Name: Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Découvrez la microsphère-PCR en microfluidique pour produire de l'ADN monocaténaire sans étape de séparation. Cette méthode utilise des microsphères de polyacrylamide et offre des applications prometteuses en diagnostic moléculaire.

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Cette étude est soutenue par un projet intitulé « Programme coopératif recherche pour l’Agriculture Science & Technology Development (projet no PJ0011642) » financé par l’Administration du développement Rural, République de Corée. Cette recherche a été en partie financée par une subvention (FRO-2017R1A2B4012253) le programme de recherche scientifique fondamentale grâce à la Fondation de recherche National (NRF) financé par le ministère de la Science, TIC & planification Future, République de Corée. Cette recherche a été également soutenue par une subvention (N0000717) du programme d’enseignement pour les créatives et Convergence industrielle financé par le ministère du commerce, l’industrie et de l’énergie, République de Corée.

1. fabrication d’une plate-forme de microfluidique PDMS
<ol><li>Préparer 20 mL de liquide prépolymère de PDMS en mélangeant à base de polymères et de catalyseur dans un rapport de volume de 10:1. Verser 10 mL du liquide PDMS sur un moule de SU-8 préparé sur une plaquette de silicium pour la partie supérieure du réseau microfluidique. Pour la partie inférieure plate, versez le même volume de liquide PDMS sur la plaquette de silicium sans une structure de moule. Note : Le réseau microfluidique est conçu dans un programme de CAO et ensuite converti en un photomasque afin de fabriquer un maître en utilisant le procédé de photolithographie typique (voir Figures supplémentaires). Ce master est composé de la résine photosensible négative SU-8 moule sur la plaquette de silicium11.</li>
	<li>Placez les deux plaquettes de silicium recouverts de liquide prépolymère de PDMS sur la plaque chauffante et la guérison à 75 ° C pendant 30 min.<ol>
<li>Retirez manuellement la couche durcie de PDMS du moule SU-8. Aligner un diamètre de 1,5 mm ronde trou poinçonnant outil pour le port pétrolier sur le réseau microfluidique répliqué pour interfacer avec des canaux d’écoulement à l’échelle du micron avec les échantillons de liquide macro. Poinçonner manuellement l’à travers-trou.</li>
		<li>Répétez ce processus trois fois pour la formation de ces deux solutions et l’orifice de sortie de poinçonnage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer des traitements de surface hydrophile sur l’empeigne et les couches PDMS de fond à l’aide d’un traiteur de corona à main12 pendant plusieurs secondes par exemple.<ol>
<li>Empilez les deux couches PDMS de plasma-traités et chaleur à 90 ° C pendant 30 minutes à l’aide d’une plaque chauffante pour le processus de collage de PDMS-à-PDMS. Fournir de l’eau sous pression à l’aide de la seringue dans trois ports d’entrée pour le collage structural et des essais de fuite d’un appareil fabriqué.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. production de Polyacrylamide Oligo-microsphères
<ol><li>Préparer la perle-mélange détaillé dans le tableau 1.</li>
	<li>Vortex et brièvement Centrifuger l’acrydite standard ADNsb étiqueté sonde (Ap, 100 μM) et la solution mère d’acrylamide:bis (19:1).</li>
	<li>Préparer la solution j’en mélangeant 25 μL de 40 % d’acrylamide bis solution, 10 μL d’ADN simple brin (sonde d’acrydite), 10 μL de tampon de x TBE 5 (1,1 M Tris ; borate de 900 mM, 25 mM EDTA) et 5 μL d’eau. Préparer la solution II avec 50 μL de persulfate d’ammonium 20 %.</li>
	<li>Préparer les deux seringues individuellement rempli d’une solution solution II et j’ai et les monter sur la pompe d’introduire la solution flux dans la plate-forme de la microfluidique. Préparer l’huile minérale mélangée avec 0,4 % TEMED pour surface solidification de la microsphère. Remarque : Le TEMED est bien connu comme un stabilisateur de radicaux libres. Radicaux libres peut accélérer la vitesse de formation de polymère avec le persulfate d’ammonium (APS) pour catalyser la polymérisation de l’acrylamide.</li>
	<li>Remplissez une bouteille en verre avec 4 mL de l’huile minérale pour générer un flux continu.</li>
	<li>Insérer les deux tubes à deux ports dans le bouchon de la bouteille en verre comme un réservoir de microfluidique : le port pneumatique pour l’application de l’air comprimé dans la bouteille en verre le compresseur d’air et du port fluid pour l’approvisionnement de l’huile sous pression à la micro Channel de la bouteille en verre. Raccorder les tubes entre la bouteille et le port pétrolier dans le dispositif microfluidique.<ol>
<li>Raccorder les tubes vers les ports de deux solution dans le dispositif microfluidique afin d’approvisionner les deux solutions de pompes à la seringue. Introduire les tubes à l’orifice de sortie afin de transférer les microsphères généré dans le bécher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Régler le débit de la pompe à seringue à 0,4 - 0,7 mL/h. réglage air comprimé pression du compresseur à l’aide d’un régulateur (82-116 kPa). Régler la vitesse de rotation (500 tr/min) de la barre de l’agitateur magnétique dans le bécher en verre sur une plaque chauffante. Faire fonctionner la pompe de seringue et fournir de l’air comprimé généré par un compresseur externe dans la bouteille en verre à l’aide de la commande ON/OFF de l’électrovanne de13.</li>
	<li>Observez la formation des microsphères dans la géométrie d’écoulement de mise au point et la solidification des microsphères générés dans la carafe en verre avec un microscope numérique. Remarque : La vitesse de taille et de la production de la microsphère dépendent du débit des solutions et la pression exercée pour l’écoulement de l’huile minérale (tableau 2).
</li>
</ol>3. exécution de Polyacrylamide Oligo-microsphères compte
<ol><li>Pour la quantification hémocytomètre, prendre une petite quantité (environ 100 μL) de solution aqueuse de polyacrylamide oligo-microsphères et place sur le verre hémocytomètre et remplir doucement la suspension de microsphères le bien de la chambre de comptage. Remarque : Pour plus de détails, voir http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Utiliser un compteur de contrôle de microscope et de la main pour compter des microsphères dans un ensemble de 16 places. Ensuite, déplacez le hémocytomètre sur le jeu suivant de la chambre et continuer comptant jusqu'à ce que tous les quatre ensembles de 16 angles sont comptés.</li>
	<li>Déterminer le nombre moyen de microsphères et calculer le nombre des microsphères dans la suspension de perle originale.</li>
	<li>Transfert 100 μL de microsphères à un tube de microtubes de 1,5 mL. Retirez le surnageant par centrifugation (400 x g) doux et de pipetage.</li>
</ol>4. effectuer l’hybridation de l’ADN sur la Surface de Polyacrylamide Oligomicrosphere
Remarque : Une identique sonde d’ADN avec une 5'-NH2-groupe au lieu de 5'-acrytide modification est ajouté dans la solution j’ai et testé pour Ap-contenant des microsphères en parallèle. Résultats d’hybridation ADN sont indiquées à la Figure 2. La solution de sondes (PAC) de Cy3 marquée des oligonucléotides complémentaires doit être placée dans une pièce sombre.
<ol><li>Resuspendre Cy3-cAp à l’aide de 100 μL de tampon de 1xTE (tampon TE : 10 mM Tris et 1µm EDTA, pH 8,0) afin d’obtenir une concentration finale de 100 μM. Par exemple, remettre en suspension 1 pmol de PAC dans 100 mL de tampon TE puis transférez dans un tube de microcentrifuge recouvert de papier d’aluminium. Remarque : Pour les séquences de brin, voir le tableau 3.</li>
	<li>Ajouter 100 μM de Cy3-PAC dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL contenant des microsphères Ap-copolymérisé.</li>
	<li>Tapoter le tube plusieurs fois pour mélanger et incuber dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant et enlever le tampon résiduel par le biais de pipetage.</li>
	<li>Rincer trois fois à 500 μL de tampon de TE.</li>
	<li>Remettre en suspension les microsphères en tapotant doucement le tube de microcentrifuge. Ensuite, répétez l’étape 4.4.</li>
	<li>Placez des microsphères sur la lame de verre (75 x 50 mm) et le couvercle avec du papier d’aluminium avant de l’imagerie.</li>
</ol>5. asymétrique PCR pour amplifier l’ADN simple brin
<ol><li>Préparer un mélange de réactifs PCR asymétrique pour amplifier l’ADN simple brin à analyser. Décongeler les réactifs dans le tableau 4 sur la glace. Ne gardez pas l’enzyme polymérase de Taq (50 U/µL) sur la glace, mais plutôt conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.</li>
	<li>Vortex doucement tous les réactifs et centrifuger brièvement tubes à 10 000 g pendant 10 s.</li>
	<li>Combiner tous les réactifs comme décrit dans tableau 4.
</li>
	<li>Placer les échantillons dans un thermocycleur et commencer la PCR asymétrique dans les conditions suivantes : 25 cycles (95 ° C pendant 30 s, 52 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s), 85 ° C pendant 5 min, tenir à 4 ° C.</li>
</ol>6. microsphères-PCR pour amplifier l’ADN simple brin
Remarque : Cette section décrit le protocole pour amplifier l’ADN simple brin dans un tube de réaction PCR. Réactions de microsphères-PCR ont été effectuées dans 50 μL de volume réactionnel. Les séquences détaillées utilisées pour amplifier l’ADN simple brin sont répertoriés dans le tableau 5. Dans ce cas, Ap sur la surface des microsphères peut recuire à matrices aléatoires d’ADN de manière complémentaire. Il s’agit d’une étape très importante pour la production des brins complémentaires d’ADN (brin d’ADN antisens, Figure 3). L’étendue de l’ADN est utilisé comme modèle pour l’amplification PCR-microsphères.
<ol><li>Préparer le mélange réactif de microsphères-PCR. Décongeler les réactifs dans le tableau 6 sur la glace ; Toutefois, ne gardez pas l’enzyme polymérase de Taq sur la glace. Conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.</li>
	<li>Vortex doucement tous les réactifs et centrifuger brièvement tubes à 10 000 g pendant 10 s.</li>
	<li>Obtenir environ 25 ~ microsphères par comptage microscopique. Remarque : Le nombre des microsphères dans le tube à une réaction est calculé à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 40 X. Environ 25 ~ microsphères sont utilisées pour l’amplification PCR-microsphères. Informations plus détaillées sont à l’étape 3.</li>
	<li>Combiner tous les réactifs comme décrit dans tableau 6.
</li>
	<li>Placer les échantillons dans un thermocycleur et commencer la PCR asymétrique dans les conditions suivantes : 25 cycles (95 ° C pendant 30 s, 52 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s), 85 ° C pendant 5 min, tenir à 4 ° C.</li>
	<li>Amplification suivante, ajouter 8 μL de 6 x chargement tampon et charger 15 μL de chaque échantillon en gel d’agarose à 2 %. Effectuez ensuite, électrophorèse à 100 V pendant 35 min dans 1 x TAE (Tris-acétate-EDTA, 40 mM Tris acétate EDTA 1 mM, pH 8,2) tampon.</li>
</ol>7. confocal Microscopy Acquisition
Remarque : Les résultats de l’hybridation de sonde ADN-microsphères sont imagés sous un microscope confocal. Analyse des images est effectuée à l’aide de ImageJ.
<ol><li>Difficulté hybridées microsphères à l’étape du microscope dans un support.</li>
	<li>Sélectionnez le laser (laser hélium/néon, 543 nm ligne) et allumez-le en contrôle de laser.</li>
	<li>Sélectionnez l’objectif dans le contrôle de microscope.</li>
	<li>Sélectionnez le filtre souhaité pour Cy3 et canal dans le contrôle de configuration.</li>
	<li>Lancer le test et observer l’échantillon. Paramètres pour la microscopie confocale sont résumés au tableau 7.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Contaminants des ADN double brin sont un enjeu majeur pour l’amplification de l’ADN simple brin. Il reste difficile d’amplification ADN double brin dans les classiques de l’amplification PCR asymétrique15de minimiser. En outre, bien que des améliorations techniques pour générer des ADN simple brin nous ont permis d’accroître l’efficacité du débit de l’échantillon, isolement de l’ADN simple brin est toujours problématique en raison de ses coûts élevés et des rendements d’épuration incomplète.
<...

ADN simple brin (ssDNA) a été largement considéré comme un élément de reconnaissance moléculaire (MRE) en raison de ses propriétés intrinsèques d’hybridation de l’ADN1,2. Le développement de systèmes synthétiques ADNsb peut conduire à des applications biologiques telles que l’ADN microarrays3, oligotherapeutics, diagnostic et détection moléculaire intégrée basée sur des interactions complémentaires4,5.
A ce jour, les particules de polymère-l’échelle du micromètre ont fait leur preuve à l’aide de dispositifs microfluidiques. Plusieurs techniques de microfluidique sont est avérés pour être puissant pour produire des microsphères très homogènes sur le flux continu du microchannel environnement6,7.
Dans l’étude de Lee et al. 8, une plate-forme microfluidique axée sur les gouttelettes de synthèse microfluidique de polymérisables oligo-microsphères et ADNsb amplification a été signalé. La plate-forme microfluidique se compose de deux couches PDMS (diméthylsiloxane) : une partie supérieure avec un réseau de canaux microfluidiques pour générer des microsphères et un fond plat partie. Ceux-ci se composent de trois types de canaux fluidiques PDMS : 1) un débit en se concentrant channel pour la production de gouttelettes, 2) une chaîne serpentine pour mélanger les deux solutions et 3) un canal de polymérisation séquentiel pour la solidification de microsphères. Une fois que les deux flux non miscibles sont introduits dans un seul canal fluidique de PDMS, le flux peut être forcé à travers la structure de l’orifice étroit. Les comportements de flux tels que la géométrie du canal, débit et viscosité affectent la taille et la morphologie de la microsphère. Par conséquent, le flux de liquid principal peut être divisé en microscale monospheres9,10.
Ici, un protocole détaillé microsphères-PCR est fourni pour l’amplification de l’ADN simple brin. Tout d’abord, un processus de conception de dispositif microfluidique axée sur la gouttelette est décrite. Ensuite, la façon dans laquelle polyacrylamide microsphères peuvent être fonctionnalisés avec matrice aléatoire d’ADN de manière complémentaire est expliquée. Enfin, un protocole de microsphères-PCR pour amplifier l’ADN simple brin est montré.

<table><tbody><tr><td>polydiméthylsiloxane liquide, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Composants de la puce</td></tr><tr><td>40 % Acrylamide :bis solution (19:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>Composants de l’oligo-microsphère copolymérisable</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Durcisseur de l’acrylamide :bis</td></tr><tr><td>solution N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Catalyseur de persulfate d’ammonium</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tableau 1. Solution III. Composant des réactifs de microsphères</td></tr><tr><td>Cy3 sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées</td><td>Bioneer</td><td>synthétisées</td><td>Tableau 3. Informations sur la séquence&nbsp ;</td></tr><tr><td>sonde bio-synthétisée</td><td>Bioneer</td><td>synthétisée</td><td>Tableau 1. Solution I. Composant des réactifs de microsphère</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp ; T1016</td><td>Composants du tampon TE, solution tampon de pH</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Composants du tampon TE, élimination des ions (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>amplification de l’ADNs ss</td></tr><tr><td>Microscope confocal&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identification des oligonucléotides Exposition de la surface des microsphères</td></tr><tr><td>Microscope optique</td> Nikon <td>Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Nombre de microsphères</td></tr><tr><td>Thermocycleur T100</td><td>Amplification de</td><td></td><td>l’ADNs Bio-rad 1861096 ssTraiteur</td></tr><tr><td>Corona portatif</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Laboratoire Corona Treater</td><td>Traitement de surface hydrophile</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Comme une</td> plaque chauffante <td>HI-1000</td><td>pour le durcissement du liquide PDMS</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Débit uniforme de la solution I et de la solution II</td></tr><tr><td>Compresseur</td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Contrôle du débit de la solution III</td></tr><tr><td>Hémacytomètre à lignes brillantes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Nombre de microsphères</td></tr></tbody></table> de calcul

une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-pcr amplification d’adn monocaténaire amplicons

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Axée sur les gouttelettes microfluidics permettent la production fiable des microsphères homogènes dans le canal de la microfluidique, fournissant contrôlé de taille et de la morphologie de la microsphère obtenu. Une microsphère copolymérisé avec une sonde d’ADN-acrydite a été fabriqué avec succès. Différentes méthodes telles que la PCR asymétrique, digestion exonucléase et l’isolation sur streptavidine des billes magnétiques permet de synthétiser l’ADN simple brin (ADN simple brin). Cependant, ces méthodes ne peut pas utiliser efficacement de grandes quantités d’ADN simple brin hautement purifiée. Nous décrivons ici un protocole de PCR-microsphères détaillant comment ADNsb peut être efficacement amplifié et séparé du dsDNA simplement par pipetage à partir d’un tube de réaction PCR. L’amplification de l’ADN simple brin peut être appliquée comme réactifs possibles pour les biopuces et ADN-SELEX (évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel).

La plate-forme fabriqué polymériques axée sur les gouttelettes microfluidique se compose de deux couches PDMS (Figure 1 a). Trois types de réseaux de canaux microfluidiques sont utilisés pour générer des microsphères : géométrie 1) flux de mise au point comme illustré dans la Figure 1 bet 2) une chaîne serpentine pour mélanger la solution solution II et j’ai 3) un canal de polymérisation des microsphères solidification. La hauteu...

Cet ouvrage fournit une méthode pour la fabrication de plateformes microfluidiques axée sur la goutte et l’application des microsphères de polyacrylamide pour l’amplification PCR-microsphères. La méthode PCR-microsphères permet d’obtenir des amplicons ADN monocaténaire sans séparer l’ADN bicaténaire.

Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de la technique combinatoire du système microfluidique et du domaine de la biotechnologie moléculaire, tels que les dispositifs microfluidiques et la méthode PCR d’asymétrie. Les principaux avantages de cette technique sont la production efficace de microsphériques hautement homogénéisés et la production d’ADN à brin unique sans aucune étape de séparation supplémentaire. Les implications de cette technique s’étendent vers le diagnostic ou la thérapie de diverses maladies.Parce que la génération d’ADN à brin unique est la clé pour les analyses ap-ta-mo-sis, il peut être utilisé pour la détection et le traitement. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu du système microfluidique tridimensionnel dans MEMS, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes utilisés pour la détection et le traitement de la maladie. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal à contrôler correctement les fluides de s’écouler dans la direction inverse.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour observer la formation de microsphère dans la géométrie de focalisation du flux et la solidification des

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Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Dans cette vidéo, nous présentons une procédure étape par étape pour générer des nano-gouttelettes émulsionnées afin de détecter les acides nucléiques cibles par réaction en chaîne par polymérase numérique ou dPCR.

Réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes : une méthode pour générer des réactions PCR de nanogouttelettes pour détecter des mutations tumorales rares

Cette vidéo décrit la technique d’amplification de l’ADN simple brin à l’aide de microsphères polymères recouvertes d’oligonucléotides dans une réaction monotube. Ce processus produit de l’ADN simple brin pur, qui peut être utilisé pour le séquençage de l’ADN et l’analyse des microréseaux.

Réaction en chaîne par polymérase de microsphères pour amplifier l’ADN simple brin

Cette vidéo présente la technique d’amplification en chaîne par polymérase multiplex pour la quantification simultanée de régions d’ADN méthylées dans différentes populations de globules blancs en tant que biomarqueur précoce pour le diagnostic clinique et le pronostic.

Réaction en chaîne par polymérase multiplex pour détecter la méthylation de l’ADN dans les leucocytes

Cette vidéo démontre l’utilité de la PCR numérique dans un format de puce dans un tube pour la détection de variations nucléotidiques uniques dans des échantillons d’ADN. Une seule réaction PCR est répartie dans des chambres qui agissent comme des réactions PCR indépendantes, et la détection des signaux de fluorescence des cibles amplifiées dans les chambres est utilisée pour calculer la fréquence de l’allèle variant dans l’échantillon.

PCR numérique basée sur une puce dans un tube pour la quantification de variants nucléotidiques uniques

Nous décrivons un test numérique final pour quantifier les acides nucléiques avec une lecture simplifiée (analogique). Nous mesurons la fluorescence massive de tests numériques basés sur des gouttelettes à l’aide d’une machine qPCR standard plutôt que d’une instrumentation spécialisée et confirmons nos résultats par microscopie.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Unicellulaire séquençage révèle une hétérogénéité génotypique dans les systèmes biologiques, mais les technologies actuelles n’ont pas le débit nécessaire pour la détermination des caractéristiques profondes de la fonction et la composition de la communauté. Nous décrivons ici un "workflow" microfluidique pour séquençage &gt; 50 000 unicellulaires génomes de diverses populations de cellules.

Une plate-forme de Microfluidic ultra haute capacité pour le séquençage du génome de cellules individuelles

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier avec précision les multiples altérations génétiques d’une région cible en une seule réaction à l’aide de Drop-off ddPCR et une paire de sondes d’hydrolyse.

Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.

Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.

Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Les tests de gouttelettes eau-dans-huile sont utiles pour la chimie analytique, l’évolution enzymatique et l’analyse unicellulaire, mais nécessitent généralement une microfluidique pour former les gouttelettes. Ici, nous décrivons l’émulsification à gabarit de particules, une approche sans microfluidique pour effectuer des tests de gouttelettes.

L’émulsification par gabarit de particules permet des tests de gouttelettes sans microfluidique

Découvrez la microsphère-PCR en microfluidique pour produire de l'ADN monocaténaire sans étape de séparation. Cette méthode utilise des microsphères de polyacrylamide et offre des applications prometteuses en diagnostic moléculaire.

Une approche fondée sur les gouttelettes de microfluidique et microsphères-PCR Amplification d’ADN monocaténaire Amplicons

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