Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de la technique combinatoire du système microfluidique et du domaine de la biotechnologie moléculaire, tels que les dispositifs microfluidiques et la méthode PCR d’asymétrie. Les principaux avantages de cette technique sont la production efficace de microsphériques hautement homogénéisés et la production d’ADN à brin unique sans aucune étape de séparation supplémentaire. Les implications de cette technique s’étendent vers le diagnostic ou la thérapie de diverses maladies.

Parce que la génération d’ADN à brin unique est la clé pour les analyses ap-ta-mo-sis, il peut être utilisé pour la détection et le traitement. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu du système microfluidique tridimensionnel dans MEMS, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes utilisés pour la détection et le traitement de la maladie. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal à contrôler correctement les fluides de s’écouler dans la direction inverse.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour observer la formation de microsphère dans la géométrie de focalisation du flux et la solidification des microsphériques générées. Tout d’abord, préparer 20 millilitres de prémère PDMS liquide en mélangeant le polymère de base et le catalyseur dans un rapport de 10 pour un. Verser 10 millilitres de PDMS liquide sur un moule SU-8 préparé sur une plaquette de silicium pour la partie supérieure du réseau microfluidique.

Pour la partie inférieure plate, versez le même volume de PDMS liquide sur la plaquette de silicium sans structure de moule. Déposer deux plaquettes de silicium recouvertes d’un prémère PDMS liquide sur une plaque chauffante préchauffée et les guérir à 75 degrés Celsius pendant 30 minutes. Par la suite, retirez manuellement la couche PDMS guérie du moule SU-8.

Alignez un outil rond de perforation de trou de 1,5 millimètre de diamètre au port pétrolier sur le réseau microfluidique répliqué pour l’interfaçage des canaux d’écoulement à l’échelle micron avec les échantillons macro-fluides. Puis frappez manuellement le trou à travers. Après avoir répété le processus de poinçonnage à trois reprises, effectuez un traitement de surface hydrophilique sur les couches supérieures et inférieures du PDMS à l’aide d’un traitement coronaire portatif pendant plusieurs secondes par échantillon.

Empilez deux couches PDMS traitées au plasma et chauffez à 90 degrés Celsius pendant 30 minutes sur une plaque chauffante pour le processus de liaison PDMS-PDMS. Vortex et brièvement centrifugeuse une sonde standard mono-échouée acrydite d’ADN-étiquetée et une solution de stock d’acrylamide bis 19-to-one. Préparez la solution une en mélangeant 25 microlitres de solution bis à 40 % d’acrylamide bis, 10 microlitres d’ADN unifaillé, 10 microlitres de tampon TBE 5X et cinq microlitres d’eau.

Préparez la solution deux avec 50 microlitres de 20% de persulfate d’ammonium. Préparez deux seringues remplies individuellement de la solution une et de la solution deux et montez-les sur la pompe à seringues pour introduire des flux de solution dans la plate-forme microfluidique. Préparer l’huile minérale mélangée avec 0,4% TEMED pour la solidification de surface de la microsphère.

Après avoir rempli une bouteille en verre avec l’huile minérale, insérez deux tubes dans les ports pneumatiques et fluides dans le bouchon de la bouteille en verre comme réservoir microfluidique. Connectez les tubes entre la bouteille en verre et le port d’huile dans le dispositif microfluidique. Connectez les tubes aux deux ports de solution de l’appareil microfluidique afin de fournir les deux solutions à partir des pompes à seringues.

Insérez ensuite les tubes au port de sortie afin de transférer la microsphère générée dans le bécher. Ensuite, réglez le débit de la pompe à seringues à 0,4 à 0,7 millilitres par heure. Réglez la pression d’air comprimé du compresseur à l’aide d’un régulateur.

Placez un bécher en verre avec une barre magnétique sur une plaque chauffante et réglez la vitesse de rotation. Actionner la pompe à seringues et fournir l’air comprimé généré par un compresseur externe dans la bouteille en verre en utilisant le contrôle on-off d’une valve électromagnétique. À l’aide d’un microscope numérique, observez la formation de microsphériques dans la géométrie de focalisation du flux et la solidification des microsphériques générées dans le bécher en verre.

L’observation de la formation de microsphériques est l’une des étapes les plus critiques car il s’agit d’un processus majeur dans cette étude pour produire des microsphériques et un système microfluidique. Par la suite, transférer 100 microlitres des microsphériques dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Retirez ensuite le supernatant par centrifugeuse douce et pipetting.

Resuspendez la cyanine-3 modifiée par sonde gratuite à l’aide de 100 microlitres de tampon 1X TE afin d’atteindre une concentration finale de 100 micromolaires. Ensuite, ajoutez 100 micromolaires de cyanine-3 modifiée par sonde complémentaire à un tube stérile de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant des microsphères copolymérisés AP. Appuyez sur le tube à quelques reprises pour mélanger et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure.

Après l’incubation, jeter le surnatant et retirer le tampon résiduel par pipetting. Rincez ensuite trois fois avec 500 microlitres de tampon TE. Déposer les microsphères sur une glissière en verre de 75 x 50 millimètres et couvrir de papier d’aluminium avant l’imagerie.

Obtenez environ 25 microsphériques grâce au comptage microscopique à l’aide d’un microscope léger avec grossissement 40X. Par la suite, combinez tous les reagents tels que décrits dans le protocole texte. Placez les échantillons dans un thermocycleur et démarrez le PCR asymétrique dans les conditions appropriées.

La collecte d’un supernatant après PCR asymétrique est l’une des étapes les plus critiques parce qu’il s’agit d’un processus majeur pour générer de l’ADN à brin unique avec des microsphère. Après amplification, ajouter huit microlitres de tampon de chargement 6X à chaque échantillon. Chargez 15 microlitres de chaque échantillon en gel agarose de 2 %.

Ensuite, effectuez l’électrophorèse à 100 volts pendant 35 minutes dans le tampon 1X TAE. Placez les microsphères hybridés dans un support et fixez le support au stade d’un microscope confocal. Sélectionnez le laser et allumez-le dans le contrôle laser.

Sélectionnez l’objectif dans le contrôle du microscope. Sélectionnez ensuite le filtre désiré pour la cyanine-3 et le canal dans le contrôle de configuration. Enfin, commencez l’expérience et observez l’échantillon.

La plate-forme microfluidique polymérique fabriquée à base de gouttelettes se compose de deux couches PDMS. Trois types de réseaux de canaux microfluidiques sont utilisés pour générer des microsphères, qui sont la géométrie focalisée sur le flux, un canal serpentin pour mélanger les solutions une et deux, et un canal de polymérisation pour la solidification des microsphères. Un système de contrôle pneumatique en laboratoire pour le flux continu de l’huile minérale et deux pompes à seringues pour le flux de solution ont été utilisés pour générer des microsphériques dans la plate-forme microfluidique.

Si les microsphères sont correctement fonctionnalisés avec la sonde d’ADN acrydite à cinq premiers, ils devraient entraîner une couverture de l’activité fluorescente à la surface pendant l’expérience d’hybridation comme le montrent ces images fluorescentes. Si la copolymérisation ne se produit pas correctement, l’image de la microsphère optique présenterait une contamination interne à l’intérieur des microsphériques. La manipulation de la surface 3D des microsphériques à l’aide d’une sonde oligo-oligo d’ADN est un processus beaucoup plus rapide et une plate-forme de synthèse de la microsphère à débit unique peut fournir un outil d’amplification et de purification de l’ADN à brin unique.

L’AP à cinq premiers initialement copolymérisé fournit une extrémité hydroxyle à trois premiers pour la polymérisation de l’ADN après annealing à son modèle complémentaire. Des contaminants d’ADN à double brin ont été observés dans l’expérience asymétrique de PCR. L’ADN mono-échoué résultant accumulé de PCR de microsphère a été démontré par comparaison aux marqueurs synthétiques de taille par l’analyse d’électrophoresis de gel.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que la connaissance préalable des protocoles et des ajustements qui sont généralement nécessaires pour optimiser les expériences PCR sont nécessaires pour obtenir le cycle d’amplification, la température d’annealage, et la séquence de sonde dans cette méthode. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du diagnostic et de la thérapie pour relier deux régions en biotechnologie moléculaire et en biomédecine. N’oubliez pas que travailler avec la solution d’acrylamide peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.