Faire induite par la conjugaison Fluorescent pégylé Pseudo-particules virales de chimie Dibromomaleimide-disulfure
27 mai 2018
Nous présentons ici une procédure pour fonctionnaliser fluorescent les disulfures sur Qβ VLP avec dibromomaleimide. Nous décrivons Qβ expression et purification, la synthèse de molécules dibromomaleimide fonctionnalisés et la réaction de conjugaison entre dibromomaleimide et Qβ. La particule de conjugué fluorescente jaune qui en résulte peut être utilisée comme une sonde de fluorescence à l’intérieur des cellules.
L'objectif général de cette méthode de bio-conjugaison est de fonctionnaliser de manière fluorescente des particules de type viral contenant des ponts disulfure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la réaction de bio-conjugaison appliquée à des particules de type viral qui possèdent un nombre limité de résidus d'acides aminés pouvant être fonctionnalisés. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'au moyen d'une seule réaction, de nouveaux groupes fonctionnels peuvent être introduits tout en formant simultanément des fluorophores induits par la conjugaison. En plus du Q-Bêta, nous pensons que cette réaction peut être appliquée à n'importe quelle particule de type viral possédant des liaisons disulfure.
Avant de commencer la procédure d'expression du bactériophage Q-Beta, nettoyer la surface de travail avec une solution d'eau de Javel : éthanol à 1:1. Dans un environnement aseptique, préparer deux cultures initiales de trois millilitres en ajoutant des colonies isolées d’E.coli BL21 dans du milieu SOB. Faire croître les cultures pendant une nuit dans une enceinte à 37 degrés Celsius et 0 % d'humidité relative, sous agitation à 250 tr/min. Le jour suivant, retirer les deux cultures initiales de trois millilitres du agitateur et, dans un environnement aseptique, verser chaque culture dans un flacon Erlenmeyer de deux litres à collerettes contenant un litre de milieu SOB frais. Placer les deux flacons contenant le milieu ensemencé sur un agitateur à 250 tr/min, dans la pièce à 37 degrés Celsius et 0 % d'humidité relative. Faire croître les bactéries jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité optique à 600 nanomètres (DO600) comprise entre 0,9 et 1,0. Cette étape prend généralement environ cinq heures. Lorsque les cultures atteignent la DO600 souhaitée, utiliser une pipette P1000 pour ajouter un millilitre d'IPTG à un molaire dans chaque flacon afin d'induire l'expression protéique. Laisser les flacons en agitation dans la pièce tiède pendant toute la nuit.
Le lendemain matin, retirez les flacons de l'agitateurs, transférez le contenu de chaque flacon dans une bouteille d'un litre et centrifugez à 20 621 ×g à quatre degrés Celsius pendant une heure afin de récolter les cellules. Une fois la centrifugation terminée, jetez le surnageant en le versant dans un flacon contenant environ cinq millilitres d'eau de Javel pour tuer les bactéries.
Pour recueillir le culot cellulaire, utilisez une spatule pour racler le culot cellulaire du fond du flacon d'ultracentrifugation et transférez le culot dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.
Pour commencer la procédure de purification du Q-Bêta, re-suspendre chaque culot cellulaire dans 20 à 30 millilitres de tampon phosphate de potassium 0,1 molaire, pH 7. S'assurer que la suspension ne contient aucun grumeau. Lysér les cellules à l'aide d'un microfluidiseur selon le protocole du fabricant. Lysér les cellules au moins deux fois afin d'augmenter le rendement en particules. Transférer les lysats dans des flacons de centrifugation de 250 millilitres et centrifuger à 20 621 ×g à quatre degrés Celsius pendant une heure. Mesurer le volume du surnageant en millilitres. Multiplier cette valeur par 0,265, puis ajouter au surnageant cette quantité en grammes de sulfate d'ammonium. Ajouter une barrette magnétique et agiter sur un agitateur magnétique à 200 tr/min à quatre degrés Celsius pendant au moins une heure afin de précipiter les protéines. Centrifuger dans des flacons de 250 millilitres à 20 621 ×g à quatre degrés Celsius pendant une heure. Jeter le surnageant et re-suspendre le culot dans environ 40 millilitres de tampon phosphate de potassium 0,1 molaire, pH 7. Ajouter au prélèvement brut des volumes égaux de mélange chloroforme : n-butanol (1:1) et mélanger par vortex pendant quelques secondes. Transférer le mélange dans un tube de 38 millilitres. Centrifuger à 20 621 ×g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Utiliser une pipette pour récupérer la phase aqueuse supérieure. Prendre garde de ne pas prélever la couche gélatineuse formée entre les phases aqueuse et organique.
Ensuite, décongeler les gradients de saccharose préparés de 65 à 40 %. Charger environ deux millilitres de l'extrait sur chaque gradient.
Ultra-centrifuger à 99 582 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant 16 heures avec décélération libre. Une fois l'ultra-centrifugation terminée, diriger la lumière d'une diode électroluminescente sous chaque tube pour confirmer la présence d'une bande bleue. Utiliser une seringue munie d'une aiguille longue pour récupérer ces particules. Ultra-centrifuger à nouveau les particules à 370 541 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant 2,5 heures. Le culot résultant de particules purifiées doit être transparent. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans un tampon de phosphate de potassium 0,1 molaire, pH 7.
Ce schéma illustre la conjugaison qui sera démontrée. Dix équivalents de tris(2-carboxyéthyl)phosphine ou TCEP par rapport aux disulfures dans un milligramme de Q-Beta sont utilisés pour réduire tous les disulfures et générer les capsides de Q-Beta réduites, à température ambiante pendant une heure. Juste avant la réduction des disulfures sur Q-Beta, préparez une solution fraîche de TCEP.
Dissoudre 0,002 gramme de TCEP et un millilitre d'eau ultra-pure pour préparer une solution mère 100X. Ajouter 200 microlitres de Q-Beta à cinq milligrammes par millilitre dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, ajouter 20 microlitres de la solution mère de TCEP 100X dans le tube de microcentrifugation. Incuber une heure à température ambiante.
Entre-temps, préparez la solution de polyéthylène glycol dibromo-maléimide ou DB-PEG pour la réaction ultérieure de re-formation des ponts disulfure réduits. Dissolvez 0,0017 gramme de DB-PEG dans 100 microlitres de diméthylformamide. Ajoutez 680 microlitres de solution de phosphate de sodium 10 millimolaire, pH 5. Ensuite, ajoutez le Q-Beta réduit dans la solution de DB-PEG et observez le processus de mélange sous une lampe UV portative de 365 nanomètres. Dès le mélange, une fluorescence jaune vif doit devenir immédiatement visible. Laissez la réaction se dérouler à température ambiante sur un agitateur rotatif pendant toute la nuit.
Le lendemain matin, purifiez le mélange réactionnel à l’aide d’un filtre centrifuge en utilisant du PBS 1X à 3 283 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Enfin, surveillez la conjugaison par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS en conditions non réductrices et par électrophorèse sur gel d’agarose native.
La conjugaison de DB-PEG sur Q-Beta a été confirmée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS non réducteur sous UV et coloration au bleu de Coomassie. Toutes les bandes fluorescentes co-localisaient avec la coloration au bleu de Coomassie, indiquant une conjugaison réussie. L'intégrité des conjugués Q-Beta-PEG a été confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose natif et microscopie électronique en transmission.
La micrographie supérieure montre le Q-Beta-maleimide ou Q-Beta-M et la micrographie inférieure montre le Q-Beta-PEG. La spectroscopie de fluorescence du Q-Beta-M et du Q-Beta-PEG dans un tampon phosphate de potassium à 0,1 molaire a révélé un maximum d'excitation aux alentours de 400 nanomètres et un maximum d'émission entre 540 et 550 nanomètres. Lorsque le Q-Beta-PEG a été incubé avec des cellules de macrophages de souris dans un milieu DMEM sans sérum, suivi d'une coloration nucléaire, les images de co-localisation montrent que des particules fluorescentes jaunes ont été internalisées par les cellules et peuvent être suivies après quatre heures d'incubation.
En revanche, les particules pseudovirales Q-Beta non fonctionnalisées présentent une fluorescence négligeable.
Ce protocole peut aider les chercheurs à purifier le Q-Bêta en quatre jours et à réaliser la réaction de conjugaison par re-formation des ponts disulfure pendant la nuit. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler que la réaction de conjugaison fonctionne mieux en conditions acides, comme à un pH de 5.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment purifier les VLP de Q-Bêta et reformer les ponts disulfure à l’aide de composés dibromo-maléimides afin d’obtenir des VLP marqués de manière fluorescente. Depuis son développement, cette technique a fourni aux chercheurs une poignée fonctionnelle supplémentaire qui peut être utilisée pour doublement fonctionnaliser la surface externe du bactériophage Q-Bêta.
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Aperçu
Cet article présente une méthode de bioconjugaison permettant de fonctionnaliser de manière fluorescente des particules pseudovirales contenant des groupes disulfures, spécifiquement les VLP Qβ. Cette technique permet d'introduire de nouveaux groupes fonctionnels et de former des fluorophores induits par conjugaison en une seule réaction.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Bio-conjugaison
- Particules pseudo-virales
- Marquage fluorescent
Contexte
- Les liaisons disulfure dans les particules de type viral limitent les options de fonctionnalisation.
- Les sondes fluorescentes sont essentielles pour les études cellulaires.
- Le bactériophage Qβ sert de modèle pour cette méthode.
- Les techniques aseptiques sont cruciales pour la réussite des expériences.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour fonctionnaliser les disulfures sur les particules pseudovirales Qβ.
- Permettre l'étude des réactions de bio-conjugaison dans les particules pseudovirales.
- Créer des sondes fluorescentes pour des applications cellulaires.
Méthodes utilisées
- Expression et purification du bactériophage Qβ.
- Synthèse de molécules fonctionnalisées par la dibromomaléimide.
- Réaction de conjugaison entre la dibromomaléimide et Qβ.
- Utilisation de techniques aseptiques lors de la préparation de la culture initiatrice.
Résultats principaux
- Functionalisation fluorescente réussie de VLPs Qβ.
- Formation de particules conjuguées fluorescentes de couleur jaune.
- Application potentielle de la méthode à d'autres particules de type viral.
- Démonstration d'une réaction unique introduisant plusieurs groupes fonctionnels.
Conclusions
- La méthode permet d'étiqueter efficacement par fluorescence des particules de type viral contenant des ponts disulfure.
- Cette technique peut améliorer l'étude de la bio-conjugaison en virologie.
- Des applications futures pourraient s'étendre à diverses particules de type viral possédant des liaisons disulfure.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une double fonctionnalisation de particules de type viral en introduisant des ligands synthétiques et en générant une fluorescence intrinsèque en une seule étape, répondant ainsi au nombre limité d'options de bioconjugaison disponibles sur les VLP riches en ponts disulfure. Les sondes fluorescentes obtenues permettent des études d'absorption cellulaire et un suivi en temps réel in vitro, améliorant ainsi les validations ciblées et les flux de travail de développement d'essais. En élargissant l'éventail d'outils chimiques pour la modification des VLP, cette technique renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte et réduit les ambiguïtés mécanistiques dans la recherche sur la délivrance de charges utiles.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques par la fonctionnalisation spécifique de liaisons disulfure exposées au solvant sur les particules virales pseudotypées (VLPs).
- Valeur opérationnelle : Combine l'attachement de ligands et la génération de fluorophores en une seule réaction, simplifiant ainsi la synthèse de sondes pour les études d'interaction cible.
- Valeur prédictive : Génère des VLPs fluorescents traçables qui permettent des essais d'internalisation cellulaire et la modélisation de la biodistribution.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Produit des lots normalisés de particules pseudovirales marquées par fluorescence, adaptés au criblage à haut débit et aux dosages d'interaction.
- Valeur opérationnelle : Utilise des jeux de filtres disponibles dans le commerce (excitation ~400 nm, émission 540–550 nm) permettant une détection facile sans instrumentation personnalisée.
- Extensibilité : Permet la préparation de bibliothèques de sondes pour des études de relations structure-activité dans les interactions ligand-récepteur.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Les particules pseudovirales fluorescentes démontrent une internalisation cellulaire dans des modèles de macrophages, soutenant l'analyse de la biodistribution et des profils pharmacocinétiques.
- Réduction des risques : Permet l'évaluation des modifications de surface sur la stabilité des particules pseudovirales et leur reconnaissance immunitaire avant les études in vivo.
- Alignement sur les biomarqueurs : Facilite la corrélation de la localisation des particules pseudovirales avec des marqueurs cellulaires dans des protocoles d'imagerie de co-localisation.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la production de particules pseudovirales (VLP) à l'identification de candidats prometteurs, permettant la génération rapide de sondes fonctionnalisées pour des criblages en aval et des études mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant une double modification des particules pseudovirales (VLP) avec des entités de traçage et des entités thérapeutiques.
- Criblage : Génère des particules pseudovirales fluorescentes standardisées pour des tests quantitatifs d'interaction et d'internalisation.
- Analytique : Fournit des signaux de détection basés sur la fluorescence afin de quantifier les interactions entre les particules pseudovirales et les cellules, ainsi que l'efficacité de la conjugaison.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques grâce à l'évaluation démontrée de l'absorption par les macrophages et de la stabilité.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme modulaire de fonctionnalisation des particules pseudovirales, applicable à divers systèmes contenant des ponts disulfure.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation de la cible en permettant l'utilisation de sondes VLP précises et traçables pour les études de mécanisme d'action.
- Valeur opérationnelle : Standardise la conjugaison dans des conditions acides définies (pH 5) afin de garantir la reproductibilité entre les lots.
- Valeur stratégique : Réduit la nécessité d'étapes distinctes d'étiquetage et de purification, améliorant ainsi l'efficacité du capital dans le développement de sondes.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en fournissant des données fonctionnelles précoces sur les constructions basées sur des VLP.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans l'expression protéique, la purification et la manipulation anaérobie des protéines contenant des ponts disulfure.
- Nécessite un accès aux microfluidiseurs, aux ultracentrifugeuses et aux systèmes de détection de fluorescence équipés de jeux de filtres appropriés.
- Exige une technique aseptique et une vigilance quant à la présence d'endotoxines dans les applications cellulaires.
- Une optimisation peut être nécessaire lors de l'application à des particules pseudovirales (VLPs) présentant une accessibilité variable des ponts disulfure ou une charge de surface différente.
- Limite pratique : l'efficacité dépend du maintien de conditions réductrices durant la reformation des ponts disulfure et de l'éviction d'une dégradation oxydative.
