude
- Automatiser l'analyse de la lignée germinale de C. elegans.
- Déterminer précisément le nombre et la position des noyaux.
- Analyser la distribution des protéines et la structure du cytosquelette.
Méthodes utilisées
- Les échantillons sont colorés et placés sur des lames pour l'imagerie.
- Les lames sont positionnées au-dessus d'un objectif 63X d'un microscope confocal.
- La lignée germinale est localisée et marquée à l'aide du logiciel confocal.
- L'épaisseur de la lignée germinale est définie et divisée en sections de 0,5 micromètre.
Résultats principaux
- La méthode réduit considérablement le temps d'analyse.
- Elle augmente la taille de l'échantillon pouvant être analysé.
- L'erreur humaine associée à l'analyse manuelle est minimisée.
- Une cartographie précise de la distribution des noyaux et des protéines est obtenue.
Conclusions
- Cette méthode automatisée améliore l'étude de la lignée germinale de C. elegans.
- Elle offre une approche fiable pour analyser des structures biologiques complexes.
- La technique peut faciliter les recherches futures en biologie du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'analyse automatisée en trois dimensions de la lignée germinale de C. elegans permet un criblage phénotypique à haut débit pour la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce. En quantifiant la distribution des noyaux, la localisation des protéines et l'architecture du cytosquelette, cette méthode renforce la confiance prédictive dans les interventions génétiques et pharmacologiques. Cette approche réduit la variabilité manuelle et améliore la reproductibilité, facilitant ainsi le développement d'essais évolutifs pour des systèmes pertinents dans les maladies.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une cartographie quantitative des positions nucléaires et des profils d'expression protéique.
- Valeur opérationnelle : Facilite la réduction des risques biologiques en fournissant des lectures reproductibles de l'architecture de la lignée germinale dans différents fonds génétiques.
- Valeur prédictive : Renforce la validation des cibles en corrélant les modifications du cytosquelette avec les phénotypes développementaux, contribuant ainsi à l'identification de candidats thérapeutiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des sorties standardisées et quantitatives pour le nombre de noyaux, le nombre de spermatozoïdes et la structure du cytosquelette, permettant un criblage fiable de composés.
- Valeur opérationnelle : Augmente le débit et la reproductibilité du test grâce à l'acquisition et à l'analyse automatisées des images, réduisant ainsi les biais manuels.
- Extensibilité : Facilite la préparation de modèles de lignée germinale validés pour des flux de travail ultérieurs dans le cadre de campagnes de criblage phénotypique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la modélisation de systèmes pertinents pour les maladies en reliant les modifications structurelles germinales aux résultats fonctionnels dans le développement des cellules souches et l'apoptose.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Fournit des informations sur les exigences spatiales du développement par l'analyse de l'architecture du cytosquelette, contribuant à l'affinement des modèles précliniques.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des lectures phénotypiques cohérentes et basées sur des seuils, dans différentes conditions expérimentales.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification du composé candidat et l'évaluation préclinique, en fournissant des phénotypes germinaux standardisés et quantifiables.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant une visualisation tridimensionnelle de la distribution nucléaire et protéique dans des régions germinales distinctes.
- Écrans (screening) : Assure la préparation aux tests grâce à une quantification automatisée et reproductible des noyaux et des spermatozoïdes, permettant une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Produit des sorties statistiques telles que la densité nucléaire et les paramètres d'architecture du cytosquelette, permettant des comparaisons entre différentes conditions expérimentales et la sélection de candidats actifs.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes fondamentales à la continuité préclinique en associant les phénotypes structuraux de la lignée germinale à la dynamique des cellules souches et à la progression méiotique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme d'imagerie et d'analyse réutilisable, applicable à divers fonds génétiques et paradigmes expérimentaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive grâce à une quantification objective de l'architecture de la lignée germinale basée sur la 3D, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et l'évolutivité en minimisant les erreurs humaines et en permettant une analyse rapide (10 minutes par lignée germinale).
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en augmentant la taille des échantillons et en accélérant les décisions d'aller/arrêt dans les filières de validation ciblée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en fournissant des données phénotypiques reproductibles pour l'évaluation des composés leaders.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale et dans l'utilisation de logiciels d'analyse d'images 3D pour une segmentation précise de la lignée germinale et un réglage adéquat des seuils.
- Dépend de l'accès à un microscope confocal équipé d'un objectif 63X et possédant des capacités de marquage fluorescent pour le DAPI, la phalloïdine et les cibles protéiques.
- Exige une standardisation inter-équipes des paramètres d'acquisition d'images (épaisseur des coupes, moyennage, soustraction du fond) afin d'assurer la reproductibilité.
- Requiert l'adaptation des définitions des régions d'intérêt et des paramètres de détection des points lors de l'application à différents fonds génétiques ou protocoles de coloration.
- Les limites pratiques incluent la nécessité de protocoles de coloration et de montage optimisés pour préserver la structure de la lignée germinale et permettre une reconstruction 3D précise.
